Лабораторные маркеры поражения печени при хроническом гепатите C

Несмотря на накопленный к настоящему времени значительный опыт лечения пациентов с хроническим гепатитом С (ХГС), абсолютно очевидны серьезные проблемы, которые связаны с данной инфекцией: высокая частота формирования хронических форм, длительное бессимптомное течение, манифестация заболевания на поздних стадиях (цирроз печени), четкая ассоциация с развитием гепатоцеллюлярной карциномы. Хроническая ХГС-инфекция способна инициировать процессы фиброзообразования в печени и способствовать развитию через 20–30 лет цирроза у 20–45% пациентов и гепатоцеллюлярной карциномы у 5–15% больных [1–4].

Основной задачей при определении тактики ведения пациентов с ХГС является оценка степени некровоспалительных изменений и стадии фиброза в ткани печени. «Золотым стандартом» диагностики ХГС служит пункционная биопсия печени, позволяющая установить степень активности воспаления и выраженность фиброза. Как и всякий инвазивный метод, биопсия требует исполнения правил ее проведения в специализированных учреждениях и квалифицированного персонала для интерпретации результатов, поскольку всегда существует риск развития целого ряда осложнений [1, 5]. Сегодня широко изучаются возможности неинвазивной оценки и мониторинга фиброза в печени. Опубликовано много работ, в которых приводятся данные о диагностической значимости сывороточных маркеров фиброза, позволяющих оценить не только стадию ХГС, но и активность фиброгенеза в печени, таких как гиалуроновая кислота (ГК), коллаген 1V типа [6]. Установлена значительная корреляционная связь III и IV стадий фиброза с уровнем ГК [7–9]. Предложены различные индексы, основанные на соотношении ряда клинико-биохимических показателей: FibroTest и FibroMether (Франция), APRI (США) и ряд других, разработан метод эластографии печени [10–12].

В последнее время многие исследования посвящены определению цитокинового статуса при ХГС. Так, по мнению авторов [13–15], повышенные сывороточные уровни провоспалительных цитокинов соответствуют высокой степени воспаления и фибротических изменений в печеночной ткани.

К сожалению, существующие технологии неинвазивной диагностики фиброза в печени не всегда позволяют разграничить стадии ХГС в начальном периоде заболевания, что обусловлено отсутствием существенных различий, и большую диагностическую значимость имеют при тяжелом фиброзе и циррозе. Комбинация эластографии и лабораторных тестов повышает точность оценки стадии фиброза [16].

Учитывая тот факт, что прогрессирование ХГС и механизм развития фиброза в печени обусловлены многогранностью морфологической реакции печени на повреждение (стеатоз, пигментные отложения, тромбоз, апоптоз, некроз, адаптация, пролиферация гепатоцитов и собственно фиброзные изменения [17]), нам представилось интересным провести комплексное изучение лабораторных маркеров различных патогенетических механизмов, принимающих участие в прогрессировании ХГС.

Цель исследования — оценить возможность использования данных совместного изучения биохимических тестов, гиалуроновой кислоты, альфа-фетопротеина, малонового диальдегида, каталазы, цитокинов и лептина для определения тяжести поражения печени (стадий фиброза и цирроза) у пациентов с хроническим гепатитом С.

Материалы и методы. В исследование были включены 100 пациентов (48 мужчин и 52 женщины) с ХГС в фазе реактивации. Работа осуществлялась на базе инфекционного отделения №2 Пермской краевой клинической инфекционной больницы. Средний возраст больных составил 39,5±10,2 года. Сопоставимая по полу и возрасту контрольная группа включала 30 практически здоровых лиц.

Исследование проведено в соответствии с Хельсинкской декларацией, принятой в июне 1964 г. (Хельсинки, Финляндия) и пересмотренной в октябре 2000 г. (Эдинбург, Шотландия), и одобрено Этическим комитетом Пермского государственного медицинского университета им. академика Е.А. Вагнера Минздрава России. От каждого пациента получено информированное согласие на участие в исследовании.

