Молекулярное типирование уропатогенных штаммов Escherichia сoli, выделенных у пациентов с использованием метода REP-ПЦР 71

Инфекции мочевыводящих путей (ИМП) — это наиболее распространенные бактериальные инфекции, которые чаще встречаются у женщин всех возрастных групп и характеризуются бактериальной колонизацией мочевой системы. Штаммы уропатогенных Escherichia coli (E. coli) — наиболее распространенные инфекционные агенты, которые выявляются при ИМП, и их источником часто становится флора кишечника. Наиболее распространенный симптом ИМП — дизурия, форма которой может быть умеренной или тяжелой [1, 2]. Помимо наиболее распространенных симптомов инфекций нижних мочевыводящих путей пациенты с заболеваниями верхних отделов этих путей или пиелонефритом могут испытывать почечные колики, повышение температуры или тошноту и рвоту [1]. Доля E. coli в структуре всех ИМП составляет 80–90%; в остальных случаях возбудителями являются Staphylococcus saprophyticus, Citrobacter, Klebsiella, и Enterobacter [3]. E. coli образует пурпурные колонии на культуральной среде Мак-Конки, так как это лактозоположительная бактерия, которая ферментирует сахарозу, образуя кислоту. Этот же процесс происходит на культуральной среде ЭМС (агар с эозином и метиленовым синим), в которой E. coli образует темно-пурпурные колонии с зеленым металлическим блеском. Условно-патогенные разновидности E. coli в составе нормальной флоры кишечника обычно безопасны для организма и вызывают заболевание только у пациентов с ослабленным иммунитетом. Однако некоторые виды E. coli — это потенциальные высокопатогенные микроорганизмы, которые становятся возбудителями заболевания при приобретении свойств вирулентности [4].

При различных заболеваниях человека, вызванных E. coli, патогенные бактерии общепринято подразделять на две основные категории: диареегенные E. coli и внекишечные патогенные E. coli, которые представлены двумя основными патогенами, уропатогенными E. coli и E. coli менингита новорожденных. Внекишечные бактерии могут образовывать колонии различной локализации и вызывать инфекционные воспаления вне желудочно-кишечного тракта, при этом чаще всего возбудитель поражает мочевыводящие пути [5, 6]. Уропатогенные E. coli кодируют различные адгезивные структуры, так называемые пили и фимбрии, такие как F1C, S, P, и семейство адгезивных белков Dr [7]. Фимбрии играют важную роль в прикреплении бактерий на слизистой оболочке пищеварительного тракта, влагалища и уретры. Другие факторы, такие как бактериальные липополисахариды, капсулы, гемолизин и сидерофоры, усиливают вирулентность уропатогенных E. coli [8–10]. Один штамм таких бактерий может содержать несколько различных типов пилей и изменять один тип на другой в зависимости от условий окружающей среды. Добравшись до мочевыводящих путей, уропатогенные E. coliсвязываются в первую очередь с эпителиальными клетками организма, используя пили и фимбрии, чтобы избежать вымывания потоком мочи [11].

Молекулярное типирование применяется для выявления нозокомиальных инфекций и их источников, а также выделения специфических генотипов при конъюгации с конкретной бактерией. Этот метод расширяет границы наших знаний о принципах эпидемиологии, эволюции и распространения многих бактериальных заболеваний [12–15]. Повторяющаяся экстрагенная палиндромная последовательность (REP), первоначально обнаруженная в Salmonella typhimurium и E. coli, является повторяющейся последовательностью 39 п. н. и может повторяться до 282 раз в геноме E. coli. По всей вероятности, эти последовательности регулируют экспрессию генов посредством контролирования стабильности мРНК [16]. Метод REP-ПЦР основывается на том, что области, расположенные между повторяющимися сегментами, имеют различные размеры, поэтому создают различные паттерны при ПЦР и электрофорезе и штаммы можно легко дифференцировать и распознать, сравнив эти паттерны [17].

Преимущество данного метода заключается в отсутствии необходимости знания целевой последовательности синтеза праймеров для большинства бактерий. Из-за высокой воспроизводимости и дифференциальных возможностей такая технология в настоящее время считается оптимальным методом эпидемиологического исследования большинства бактерий наряду с градиентным электрофорезом в пульсирующем поле. Таким образом, технология REP-ПЦР — это быстрый доступный полуавтоматизированный способ молекулярного типирования, основанный на ПЦР, не сложный в применении для молекулярного технолога с некоторым опытом [18].

Бесспорным преимуществом технологии REP-ПЦР является то, что данный метод можно использовать для изучения многих грамотрицательных и некоторых грамположительных бактерий при отсутствии какой-либо информации о бактериальном геноме [19]. Кроме того, он надежен по сравнению с неточными и трудоемкими фенотипическими и биохимическими методами. Его преимущества — это легкость и быстрота осуществления, высокая дифференциальная точность, а также возможность применения в любой лаборатории. REP-ПЦР можно использовать с биомаркерами, такими как (GTG)5, REP1R-I и REP2R-I [20].

Цель исследования — определить молекулярные типы уропатогенных E. coli как одного из основных возбудителей инфекций мочевыводящих путей методом REP-ПЦР с использованием праймера REP1R.

