Влияние геномного редактирования клеток на результаты нейротрансплантации при экспериментальном паркинсонизме

Одним из распространенных нейродегенеративных заболеваний является болезнь Паркинсона (БП), в развитии которой большая роль принадлежит генетическим факторам [1]. Основными клиническими проявлениями данного заболевания служат двигательные расстройства (брадикинезия, мышечная ригидность, тремор покоя), которые обусловлены гибелью пигментированных нейронов черной субстанции среднего мозга, продуцирующих дофамин, с последующей дегенерацией нигростриарного дофаминергического пути [2]. БП четко ассоциирована с пожилым возрастом, встречаясь у 1–2% лиц старше 70 лет [3]. Это обстоятельство в связи с неуклонным увеличением доли пожилых лиц в структуре современного общества придает БП высокую социальную значимость.

Существующие методы лечения БП носят главным образом симптоматический характер и не предотвращают прогрессирования текущего нейродегенеративного процесса. Актуальной проблемой является разработка новых подходов к терапии данного заболевания, в числе которых на одном из первых мест рассматривается возможность восполнения уровня дофамина в ЦНС с помощью трансплантации экзогенных дофаминпродуцирующих клеток [4–6]. Попытки нейротрансплантации при паркинсонизме у человека с использованием фетальных тканей среднего мозга и нейронов, полученных из эмбриональных стволовых клеток, продемонстрировали, что трансплантированные клетки могут реиннервировать стриатум, восстанавливать дофаминергическую нейротрансмиссию и в некоторых случаях улучшать двигательные функции, однако этот эффект оказался плохо воспроизводимым [7, 8]. К настоящему моменту реальной и наиболее перспективной альтернативой при БП представляется трансплантация в стриатум полноценных по своим морфофункциональным характеристикам дофаминергических нейронов, дифференцированных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) [9–12]. ИПСК можно получать из соматических тканей (фибробластов) самих пациентов с помощью клеточного репрограммирования [13], что исключает этические проблемы и обеспечивает генетическую идентичность трансплантата и организма реципиента.

Ранее мы показали [14, 15], что ИПСК могут быть использованы для лечения экспериментального паркинсонизма, вызванного введением в черную субстанцию мозга крыс селективного токсина дофаминергических нейронов 6-гидроксидофамина (6-OHDA): стереотаксическая трансплантация дифференцированных из ИПСК человека дофаминергических нейронов в полосатое тело модельных крыс приводила к отчетливому улучшению двигательных функций и редукции симптоматики паркинсонизма. При этом остается неясным, какое влияние на регенеративный потенциал трансплантируемых клеток оказывают мутации в генах паркинсонизма, встречающиеся у 5–10% пациентов с БП [1, 3]. Ответ на этот вопрос во многом определяет перспективы нейротрансплантации при наследственных формах БП.

Цель исследования — оценить результаты пилотного эксперимента по трансплантации мутантных и «нормализованных» изогенных нейрональных предшественников, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток пациента с аутосомно-доминантной формой болезни Паркинсона (точковая мутация в гене LRRK2) и подвергнутых геномному редактированию с использованием искусственной эндонуклеазной системы CRISP/Cas9.

Материалы и методы

Моделирование БП проводили на 24 крысах линииWistar в возрасте 3–4 мес. Животные содержались в виварии института при свободном доступе к пище и воде и чередовании суточной освещенности 12 ч света/12 ч темноты. Содержание животных и проведение экспериментов осуществляли в соответствии с международными правилами «Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (ILAR publication, 1996, the National Academies Press)», а также с этическими принципами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (принятой в Страсбурге 18.03.1986 г. и подтвержденной в Страсбурге 15.06.2006 г.). Работа одобрена Этическим комитетом Научного центра неврологии.

