Разработка молекулярно-генетического компонента микробиологического мониторинга внутрибольничных острых кишечных инфекций вирусной этиологии

Актуальность изучения различных аспектов проблемы острых кишечных инфекций (ОКИ) вирусной этиологии определяется широким повсеместным их распространением, полиэтиологичностью, разно­образием путей и факторов передачи, выраженной сезонностью, сохраняющейся тенденцией к росту заболеваемости, принимающей нередко групповой и вспышечный характер, особенно среди детского населения [1–6]. Вспышки ОКИ вирусной этиологии могут регистрироваться также в условиях различных медицинских учреждений как инфекционного, так и неинфекционного профиля [1, 3, 7, 8]. Такая ситуация требует проведения эффективного эпидемиологического расследования с целью выявления взаимосвязи различных заболеваний, определения источника возбудителя инфекции, путей передачи и, что особенно важно, установления наличия или отсутствия внутрибольничных случаев инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (ИСМП).

Существующая в России система эпидемиологического надзора за ОКИ вирусной этиологии позволяет оценивать эпидемиологическую обстановку, а также научно обосновывать, планировать и корректировать меры контроля. Данная система является открытой и развивающейся структурой, что обеспечивает возможность введения новых параметров и компонентов, тем самым совершенствуя ее. Особенно это актуально в связи с развитием молекулярно-генетических методов исследований.

Существующий молекулярно-биологический компонент микробиологического мониторинга ОКИ вирусной этиологии в полной мере не раскрывает применение различных видов генотипирования, филогенетического анализа для определения генетических характеристик возбудителей и, соответственно, не обеспечивает определения условий возникновения инфекций в медицинском учреждении.

Цель исследования — повышение эффективности микробиологического мониторинга путем его оптимизации и разработки молекулярно-генетического компонента на основании комплексного многолетнего наблюдения за внутрибольничными острыми кишечными инфекциями вирусной этиологии.

Материалы и методы. Клинической базой исследования являлась многопрофильная Нижегородская областная детская клиническая больница. На первом этапе работы в рамках эпидемиологического надзора за внутрибольничными инфекциями вирусной этиологии в данном неинфекционном детском стационаре была внедрена синдромальная диагностика случаев ОКИ по разработанному алгоритму, который включал выявление и обследование на широкий спектр возбудителей ОКИ всех пациентов с признаками дисфункции желудочно-кишечного тракта, не связанной с основным заболеванием. Кроме этого, обследовались лица, контактировавшие с пациентами с указанным синдромом или с подтвержденным диагнозом ОКИ. В рамках микробиологического мониторинга осуществляли исследование смывов с объектов окружающей (внешней) среды отделений, где были случаи ОКИ.

На базе проблемной научной лаборатории ПЦР-исследований НИИ профилактической медицины Нижегородской государственной медицинской академии методом ПЦР в режиме реального времени проведено дифференциальное выявление с анализом их ДНК (РНК) ротавирусов группы А, норовирусов, астровирусов, энтеровирусов и аденовирусов группы F с использованием набора «АмплиСенс® ОКИ скрин-FL» (ЦНИИЭМ, Москва). За период 2013–2014 гг. исследовано 178 образцов фекалий и 23 смыва окружающей среды стационара. Выполнено 1038 исследований.

Работа проведена в соответствии с Хельсинкской декларацией, принятой в июне 1964 г. (Хельсинки, Финляндия) и пересмотренной в октябре 2000 г. (Эдинбург, Шотландия), и одобрена Этическим комитетом Нижегородской государственной медицинской академии. От родителей пациентов получено информированное согласие.

На втором этапе работы выполнено генотипирование 132 обнаруженных возбудителей вирусных ОКИ. Исследование проводили в лаборатории молекулярной эпидемиологии вирусных инфекций Нижегородского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной (Н. Новгород). G[P]-типирование ротавирусов осуществляли методом ОТ-ПЦР с помощью праймеров для идентификации типов G1, G2, G3, G4, G9 и P[4], P[6], P[8], P[9] [9]. Генотипирование кишечных вирусов методом секвенирования проводили путем определения соответствующих нуклеотидных последовательностей фрагментов кДНК ротавирусов, норовирусов и астровирусов с использованием генетического анализатора Beckman Coulter (Beckman Coulter, США) [10–13]. Анализ нуклеотидных последовательностей выполняли с применением пакета программ BLAST для идентификации близкородственных штаммов и онлайн-сервиса для автоматического генотипирования норовирусов Norovirus Genotyping Tool Version 1.0.