Материалы и методы. Данное перекрестное исследование выполнялось в 2014 г. с участием пациентов с ИМП, поступивших в стационар Бакияталлах в Тегеране. Исследование проведено в соответствии с Хельсинкской декларацией, принятой в июне 1964 г. (Хельсинки, Финляндия) и пересмотренной в октябре 2000 г. (Эдинбург, Шотландия), и одобрено Baqiyatallah University of Medical Sciences. От каждого пациента получено информированное согласие.

Образцы культивировали на хромогенной агаровой культуральной среде и выдерживали в термостате в течение 24 ч. Если вырастали фиолетовые колонии, присутствие E. coli подтверждалось путем пересева колонии на агаровую среду ЭМС и культивирования в инкубаторе при 37°C в течение 18 ч. Колонии с зеленым металлическим блеском указывали на присутствие E. coli и подвергались дальнейшему изучению. Проводили пересев всех колоний из культуральной среды ЭМС на среду, обогащенную бульоном Лурия–Бертани, и выдерживали во встряхивающем инкубаторе в течение 18–24 ч. Затем очищали ДНК методом выварки. Полученный геномный раствор использовали непосредственно для ПЦР или хранили при 4°C для последующих тестов. Для длительного хранения полученный раствор следует хранить при –20°C, так как ДНК может подвергаться кислотному гидролизу.

После контроля чистоты ДНК с использованием анализатора NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, США) и подтверждения ее пригодности для проведения ПЦР извлеченную ДНК подготавливали к ПЦР. Реакционная смесь содержала 1 мкл матричной ДНК, 2 мкл праймера REP1R, 1 мкл MgCl2, 6 мкл деионизированной дистиллированной воды и 10 мкл основной смеси (мастер-микс) в суммарном объеме 20 мкл. Амплификацию ПЦР выполняли в градиентном термоциклере Эппендорфа (Eppendorf, Германия), она состояла из первоначальной денатурации при 95°C в течение 7 мин и последующих 32 циклов, включающих денатурацию (1 мин при 95°C), отжиг (1 мин при 41°C), элонгацию (3 мин при 65°C) и фазу окончательной элонгации в течение 16 мин при 65°C. Для визуализации продуктов амплификации ПЦР 5 мкл полученного в итоге раствора смешивали с 1 мкл загрузочного буфера и выполняли электрофорез на 1,5% агарозном геле при напряжении 90 В в течение 70 мин. «Лестница» ДНК длиной 100 п. н. использовалась в качестве молекулярного стандарта для контроля соответствующих участков REP. Гель окрашивали бромидом этидия в течение 12 мин, и участки становились видимыми при ультрафиолетовом свете. Полосы REP-PCR были выражены в виде 0 и 1 для обозначения отсутствия и присутствия полос соответственно. Матрицу из цифр 0 и 1 выполнили в Excel и построили соответствующую дендрограмму, используя веб-сайт компьютерного моделирования.

Результаты. В настоящем исследовании в общей сложности было изучено 100 штаммов E. coli, выделенных у пациентов с ИМП. Из них 98 штаммов оказались типируемыми и 2 — нетипируемыми. Семнадцать полос в пределах от 100 до 3100 п. н. были амплифицированы в различных профилях (см. рисунок). Анализ дендрограммы показал, что изоляты разделяются путем REP-ПЦР на 7 REP-групп (R1–R7) с идентичностью в 70%. Из 100 пациентов с ИМП в данном исследовании 79 были женщины и 21 — мужчины, и подобное преобладание отмечалось в различных возрастных группах. Следует отметить, что анализ процентного соотношения женщин и среднего возраста пациентов с точки зрения выделения штаммов показал, что самый высокий процент женщин и самое низкое значение среднего возраста были в REP-группе R5 (табл. 1).

---

Профиль продуктов ПЦР некоторых об­разцов, колонка L — размер маркера

---

Таблица 1. Средний возраст и процент женщин в каждой REP-группе

---

Обсуждение. Уропатогенные E. Coli являются преобладающими бактериями, вызывающими ИМП, особенно у женщин. ИМП — одно из инфекционных заболеваний человека, на распространение которого влияют пол и возраст [2, 21]. REP-ПЦР выявляет структуры ДНК и фактически позволяет дифференцировать разновидности бактерий [22–23], делая данный метод актуальным для типирования различных микрооганизмов [23]. Некодирующие рассеянные повторяющиеся последовательности преобладают среди грамотрицательных бактерий [24]. Предыдущие исследования с применением REP-ПЦР показали наличие повторяющихся элементов ДНК в E. coli. Четыре случая ИМП из 100 изученных образцов в нашем исследовании отмечались у новорожденных девочек. Фактически ИМП среди новорожденных встречается в 0,1 случая. На протяжении первых двух месяцев жизни ИМП чаще отмечается среди мальчиков, но начиная со 2-го месяца жизни и во взрослом возрасте ИМП более распространены среди женщин. Однако из 100 изученных образцов ни один не принадлежал младенцу с ИМП мужского пола. Пять случаев инфекции были замечены среди девочек возрастом от одного до десяти лет, причина заболевания — короткая уретра, несоблюдение режима личной гигиены и несвоевременное опорожнение мочевого пузыря. У мальчиков обрезание снижает риск ИМП. Риск данного заболевания также снижается в пубертатном периоде. В нашем исследовании только два случая инфекции наблюдались среди девочек-подростков. Частота возникновения ИМП существенно возрастает среди молодых женщин из-за сексуальных отношений, беременности или применения противозачаточных средств. В данном исследовании зарегистрировано 22 случая ИМП в возрастном диапазоне 20–25 лет. После менопаузы число ИМП может возрасти из-за дефицита эстрогенов.