Для получения паркинсонического синдрома крысам повреждали дофаминергические нейроны черной субстанции мозга путем введения в ее компактную часть нейротоксина 6-ОНDА (Sigma, США). Для проведения стереотаксических операций анестезированных животных помещали на раму двойного лабораторного стереотаксического манипулятора (Stoelting Co., США). Во время операции в указанную область мозга унилатерально справа вводили 6-ОНDА в дозе 10,0 мкг в 2 мкл 0,05% раствора аскорбиновой кислоты со скоростью 0,4 мкл /мин в соответствии с координатами атласа мозга крыс [16] (АР=–4,8; V=1,9; L=8,0). В качестве анестезии при проведении хирургических манипуляций применяли Золетил 100 в дозе 3 мг/100 г и Ксиланит в дозе 3 мг/кг внутримышечно, для премедикации использовали атропин в дозе 0,04 мг/кг подкожно за 10–15 мин до введения Ксиланита. В черную субстанцию слева вводили физиологический раствор в том же объеме.

После развития паркинсонического синдрома животные были разделены на две группы по 12 особей для последующей нейротрансплантации одной из двух изучаемых линий нейрональных предшественников, дифференцированных из ИПСК (см. далее). Трансплантация проводилась в хвостатые ядра мозга в соответствии с координатами атласа мозга крыс [16] (AP=1,5; V=2,5; L=4,8). Животные были анестезированы по схеме, описанной выше.

Трансплантацию клеток осуществляли унилатерально, на стороне повреждения. В хвостатые ядра вводили суспензию дифференцированных клеток в 10 мкл физиологического раствора. Суспензию набирали в 25-мкл микрошприц Гамильтона и вводили с постоянной скоростью в течение 10 мин (1,0 мкл/мин). После инъекции микрошприц оставляли на месте в течение еще 2 мин, затем медленно извлекали в течение одной минуты. В хвостатые ядра слева вводили физиологический раствор в том же объеме. За один день до операции и далее ежедневно в течение всего эксперимента животные получали циклоспорин в дозе 15 мг/кг.

В работе были использованы следующие полученные ранее линии ИПСК [17]:

клетки от пациента с аутосомно-доминантной формой БП (форма PARK8, мутация G2019S в гене LRRK2), обозначение линии — IPSPDL2.15L (далее — «больные» клетки);

клетки этого же пациента после геномного редактирования, в ходе которого была проведена коррекция мутации с восстановлением нормальной нуклеотидной последовательности гена LRRK2 — линия IPSPDL2.15 wt (далее — «редактированные» клетки).

Культивирование ИПСК. Клетки культивировали в чашках Петри 35 и 60 мм (Greiner Bio-One, Австрия) на подложке из матригеля (BD Biosciences, США) в среде mTeSR (STEMCELL Technologies, Канада). Смену среды производили один раз в сутки. Для пересева клетки снимали с подложки с помощью фермента диспазы в концентрации 1 мг/мл (Gibco, США), инкубируя клетки с ферментом 7–10 мин в СО₂-инкубаторе при 37°С. После этого клетки 5 раз отмывали от диспазы средой ДМЕМ («ПанЭко», Россия), колонии клеток механически снимали широким концом пластикового наконечника на 200 мкл и переносили в 1 мл среды mTeSR, а потом высевали в новую чашку Петри, покрытую матригелем и содержащую 1 мл среды mTeSR. Пассирование клеток 1:2 или 1:3 осуществляли каждые 5–7 дней.

Дифференцировка ИПСК в нейрональные предшественники. ИПСК культивировали в среде mTeSR до достижения 80% конфлюэнтности, далее среду заменяли на нейрональную следующего состава: среда DMEM/F12 (Gibco, США); 2% заменитель сыворотки (Gibco, США); 1 мМ заменимые аминокислоты («ПанЭко», Россия); 2 мМ L-глутамин (ICN Biomedical, США); пенициллин-стрептомицин (50 ЕД/мл, 50 мкг/мл; «ПанЭко», Россия); добавка 1% N2 (Life Technologies, США); 10 мкМ ингибитор SB431542 (Stemgent, США); 80 нг белок Noggin (Peprotech, США). Смену среды осуществляли ежедневно в течение 7–10 дней. Сформированные нейрональные розетки и гребни механически отделяли и переносили в 24-луночный планшет с предельно низкой адгезией (Costar, США), где впоследствии формировались нейросферы, которые еще 5–7 дней культивировали в планшете.