На третьем этапе работы на основе выровненных нуклеотидных последовательностей осуществляли филогенетический анализ с помощью программного обеспечения MEGA. Для сравнения использовали нуклеотидные последовательности генома кишечных вирусов, имеющиеся в международной базе данных GenBank (США). Филограммы были построены методом присоединения соседей (neighbor-joining method) на основе двупараметрической модели Kimura. Досто­верность топологии филограмм оценивали с помощью бутстреп-анализа с использованием 1000 случайных выборок. Полученные в данном исследовании последовательности фрагментов генома представлены в международной базе данных GenBank под номерами KP208780, KP208781 (астровирусы), KP208782–KP208785, KR020053 (норовирусы), KR020054 (ротавирусы). Результаты работы подвергали статистической обработке по общепринятой методике методами вариационной статистики [14].

На завершающем этапе были проведены эпидемио­логическая диагностика эпидемической обстановки в детском многопрофильном стационаре на основе данных расследования случаев инфекции, микробиологического мониторинга, включая молекулярно-генетические исследования, и сопоставление полученных результатов с данными эпидемиологического надзора за ОКИ вирусной этиологии на территории региона.

Результаты и обсуждение. На первом этапе исследования установлено, что среди обследованных пациентов с синдромом дисфункции желудочно-кишечного тракта, не связанной с основным заболеванием, вирусы кишечной группы обнаружены в 43,8% случаев (95% ДИ 40,1–47,5) [4]. Среди лиц, инфицированных кишечными вирусами, моноинфекция выявлена у 72% пациентов, микст-инфекция — у 28% (p=0,007). В вирусных ассоциациях преобладали ротавирусная и норовирусная инфекции (92,1%). Таким образом, в условиях детского клинического стационара вирусная ОКИ встречалась почти у каждого второго ребенка, имеющего признаки дисфункции желудочно-кишечного тракта, не связанной с основным заболеванием.

При анализе ОКИ по этиологическому фактору в 2013 г. установлено преобладание норовирусной инфекции — 73,2% (95% ДИ 69,9–76,5) обследованных с моноинфекцией (p=0,045). Ротавирусная инфекция занимала второе место, и ее удельный вес составлял 23,2% (95% ДИ 20,0–26,4). Астровирусная и аденовирусная инфекции составляли по 1,8% (95% ДИ 0,9–2,7) случаев (рис. 1).

Рис. 1. Этиологическая структура острой кишечной инфекции ви­рус­ной этиологии у пациентов детского многопрофильного не­ин­фек­ционного стационара

С целью выявления масштаба контаминации кишечными вирусами помещений клиники проведено исследование объектов буфета, палат для пациентов, медицинского поста, санитарной комнаты и туалетов, входящих в состав одного из отделений стационара. Отобраны смывы с выключателей, ручек дверей, поверхностей столов, тумбочек, кроватей. Кишечные вирусы обнаружены в 47,8% (95% ДИ 37,4–58,2) смывов: 39,1% смывов взяты в больничных палатах и 8,7% — в туалетах. В 39,1% образцов (95% ДИ 24,4–53,8) выявлено наличие моноинфекции: норовирусы составили 26,1%, а ротавирусы — 13,0%. Очевидно, что при наличии устойчивости кишечных вирусов в окружающей среде контаминированные объекты могут явиться одним из постоянно действующих факторов передачи ОКИ в условиях стационара. Данный факт требует коррекции профилактических и противоэпидемических мероприятий, а также осуществления мониторинга окружающей среды стационара на контаминацию вирусами.

На следующем этапе работы был проведен филогенетический анализ установленных нуклеотидных последовательностей фрагментов генома кишечных вирусов.

Генотипирование ротавирусов методами ОТ-ПЦР и секвенирования выявило наличие генотипов G4P[8] в 30,0% и G1P[8] — в 70,0% случаев. В период проведения данного исследования на территории Н. Новгорода встречались ротавирусы вида А, относящиеся к пяти G-типам (G1, G2, G3, G4, G9) и четырем Р-типам (Р[4], Р[6], Р[8], Р[9]). Доминирующим был генотип G4P[8] — 40,3%. Данные о циркуляции кишечных вирусов на территории Н. Новгорода позволяют предположить, что случаи регистрации ротавирусов генотипа G4P[8] у пациентов обусловлены неоднократным заносом в стационар.

Ротавирус генотипа G1P[8] выявлен у 70% пациентов стационара. Филогенетический анализ показал инфицирование одним вариантом ротавируса, относящимся к линии G1-I. Гомология составляла 99,9–100% (рис. 2). На территории Н. Новгорода он выявлялся в 12,1% случаев [15], но циркулировали в основном представители линии G1-II. Результаты, полученные в нашем исследовании, свидетельствуют об устойчивой циркуляции во внутрибольничных условиях ротавируса генотипа G1-I.