С учетом информации о полиморфизме ДНК мы изучили полиморфизм штаммов E. coli с использованием праймера REP1R, который обеспечивает достаточную точность дифференциации полиморфизмов разновидностей с высокой степенью сходства. Вследствие высокой точности дифференциации согласно дендрограмме изоляты были распределены по 7 группам со сходством структуры генома на 70% (табл. 2). В соответствии с выполненным распределением по кластерам наибольшее количество штаммов было обнаружено в группе R4 (22 штамма), а наименьшее — в группе R3 (7 штаммов). Группа R4 состояла из 22 штаммов и была самой большой группой изолятов, а штаммы 65 и 95, 57 и 60, 58 и 59 обладали сходством структуры генома более чем на 70%. Штаммы 65 и 95 в группе R4 обладали идентичной структурой генома, принадлежали одному и тому же человеку и содержались в пробах, взятых в разное время, указывая на рецидивирующую инфекцию, вызванную штаммом. Данные результаты демонстрируют точность метода. В группе R5 (21 штамм) штаммы 73 и 74 обладали сходством структуры генома более чем на 70%, и между штаммами 41, 43, 44, 45 и 46 в группе R7 (17 штаммов) также отмечалось сходство более чем на 70%. В группах R1 (12 штаммов), R2 (8 штаммов), R3 (7 штаммов) — группы с наименьшей популяцией и в группе R6 (11 штаммов) не отмечалось сходства структуры генома.

---

Таблица 2. Число типируемых штаммов в каждой REP-группе

---

Полоса 100 п. н. была самой частой полосой и наблюдалась в 90% штаммов, а полосы 700 и 800 п. н. отмечались поочередно среди изолятов. Примечательно, что анализ процентного соотношения женщин и среднего возраста пациентов с точки зрения штаммов показал, что из всех групп самый высокий процент женщин и самое низкое значение среднего возраста было в группе R5. Сравнение данных антибиограммы с данными дендрограммы позволило получить примечательные результаты. Все образцы в группе R2 были стойкими к ампициллину и чувствительными к нитрофурантоину, все образцы в группе R3 — чувствительны к нитрофурантоину, большинство образцов в группе R5 — чувствительны или получувствительны к амикацину и все образцы в группе R6 — чувствительны к нитрофурантоину.

Высокая частота возникновения ИМП обусловливает необходимость определения в данном исследовании чувствительности и относительной резистентности болезнетворных бактерий к антибиотикам. Правильное использование антибиотиков и идентификация устойчивости бактерий, выделенных при ИМП, могут играть важную роль в лечении заболевания и его опасных последствий. Метод REP-ПЦР уже используется для оценки резистентности E. coli к антибиотикам. Например, M. Rashid и соавт. [25] применили этот метод для изучения резистентности бета-лактамаз расширенного спектра к бета-лактамным антибиотикам и определения их продуцентов на уровне генотипа. Ранее метод нашел широкое применение в диагностических целях. Так, S.L. McLellan и соавт. [26] с использованием молекулярного метода REP-ПЦР изучили E. coli, выделенные из проб, взятых в источниках фекального загрязнения, и определили генетические отношения между штаммами в каждой группе носителей. Исследование показало, что молекулярный метод REP-ПЦР более точен и эффективен, чем ДНК-фингерпринтинг (метод генетических «отпечатков пальцев») E. coli фекалий животного или человека. Многие другие зарубежные исследования различных штаммов E. coli также проводились с применением данного метода. В Иране число подобных исследований пока ограничено. ИМП — типичная проблема среди женского населения, и потребуются дальнейшие исследования с большим объемом выборки для ее эффективного решения, при этом следует принять во внимание роль других факторов, влияющих на развитие данного заболевания.

Заключение. Результаты настоящего исследования показали, что REP-ПЦР — надежный метод классификации, молекулярного генотипирования и определения филогенетических взаимоотношений между близкородственными разновидностями микроорганизмов и даже между отдельными (не смешивающимися с другими видами) бактериальными разновидностями. Использование этого метода с высокой точностью позволило определить, что бактерии E. coli, изученные в данном исследовании, состоят из различных отдельных клонов, и тем самым выявить разнообразие бактерий у обследованных пациентов.

Научный вклад авторов в исследование. Все авторы в равной мере принимали участие в данной работе. Все авторы перечитали и утвердили окончательный вариант рукописи.

Конфликт интересов. Конфликты интересов, связанные с данным исследованием, отсутствуют.