Нейросферы собирали в центрифужные пробирки, диссоциировали до моноклеточной суспензии с помощью трипсина (0,05%) и высевали в чашки Петри, покрытые матригелем, в нейрональную среду следующего состава: среда DMEM/F12; 2% заменитель сыворотки; 1 мМ заменимые аминокислоты; 2 мМ L-глутамин; пенициллин-стрептомицин (50 ЕД/мл, 50 мкг/мл); добавка 1% N2; добавка 1% B27 (Gibco, США); 10 мкМ ингибитор SB431542; 80 нг белок Noggin с добавлением 5 мкМ ROCK-ингибитора (Stemolecule Y27632; Stemgent, США). Нейрональные предшественники при достижении плотного монослоя пассировали 1:4.

Подготовка нейрональных предшественников для трансплантации крысам. Нейрональные предшественники 2–4-го пассажа рассевали по 200 тыс. клеток на 1 см² в чашки Петри, покрытые матригелем, в нейрональную среду.

На следующий день среду заменяли на дифференцировочную: среда DMEM/F12; 2% заменитель сыворотки; добавка 1% B27; 2 мМ глутамин; 1% смесь аминокислот («ПанЭко», Россия); пенициллин-стрептомицин (50 ЕД/мл, 50 мкг/мл); 100 нг/мл белок Shh (PeproTech, США); 100 нг/мл FGF8 — фактор роста фибробластов (PeproTech, США) и 10 мкМ пурморфамина (Stemgent, США).

Клетки культивировали в течение 6–8 дней, среду меняли через день. В день подсадки клетки снимали с помощью трипсина (0,05%), аккуратно пипетировали, проводили подсчет в камере Горяева и необходимое количество суспензии центрифугировали при 350 g в течение 5 мин. Супернатант сливали и клетки пипетировали в дифференцировочной среде с добавлением 5 мкМ ROCK-ингибитора. Для подсадки одной крысе использовали 500 тыс. клеток (для IPSPDL2.15L) и 250 тыс. клеток (для IPSPDL2.15 wt). Суспензию клеток аликвотировали (по 500 (200) тыс. клеток в 1 мл среды) в эппендорфы и помещали в водяную баню при 37°С. Непосредственно перед использованием эппендорф с клетками брали из водяной бани, центрифугировали на микроцентрифуге при 2 тыс. оборотов в течение 5 мин, супернатант тщательно удаляли и вносили 10 мкл стерильного 0,9% NaCl, аккуратно пипетировали суспензию клеток и набирали в микрошприц для последующего введения.

Физиологические тесты. Двигательные функции крыс оценивали с помощью теста «Открытое поле»: учитывалось число пересеченных квадратов за 3 мин. Изучение нарушений когнитивных функций и оценку динамики эмоционального состояния экспериментальных крыс проводили с помощью теста условной реакции пассивного избегания (УРПИ). Данный тест позволяет оценить как когнитивные нарушения, так и изменения эмоционального состояния крыс с моделями различных патологий, в частности с паркинсоническим синдромом [18–20]. Воспроизведение пассивных оборонительных реакций оценивали по длительности латентного периода перехода крыс из ярко освещенного отсека камеры в темный отсек, в котором животные накануне получали неизбегаемое болевое воздействие (нанесение удара постоянным электрическим током 0,2 мА, 3 с). Тестирование таких реакций проводили через 1, 3, 7 и 14 сут после предъявления электрического раздражения. Тесты УРПИ выполняли с помощью программы ShutАvoid 1.8.03 на установке ф. PanLab/Harvard Apparatus (Испания).