У пациентов с ХГС рассчитывали индекс массы тела (ИМТ). Диагноз ХГС устанавливали на основании комплекса данных клинико-лабораторного и инструментального обследования. Плотность печени и стадию фиброза определяли методом ультразвуковой эластографии (УЗЭ) на аппарате FibroSkan 502 (Echosens, Франция). Выявление и количественное определение РНК вируса гепатита С проводили методом полимеразной цепной реакции на амплификаторе Real-time CFХ96 (Bio-Rad Laboratories, США) с использованием набора ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск).

Оценку биохимических параметров сыворотки крови выполняли на биохимическом анализаторе Architect c4000 (Abbott Laboratories, США) с применением одноименных наборов для определения аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (АСТ) (Abbott Clinical Chemistry; Abbott Laboratories, США) и альбумина набором «Альбумин-Ново» (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск). Количество тромбоцитов оценивали на автоматическом гематологическом анализаторе Medonic М20 (Boule Medical AB, Швеция).

В сыворотке крови обследуемых лиц с ХГС методом иммуноферментного анализа на фотометре Stat Fax 2100 (Awareness Technology, США) исследовали концентрацию ГК с помощью набора ВСМ Diagnostics (США), фактора некроза опухоли-α (ФНО-α) и васкулоэндотелиального фактора роста (ВЭФР) с использованием одноименных наборов ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск), лептина набором DSL(ACTIV, США). В качестве теста регенерации гепатоцитов оценивали уровень альфа-фетопротеина (АФП) иммунохемилюминесцентным методом с помощью набора AFP на анализаторе Immulitе-1000 (Siemens, Германия). Концентрацию малонового диальдегида (МДА) в сыворотке крови определяли по методу Ю.В. Владимирова, А.В. Арчакова (1972). Активность фермента каталазы исследовали фотометрически по методу М.А. Королюк (1988).

Статистическую обработку полученных данных выполняли с использованием программы Statistica 6.0 (StatSoft). Результаты представлены в виде среднего и стандартного отклонения (М±σ). Статистическую значимость различий средних определяли по критерию Манна–Уитни. Количественную оценку линейной связи между двумя независимыми величинами проводили с использованием коэффициента ранговой корреляции по Спирмену (r). Различия между выборками считали статистически значимыми при р<0,05.

Результаты и обсуждение. У больных ХГС ИМТ не имел статистически значимых отличий от значений группы контроля (р=0,81), хотя у 11% из 100 обследованных отмечалось превышение нормального ИМТ, соответствующее избыточной массе тела, а у 4% пациентов наблюдались признаки абдоминального ожирения. В целом в группе больных ХГС по данным УЗЭ плотность печени в среднем составила 9,6±9,5 (от 3,1 до 63,9) кПа. Низкая вирусная нагрузка регистрировалась у 31% больных ХГС, высокая — у 69%. По данным лабораторных тестов, в группе обследованных лиц с ХГС в фазе реактивации были статистически значимо повышены уровни трансаминаз АЛТ и АСТ, что свидетельствует о наличии у больных синдрома цитолиза (р<0,001 и р<0,001). Сывороточный уровень альбумина не имел достоверных отличий от группы контроля (р=0,76), хотя у 18% обследованных регистрировалась гипоальбуминемия. Снижение количества тромбоцитов наблюдалось у 16% (р=0,04).