Рис. 2. Филогенетическое дерево, построенное на основе анализа нуклеотидных последовательностей участка гена VP7 генома ротавирусов: — изоляты, выявленные в ходе данного исследования; ○ — изоляты, выявленные в других исследованиях на территории Н. Новгорода; ■ — референсные типовые штаммы ротавирусов генотипов G1 и G4; названия стран указаны по двухбуквенному коду ISO-3166-1

Таким образом, по данными эпидемиологического расследования случаев инфекций, изучения генетической характеристики возбудителей, а также сопоставления с информацией о циркуляции кишечных вирусов на территории города установлено, что в условиях стационара у пациентов с ротавирусной инфекций 6 случаев можно классифицировать как занос инфекции, а 14 случаев отнести к ИСМП.

Генотипирование норовирусов выявило преобладание геногруппы GII. На генотипы норовируса GII.1 и GII.4 приходилось по 44,4% (95% ДИ 27,8–61,0), а на GII.3 — 11,1%. Обнаруженные норовирусы генотипа GII.1 были идентичны между собой по исследуемому участку генома и сходны с единственным изолятом норовируса данного генотипа, выявленным в период с 2006 по 2012 г. при спорадической заболеваемости на территории Н. Новгорода, а также с норовирусом, вызвавшим вспышку ОКИ в одном из учебных заведений города в сентябре 2012 г. (гомология — 99,9%) [5]. Выявленные в данном исследовании случаи явились результатом внутрибольничной передачи норовирусной инфекции после заноса возбудителя, циркулировавшего на территории.

Норовирусы GII.4 относились к геноварианту Sydney_2012, который был впервые обнаружен в Австралии в марте 2012 г. и в 2012–2013 гг. получил эпидемическое распространение в мире [16]. Однако, относясь к одному геноварианту, выявленные в данной работе изоляты GII.4 Sydney_2012 существенно отличались друг от друга по исследуемому участку генома (дивергенция составила 0,7–2,4%) и входили в отдельные кластеры при филогенетическом анализе нуклеотидных последовательностей (рис. 3). В связи с этим анализируемые случаи можно считать результатом независимых заносов норовируса GII.4 в медицинскую организацию, кроме того, требуются дополнительные исследования. Однако нельзя полностью исключить, что наблюдаемая дивергенция явилась результатом циркуляции в закрытом пространстве стационара.

Рис. 3. Филогенетическое дерево, построенное на основе анализа нуклеотидных последовательностей участка гена VP1 генома норовирусов: — изоляты, выявленные в ходе данного исследования; ○ — изоляты, выявленные в других исследованиях на территории Н. Новгорода; ■ — референсные типовые штаммы норовирусов разных генотипов GII.1, GII.3, GII.4; названия стран указаны по двухбуквенному коду ISO-3166-1

Последовательность норовируса GII.3 при филогенетическом анализе отнесена к линии D по классификации J.E. Mahar c соавт. [17].

При генотипировании астровирусов установлено, что один изолят относится к генотипу 1, линии 1а, сублинии 1а-2010. Данный генотип является наиболее распространенным и обладает высоким уровнем генетической гетерогенности [6, 15]. Другой изолят относится к астровирусам генотипа 2, генетической линии 2с, которые характеризуются низкой циркуляцией в мире [6, 18] (рис. 4).

Рис. 4. Филогенетическое дерево, построенное на основе анализа нуклеотидных последовательностей участка гена — предшественника капсидных белков генома астровирусов: — изоляты, выявленные в ходе данного исследования; ○ — изоляты, выявленные в других исследованиях на территории Н. Новгорода; ■ — референсные типовые штаммы астровирусов генотипов 1 и 2; названия стран указаны по двухбуквенному коду ISO-3166-1

Принадлежность астровирусов, выявленных в двух эпизодах инфекции в стационаре, к различным генотипам в совокупности с данными эпидемиологического расследования позволяет квалифицировать их как случаи независимого заноса в стационар.

Полученные в данном исследовании результаты явились основанием для оптимизации компонентов системы эпидемиологического надзора за кишечными инфекциями вирусной этиологии в РФ, а именно эпидемиологического мониторинга. С учетом внедрения новых молекулярно-генетических технологий при осуществлении научного исследования особое внимание было уделено именно совершенствованию микробиологического компонента эпидемиологического надзора за ОКИ (рис. 5).