Данные обрабатывали в программе Statistica 7.0, используя однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA). Статистически значимыми считали различия при p<0,05.

По окончании экспериментов животных усыпляли хлороформом, затем декапитировали и извлекали мозг с целью проведения планируемых иммуногистохимических исследований.

Результаты. В течение 4 нед после нейротоксического повреждения дофаминергических нейронов черной субстанции наблюдали развитие паркинсонического синдрома у экспериментальных животных. Подробнее оценка получаемых нарушений изложена в наших более ранних работах [15]. Нейротрансплантацию дифференцированных ИПСК различных линий проводили в период, когда двигательные нарушения у модельных крыс были отчетливо выражены, но не наблюдалось акинезии.

Особый интерес в данной работе представляло сравнение эффекта нейротрансплантации изогенных ИПСК двух видов — мутантного и «дикого» (восстановленного после геномного редактирования) — на двигательные и когнитивные функции модельных животных, поскольку такие данные в доступной нам литературе практически отсутствуют.

Через 2 нед после хирургических процедур было начато тестирование двигательной активности животных в «открытом поле». Ранее нами было показано [14], что введение дифференцированных ИПСК приводило к постепенному восстановлению двигательной активности экспериментальных крыс. Этот результат был воспроизведен и в данной работе в обеих группах животных, причем статистически значимых различий тестируемых показателей между группами не выявлено (рис. 1).

---

Рис. 1. Динамика восстановления двигательной активности экспериментальных крыс в тесте «открытое поле»: по оси ординат — число пересеченных квадратов, по оси абсцисс — время тестирования; красная линия — группа крыс с трансплантацией клеток от больного донора («больные» клетки); синяя линия — группа крыс с трансплантацией «редактированных» клеток от больного донора; * — различия статистически значимы со значениями двигательной активности перед нейротрасплантацией; р≤0,05

---

После достижения устойчивого улучшения локомоции (т.е. через 4 нед после нейротрансплантации) было проведено изучение воспроизведения по тесту УРПИ (рис. 2). Животные 1-й группы, с трансплантированными мутантными («больными») клетками, продемонстрировали нарушенное воспроизведение условных реакций. Все животные этой группы переходили в темный отсек камеры с небольшим латентным периодом, длительность которого практически не менялась при последующих тестированиях; более того, во все дни тестирования не наблюдалось статистически значимых различий латентного периода с днем нанесения болевого шока. У 2-й группы крыс — с трансплантированными «нормализованными» клетками (т.е. с нейрональными предшественниками, в которых был восстановлен нормальный генотип), воспроизведение реакций УРПИ оказалось весьма сходным с хорошо известным паттерном, характерным для животных без каких-либо токсических воздействий. Через сутки после нанесения болевого воздействия экспериментальные животные либо вовсе не переходили в темный отсек, либо переходили с большим латентным периодом. Значительная длительность латентного периода наблюдалась также через 3 сут после болевого шока и предсказуемо снизилась через 7 сут. Интересно, что через 14 сут латентный период перехода резко увеличился и сравнялся с зафиксированным через 24 ч. Причины такого скачка значений латентного периода пока не вполне ясны.

---

Рис. 2. Изменение длительности латентного периода перехода экспериментальных крыс в темный отсек камеры: по оси ординат — время в секундах; по оси абсцисс — время тестирования; красная линия — группа крыс с трансплантацией клеток от больного донора («больные» клетки); синяя линия — группа крыс с трансплантацией «редактированных» клеток от больного донора; + — различия статистически значимы со значениями в день нанесения болевого раздражения; * — при сравнении с «больными» клетками; р≤0,05

---

Различия в величине латентного периода у крыс, получивших в качестве трансплантата мутантные и «нормализованные» клетки, были статистически высокодостоверны во всех проведенных тестированиях (кроме тестирования через 7 сут): «больные» клетки vs «редактированные» клетки через 24 ч — р<0,46; через 72 ч — р<0,004; через 14 сут — р<0,021.