При исследовании уровня прямого лабораторного маркера фиброза печени — ГК в сыворотке крови — обнаружено статистически значимое повышение ее значений в среднем в 2,2 раза у 50% больных (р=0,01). Маркер регенерации гепатоцитов АФП у 21% пациентов с ХГС был повышен практически в 2,5 раза (р=0,02). У 80% больных отмечена активация процессов перекисного окисления липидов, что проявлялось в статистически значимом увеличении концентрации МДА в 4 раза по сравнению с группой контроля (р<0,001). При исследовании антиоксидантного фермента каталазы у пациентов с ХГС выявлено снижение ее активности в 1,6 раза (р<0,001). По результатам иммуноферментного анализа установлено повышение сывороточных концентраций ВЭФР в 4 раза у 82% и ФНО-α — в 11 раз у 85% больных ХГС (р<0,001). Гиперлептинемия наблюдалась у 13% больных (р=0,001). Данные сравнительного анализа исследуемых показателей у больных ХГС и в группе контроля представлены в табл. 1.

---

Таблица 1. Исследуемые показатели сыворотки крови у больных хроническим гепатитом С в контрольной группе и при хроническом гепатите С в зависимости от наличия цитолиза (M±σ)

---

Таким образом, реактивация ХГС сопровождается увеличением вирусной нагрузки, нарастанием некровоспалительных изменений в печени, снижением уровня альбумина и количества тромбоцитов, активацией иммуновоспалительных процессов и перекисного окисления липидов при сопутствующем истощении антиоксидантной защиты, усилением процессов неоангиогенеза и фиброгенеза в печени с активацией регенерации гепатоцитов, что согласуется с результатами, полученными в других исследованиях [7–9, 13–15, 18, 19], где эти показатели изучали по отдельности.

На следующем этапе исследования для сравнения изучаемых факторов при ХГС в зависимости от наличия синдрома цитолиза все больные были разделены на две подгруппы. Подгруппу без цитолиза с нормальными значениями трансаминаз в сыворотке крови составили 32 человека со средним возрастом 43,6±10,9 года, подгруппу с цитолизом — 68 человек в возрасте 36,4±9,2 года (р=0,004) (см. табл. 1). Было установлено, что в зависимости от наличия цитолитического синдрома при ХГС у пациентов с повышенными уровнями трансаминаз регистрируются более высокие значения ИМТ (р=0,02), уровня вирусной нагрузки (р=0,01), значимо повышенные концентрации АФП (р=0,03) и провоспалительного цитокина ФНО-α (р=0,01). Полученные данные свидетельствуют об ассоциации цитолиза с более молодым возрастом, усилением репликативной активности вируса, активацией иммуновоспалительных механизмов и регенерации гепатоцитов. При этом в данной подгруппе больных ХГС отмечено статистически значимое снижение количества тромбоцитов (р=0,04) и активности антиоксидантного фермента каталазы (р=0,04) в сравнении с пациентами с нормальным сывороточным уровнем трансаминаз (т.е. в подгруппе без цитолиза), что указывает на наличие зависимости биологических эффектов этих параметров от концентрации маркеров цитолиза. Полученные результаты позволяют полагать, что повышение вирусной нагрузки, АФП и ФНО-α, а также снижение активности каталазы и количества тромбоцитов способствуют усугублению прогрессирующего характера некровоспалительных изменений в печени, а их сывороточная концентрация у больных ХГС отражает тяжесть повреждения ткани печени, что дает возможность использования этих факторов в качестве дополнительных маркеров для оценки активности процесса.

На третьем этапе исследования нам представлялось интересным определить концентрацию изучаемых факторов у больных ХГС в зависимости от стадии фиброза печени (табл. 2).

---

Таблица 2. Исследуемые показатели сыворотки крови (M±σ) у больных хроническим гепатитом С в зависимости от стадии фиброза печени (F)

---

Из табл. 2 видно, что концентрация исследуемых факторов в сыворотке крови больных ХГС по большей части менялась в ту или иную сторону по мере прогрессирования фиброза в печени. Начальный и умеренный фиброз (FI–II) при ХГС от стадии F0 позволяют дифференцировать следующие параметры крови: уровень вирусной нагрузки (р=0,01), количество тромбоцитов (р=0,01), уровень ГК (р=0,002) и концентрация ВЭФР (р=0,03) и ФНО-α (р=0,01).