Рис. 5. Оптимизированная система эпидемиологического надзора за острой кишечной инфекцией вирусной этиологии

Эпидемиологический мониторинг, направленный на эпидемиологическую диагностику ОКИ вирусной этиологии в детском многопрофильном неинфекционном стационаре, по нашему мнению, должен включать следующие компоненты:

1) синдромальную диагностику — выявление и обследование пациентов с признаками дисфункции желудочно-кишечного тракта, не связанной с основным заболеванием, а также контактирующих с ними лиц (другие пациенты, ухаживающие лица, медицинский персонал) по разработанному алгоритму;

2) оценку заболеваемости и распространенности ОКИ вирусной этиологии, в том числе и в разрезе этио­логии;

3) эпидемиологическое обследование случаев ОКИ в стационаре с анализом условий возникновения инфекции (заносы или ИСМП), причин и условий, способствовавших их возникновению и распространению, а также путей и факторов передачи, контактных лиц;

4) расследование эпидемической ситуации (групповая заболеваемость и вспышки);

5) интерпретацию результатов микробиологического мониторинга, включая молекулярно-биологический компонент, уточнение условий возникновения случаев инфекции (занос или ИСМП), путей и факторов передачи возбудителя инфекции, особенностей циркуляции возбудителей в медицинской организации;

6) сопоставление результатов эпидемиологической диагностики с результатами эпидемиологического надзора на территории;

7) постановку эпидемиологического диагноза и планирование мероприятий по контролю распространения ОКИ.

Молекулярно-генетический компонент микробиологического мониторинга должен включать обследование пациентов и исследование внешней среды:

1) обследование пациентов:

— выявление и дифференциация РНК (ДНК) кишечных вирусов методом ПЦР в реальном масштабе времени и изучение их циркуляции;

— генотипирование положительных проб на кишечные вирусы (G[P]-типирование ротавирусов, секвенирование и другие методы);

— филогенетический анализ (идентификация и прояснение эволюционных взаимоотношений);

— определение условий возникновения инфекции путем сопоставления данных с результатами циркуляции возбудителей на конкретной территории (область, округ и т.д.) с учетом результатов эпидемиологического мониторинга ОКИ в медицинском учреждении;

2) исследование окружающей среды:

— выявление и дифференциация РНК (ДНК) кишечных вирусов методом ПЦР в реальном масштабе времени на различных объектах окружающей среды лечебно-профилактического учреждения.

Конкретные параметры исследования внешней среды в молекулярно-генетическом компоненте микробиологического мониторинга должны определяться эпидемиологической обстановкой в медицинском учреждении. Так, исследования внешней среды могут проводиться как в плановом порядке, так и по эпидемическим показаниям, осуществляться в комплексе с бактериологическими исследованиями в рамках производственного контроля или отдельно, быть направленными на конкретные отделения или на помещения и объекты внешней среды. Объем мероприятий, объекты исследования, а также режимы мониторинга выбираются в зависимости от эпидемиологической ситуации в медицинском учреждении.

Результаты исследования внешней среды на контаминацию кишечными вирусами являются основанием для коррекции дезинфекционных мероприятий: выбор вирулицидного режима применения дезинфицирующих средств, определение объектов и помещений для обработки. Кроме того, эти данные необходимы для выявления путей и факторов передачи инфекции.

Использовать результаты ПЦР-исследований внешней среды для контроля качества проведенных дезинфекционных мероприятий следует с осторожностью.

Выполнение исследований по идентификации кишечных вирусов методом ПЦР должно проводиться силами лабораторной службы медицинского учреждения. Осуществление генотипирования, а также филогенетический анализ и сопоставление результатов необходимо проводить на базе референс-центров (референс-лабораторий) по мониторингу за кишечными инфекциями и ИСМП или других научно-исследовательских организаций.

Таким образом, оптимизация эпидемиологического надзора за вирусными кишечными инфекциями путем модернизации молекулярно-генетического мониторинга позволяет значительно повысить эффективность выявления заболеваемости, контаминации окружающей среды, а также на основании генетических характеристик возбудителей и сопоставления данных о циркуляции кишечных вирусов на территории провести успешную дифференцировку случаев по условиям ее возникновения.

Заключение. С целью оптимизации микробиологического мониторинга острых кишечных инфекций разработан молекулярно-генетический компонент вирусной этиологии, включающий в себя не только диагностику кишечных возбудителей методом ПЦР, но и дальнейшее проведение различных видов генотипирования, а также осуществление филогенетического анализа для определения генетических характеристик возбудителей.

Финансирование исследования и конфликт интересов. Исследование не финансировалось какими-либо источниками, и конфликты интересов, связанные с данным исследованием, отсутствуют.