Использование показателей свободнорадикального окисления в ротовой жидкости в качестве маркеров функционального состояния спортсменов

Поиск новых эффективных методов и средств оперативной диагностики функционального состояния организма спортсмена в период интенсивных физических нагрузок является одним из приоритетных направлений научных исследований в спортивной медицине. Доминирующее значение в современных условиях в общем комплексе медико-биологических обследований и инструментального контроля уровня физической подготовленности занимает биохимический скрининг. Анализ показателей биохимического гомеостаза позволяет на ранней стадии диагностировать признаки физического переутомления, обнаруживать микроповреждения тканей, функциональные и структурные сдвиги адаптационных процессов под влиянием физических нагрузок и с учетом изменения этих показателей корректировать многоуровневую систему подготовки спортсменов.

Объектами биохимических исследований, как правило, являются кровь, выдыхаемый воздух, моча, реже — выделения потовых желез и ротовая жидкость. Однако выполнение забора крови в условиях учебно-тренировочного процесса предусматривает присутствие квалифицированного персонала ввиду строгой необходимости соблюдения всех предусмотренных мер защиты, что в случае перманентного биохимического контроля в процессе спортивной подготовки довольно затруднительно. Вместе с тем забор крови нередко приводит к нестабильности психологического состояния обследуемых, что может существенно искажать исследуемые показатели. Особую значимость при проведении указанных процедур несет в себе факт ужесточения требований антидопингового контроля. Так, WADA отнесены к перечню запрещенных любые формы внутрисосудистых и иных манипуляций с кровью или ее компонентами физическими или химическими методами [1]. Сложившаяся ситуация обусловливает необходимость поиска других неинвазивных методов диагностики с высокой степенью доступности, специфичности и чувствительности.

В последнее время в качестве информативной биологической среды организма при проведении неинвазивного биохимического скрининга эксперты и ученые все чаще рассматривают ротовую жидкость. Известно, что ротовая жидкость обеспечивает взаимосвязь организма с внешней и внутренней средой [2]. В ее состав входят органические и неорганические компоненты из слюнных желез, сыворотки крови и тканей полости рта [3]. Все это создает хорошие возможности изучения биохимических показателей метаболизма в ротовой жидкости при проведении скрининговых обследований спортсменов.

В научной литературе достаточно подробно описано изменение в ротовой жидкости атлетов минерального баланса, спектра стероидных гормонов, содержания компонентов иммунной системы, активности некоторых ферментов, концентрации важнейших продуктов метаболизма, колебания кислотно-щелочного равновесия [4–8]. Однако работ, посвященных исследованию процессов свободнорадикального окисления, а также изучению содержания первичных и конечных продуктов перекисного окисления липидов в ротовой жидкости высококвалифицированных спортсменов в качестве диагностических маркеров состояния окислительного стресса и негативных последствий его изменения на организм при выполнении физических нагрузок разного типа, нами не обнаружено. В то же время знание этих показателей играет большую роль в оценке состояния спортсменов, повергающихся сильному стрессу.

Цель исследования — изучить эффективность определения показателей свободнорадикального и перекисного процессов в ротовой жидкости у высоко­квалифицированных спортсменов при анаэробной интервальной физической нагрузке для оценки их функционального состояния.

Материалы и методы. В исследовании приняли участие 23 представителя циклических видов спорта (легкая атлетика, плавание), имеющих спортивное звание мастера спорта России или спортивный разряд кандидата в мастера спорта. Средний возраст спортсменов составил 18,7±0,6 года. В соответствии с принципами Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации все испытуемые были предварительно проинформированы о цели и методике проведения исследования и дали добровольное согласие на участие в эксперименте.

Забор образцов ротовой жидкости осуществляли путем сплевывания в пластиковую микроцентрифужную пробирку типа Эппендорф объемом 2 мл без дополнительной стимуляции. Тестирование спортсменов осуществляли до и после выполнения контрольного испытания, которое было представлено в виде серии отрезков 3×100 м гладким бегом с активным отдыхом между ними в течение 45 с — для легкоатлетов и 4×50 м основным стилем плавания с активным отдыхом между отрезками также 45 с — для пловцов. Во время проведения контрольного испытания собранные образцы ротовой жидкости хранились в портативной морозильной камере (Ezetil, Германия) при температуре –18°С и затем транспортировались в лабораторию для проведения биохимического исследования.

Потенциальную интенсивность свободнорадикального процесса и уровень его компенсаторных механизмов в ротовой жидкости измеряли с помощью программно-методического комплекса биохемилюминесцентного анализа БХЛ-07 (ООО «Медозонс», Н. Новгород) методом индуцированной биохемилюминесценции [9]. Содержание первичных продуктов перекисного окисления липидов — диеновых конъюгатов (ДК), триеновых конъюгатов (ТК) и конечных — оснований Шиффа (ОШ) в ротовой жидкости определяли на спектрофотометре СФ-2000 («ОКБ СПЕКТР», С.-Петербург) по методу И.А. Волчегорского в модификации [10]. Определение концентрации креатинина, лактата, глюкозы и свободных жирных кислот в ротовой жидкости проводили с помощью набора реагентов Vital («Витал Девелопмент Корпорейшн», Россия) и NEFA FS DiaSys (DiaSys, Германия) на биохимическом анализаторе StatFax 1904 Plus (Awareness Technology, США) энзиматическим колориметрическим методом. Определение общей активности креатинкиназы и лактатдегидрогеназы выполняли с использованием набора реагентов СК-NAC DiaS и LDH DiaS DGKC (DiaSys, Германия) соответственно на биохимическом анализаторе Clima MC-15 (RAL, Испания) энзиматическим кинетическим методом в диапазоне 1–1100 МЕ/л для креатинкиназы и оптимизированным кинетическим УФ-методом в диапазоне 5–1200 МЕ/л для лактатдегидрогеназы.