Выраженный фиброз печени (FIII) от умеренного (FI–II) у больных ХГС позволяют диагностировать такие параметры: возраст (р=0,03), ИМТ (р=0,02), повышенные уровни АЛТ (р=0,02), АСТ (р=0,02), ГК (р=0,02), АФП (р=0,04), ВЭФР (р=0,01) и ФНО-α (р=0,03) в сыворотке крови при пониженных значениях альбумина (р=0,01), каталазы (р=0,03) и количества тромбоцитов (р=0,002).

Стадию цирроза (FIV) при ХГС позволяет стратифицировать, а также дифференцировать от выраженного фиброза (FIII) изменение следующих лабораторных показателей: увеличение уровня вирусной нагрузки (р=0,01), снижение альбумина (р=0,01), значительное повышение ГК (р=0,01), АФП (р=0,03), МДА (р=0,02), ФНО-α (р=0,03) и лептина (р=0,02).

Таким образом, сывороточные маркеры ГК и ФНО-α позволяют стратифицировать все стадии фиброза в печени при ХГС, что подтверждается их прямыми значимыми корреляциями с плотностью печени по данным УЗЭ (r=0,42; р=0,001 и r=0,41; р=0,001 соответственно). Наиболее выраженное повышение уровня АФП, ВЭФР и МДА при одновременном снижении синтеза альбумина, активности каталазы и уровня тромбоцитов наблюдается на стадиях тяжелого фиброза. Это подтверждается наличием прямых достоверных взаимосвязей со значениями плотности печени для АФП (r=0,43; р=0,001) и ВЭФР (r=0,40; р=0,001) и обратных — для альбумина (r=–0,59; р=0,001) и тромбоцитов (r=–0,56; р=0,001).

Полученные результаты и выявленные корреляционные закономерности позволяют утверждать, что сывороточные концентрации ГК и ФНО-α у больных ХГС отражают тяжесть поражения печени и могут использоваться для стратификации стадий фиброза печени. Эти данные в определенной степени согласуются с результатами других авторов, подтвердивших соответствие повышенного уровня ГК и ФНО-α в крови степени фиброза в печеночной ткани [7–9, 13–15]. По данным Н.Д. Ющук с соавт. [7], диагностическая эффективность определения ГК для разграничения стадии FIII при хроническом гепатите от FIV при циррозе печени имеет чувствительность 100% и специфичность 84,6%. По данным Ю.В. Лобзина c cоавт. [8] определение ГК в сыворотке крови позволяет дифференцировать только тяжелый фиброз и цирроз (70,7±11,7 и 258,2±95,7 нг/мл при р<0,01), тогда как между FII и FIII статистически значимые различия отсутствуют.

Заключение. Прогрессирование ХГС и фиброгенеза в печени сопровождается активизацией процессов патологической регенерации гепатоцитов и неоангиогенеза, усилением ПОЛ и истощением антиоксидантной защиты, повышением активности воспаления, метаболическими нарушениями и характеризуется увеличением содержания в крови ГК, АФП, МДА, ВЭФР, ФНО-α и лептина с одновременным уменьшением синтеза альбумина, количества тромбоцитов и снижением активности каталазы. Сывороточные концентрации ГК и ФНО-α у больных ХГС отражают степень повреждения ткани печени и могут использоваться для стратификации стадий фиброза в печени. Определение концентраций АФП, ВЭФР, МДА, альбумина, каталазы и количества тромбоцитов можно использовать как дополнительные критерии диагностики продвинутых стадий фиброза (FII–FIV) у пациентов с ХГС. Оценку сывороточного уровня лептина можно применять для дифференциации цирроза печени от фиброза (FI–FIII).

Финансирование исследования. Работа выполнена на собственные средства авторов, а также при спонсорской поддержке ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск).

Конфликт интересов. ЗАО «Вектор-Бест» не оказывало влияния на ход исследований и его результаты.