Обсуждение. Развитие паркинсонизма, помимо изменений в двигательной сфере, сопровождается закономерными нарушениями эмоционального состояния и когнитивной сферы [21, 22]. Возникновение этих нарушений объясняется в значительной степени тем, что наряду с дегенеративными изменениями нигростриатной системы мозга при БП происходит также вовлечение мезолимбической и мезокортикальной дофаминергических систем. Недвигательные (в том числе когнитивные) нарушения сопровождают все стадии БП и в ряде случаев опережают манифестацию двигательных нарушений на 5–10 лет и более [23, 24].

Среди часто встречаемых когнитивных нарушений, наблюдаемых на ранних стадиях БП, отмечаются замедление психических процессов (брадифрения), ухудшение внимания, нарушение запоминания [25]. С прогрессированием заболевания нарушения когнитивных функций усиливаются, происходит более грубое снижение внимания, памяти, ориентации и мышления, усиливаются зрительно-пространственные нарушения. Развитие деменции в поздней стадии БП значительно затрудняет повседневную деятельность пациента. В связи с этим роли недвигательных проявлений в ранней диагностике и прогнозе развития БП в последние годы придается существенное значение.

Болезнь Паркинсона — это не только патология дофаминергической системы, она также характеризуется вовлечением в патологический процесс ацетилхолинергической, норадренергической и глутаматных медиаторных систем. Показано, что снижение содержания катехоламинов в мозге после выработки УРПИ приводит к дефициту их выполнения, что рассматривается как проявление ретроградной амнезии [26]. Такое действие оказывает и введение 6-OHDA в черную субстанцию мозга. Вместе с тем известно, что пассивное оборонительное поведение животных обусловлено механизмами страха и отражает состояние тревожности [27, 28]. Хорошо известна роль дофаминергической системы в механизмах памяти [29]. О важном значении дофаминергической системы для воспроизведения УРПИ свидетельствуют результаты нейрофармакологического воздействия на дофаминовые D2-рецепторы [27]. Как известно, избегаемый/контролируемый стресс вызывает увеличение высвобождения дофамина в прилежащем ядре, тогда как предъявление неконтролируемых раздражений уменьшает высвобождение дофамина [30]. Предполагается, что вовлечение дофамина больше связано с нейронными механизмами информационного процесса, определяющего стратегию поведения.

Детальные механизмы влияния трансплантатов, содержащих «редактированные» клетки, на манифестировавшую у животных психоневрологическую симптоматику пока не вполне ясны. Очевидно, что трансплантация нейрональных предшественников, несущих исходную мутацию, способствовала уменьшению выраженности только двигательных симптомов паркинсонизма, тогда как трансплантация «редактированных» клеток редуцировала одновременно и двигательные, и когнитивные расстройства (сохранение памятного следа). Такой дифференцированный эффект может быть связан с более широким влиянием «редактированных» клеток на дофаминергические структуры разных уровней ЦНС, а также с их более выраженным (по сравнению с «больными» клетками) модулирующим воздействием на высвобождение глутамата, гамма-аминомасляной кислоты и других нейротрансмиттеров в базальных ганглиях и их кортикальных проекциях. Решение этого вопроса требует дальнейших комплексных исследований.

Заключение. Проведенное исследование показывает принципиальную возможность коррекции нарушений моторики и когнитивных функций у экспериментальных животных с 6-OHDA-моделью паркинсонизма за счет репопуляции дофаминергических нейронов, источником которых могут быть индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, получаемые из соматических клеток (фибробластов). Благодаря технологии геномного редактирования такой подход может быть применим и у пациентов с наследственными (генетически обусловленными) формами болезни Паркинсона.

Финансирование исследования. Исследование поддержано грантом Российского научного фонда №14-15-01047-П.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие конфликта интересов.