Статистический анализ полученных данных выполнен с использованием программных приложений Microsoft Excel 2013 и Statistica 13.0. Полученные результаты представлены в виде среднего арифметического значения и стандартной ошибки среднего (M±m). Проверку распределения на предмет соответствия нормальному закону выполняли путем вычисления критерия Шапиро–Уилка. После выяснения, что не по всем изучаемым параметрам вид распределения полученных данных соответствует нормальному, последующий анализ на предмет наличия статистически значимых различий проводили с применением критерия Вилкоксона.

Результаты и обсуждение. В соответствии с разработанной программой исследования с целью определения доминирующего механизма энергообразования при выполнении предъявленного контрольного испытания изучена динамика изменений биологической активности основных ферментов и субстратов креатинфосфокиназного и лактацидного механизмов ресинтеза АТФ в ротовой жидкости. Так, активность лактатдегидрогеназы, катализирующей взаимопревращение пировиноградной и молочной кислот как одну из важнейших реакций анаэробного гликолиза, в ответ на предъявленную физическую нагрузку статистически значимо повысилась на 41,74% (табл. 1).

Таблица 1. Активность креатинкиназы и лактатдегидрогеназы в ротовой жидкости высококвалифицированных спортсменов (M±m)

Известно, что при интенсивной мышечной деятельности продолжительного характера покрытие энерготрат организма происходит преимущественно за счет гликолитического механизма ресинтеза АТФ, характерной особенностью которого, в случае дефицита кислорода, является рост активности лактатдегидрогеназы с соответствующим повышением концентрации молочной кислоты в тканях [11]. После выполнения контрольного испытания содержание лактата в ротовой жидкости испытуемых статистически значимо увеличилось на 31,25% (табл. 2).

Таблица 2. Концентрация креатинина и лактата в ротовой жидкости высококвалифицированных спортсменов (M±m)

Лактат, влияя на Na⁺/H⁺ и Na⁺/Ca²⁺ обмен в клетке, стимулирует снижение внутриклеточного и внеклеточного pH, что сопровождается нарушением функционирования многих энзимных систем, в том числе снижением интенсивности тканевого дыхания, уменьшением содержания в клетках АТФ и креатинфосфата, а также менее активной мобилизацией нейтральных липидов из жировых депо посредством ингибирования липаз. По всей вероятности, развитие лактатемии обусловило отсутствие существенных динамических изменений активности креатинкиназы, концентрации креатинина, глюкозы и свободных жирных кислот в ротовой жидкости спортсменов до и после выполнения контрольного испытания (табл. 3).

Таблица 3. Содержание глюкозы и свободных жирных кислот в ротовой жидкости высококвалифицированных спортсменов (M±m)

Исследование влияния анаэробной интервальной физической нагрузки на состояние системы «перекисное окисление липидов–антиоксидантная защита» в ротовой жидкости показало статистически значимое снижение всех параметров кривой хемилюминесцентной реакции по сравнению с данными, полученными в состоянии покоя (табл. 4).

Таблица 4. Параметры биохемилюминограммы ротовой жидкости высококвалифицированных спортсменов (M±m)

Так, индексы биохемилюминограммы S и Imax статистически значимо уменьшились — на 22,29 и 14,73% соответственно. При этом, несмотря на более низкую потенциальную способность к свободнорадикальному окислению, содержание ТК и ОШ в ротовой жидкости в постнагрузочном состоянии было статистически значимо выше на 40,01 и 89,23% (табл. 5).

Таблица 5. Содержание продуктов перекисного окисления липидов в ротовой жидкости высококвалифицированных спортсменов (M±m)

Полученные результаты убедительно свидетельствуют об интенсификации развития оксидативного стресса при выполнении предъявленной физической нагрузки, который сопровождается низкой степенью реактивности звеньев системы антиоксидантной защиты. После выполнения контрольного испытания показатель, характеризующий направленность цепных реакций свободнорадикального окисления липидов, статистически значимо увеличился на 49,94% в сторону существенного преобладания ОШ в ротовой жидкости испытуемых. По-видимому, гипоксическое состояние, вызванное несоответствием кислородного запроса его текущему потреблению при выполнении контрольного испытания, через стимуляцию симпатико-адреналовой системы инициировало интенсивное образование реакционно-активных форм кислорода с последующим каскадным ростом свободнорадикальных и перекисных процессов в тканях. Согласно данным [12], патологические последствия для метаболического фона в организме, в частности угнетение активности гликолиза и окислительного фосфорилирования, ингибирование синтеза белка и нуклеиновых кислот, нарушение различных ферментативных процессов, возникают прежде всего в случае неспособности собственной антиоксидантной системы обеспечить поддержание прооксидантно-антиоксидантного равновесия в границах физиологической нормы, что в итоге и приводит к избыточному аккумулированию токсичных продуктов липопероксидации и повреждению мембранных структур — от изменения проницаемости и барьерной функции мембран до лизиса и апоптоза клетки. Нарушение прооксидантно-антиоксидантного баланса в сторону существенного преобладания конечных продуктов окислительной модификации макромолекул является одним из факторов, лимитирующих физическую работоспособность и усиливающих риск развития преморбидных и патологических состояний у спортсменов.

Заключение. Изучение показателей свободнорадикального окисления, а также содержания первичных и конечных продуктов перекисного окисления липидов является доступным высокоинформативным способом исследования функционального состояния, адаптационных механизмов и резервных возможностей спортсменов на всех этапах учебно-тренировочного и соревновательного процессов.

Финансирование исследования. Исследование не финансировалось какими-либо источниками.

Конфликт интресов. У авторов нет конфликта интересов.