Трансплантат лимбальных эпителиальных стволовых клеток на биорезорбируемом носителе

Заболевания, ведущим фактором развития которых является недостаточность лимбальных эпителиальных стволовых клеток (ЛЭСК), характеризуются помутнением роговицы различной степени интенсивности, хроническим воспалением поверхности глазного яблока, неоваскуляризацией, образованием конъюнктивального паннуса, рецидивирующими эрозиями, что в итоге ведет к значительному снижению остроты зрения [1]. К лимбальной недостаточности могут приводить ожоги, синдром Стивенса–Джонсона, рубцовый пемфигоид, трахома, ионизирующие излучения, ультрафиолетовое излучение, генетические заболевания, в том числе такое заболевание, как врожденная аниридия, а также различные кератиты и кератопатии [2, 3].

Существует несколько вариантов патогенетического лечения лимбальной недостаточности с помощью стволовых клеток в зависимости от ее типа (полная или частичная, врожденная или приобретенная) [4–6]:

1) аутотрансплантаты лимба со здорового глаза или от близких родственников. Недостатком метода является вероятность развития лимбальной недостаточности на ранее интактном глазном яблоке, также данный метод невозможно использовать при двустороннем поражении и при наследственных генетических заболеваниях;

2) трансплантаты аллогенного лимба от доноров-трупов. Основным недостатком метода является длительная иммуносупрессивная терапия;

3) аутологичные лимбальные клетки, культивированные на различных носителях (амниотическая мембрана, коллагеновый скаффолд и др.). Применение данного способа ограничено технической сложностью и стоимостью.

Разработанные на сегодняшний день способы культивирования и трансплантации лимбальных клеток не обеспечивают стойкой регенерации роговичного эпителия и не позволяют добиться достаточно длительного поддержания регенераторных свойств роговичного эпителия для успешного выполнения пересадки роговицы.

Расположенные в складках палисадов Фогта ЛЭСК составляют особый пул стволовых клеток в области базального эпителия лимба [7, 8], благодаря которым происходит восстановление роговицы при различных повреждениях. Деление ЛЭСК выполняется асимметричным способом, при котором одна дочерняя клетка позволяет поддерживать «стволовость» и сохранять пул стволовых клеток, а другая становится транзиторной амплифицирующейся клеткой и далее может дифференцироваться в крыловидные клетки, а они затем в свою очередь трансформируются в терминально дифференцированные роговичные эпителиальные клетки [9]. ЛЭСК по сравнению с другими соматическими стволовыми клетками имеют свои особенности: небольшие размеры самой клетки, высокое ядерно-цитоплазматическое соотношение, отсутствие экспрессии маркеров дифференцировки. Кроме того, для этих клеток характерно наличие α-энолазы, рецепторов EGF, пигмента, присутствие виментина и цитокератина 14, 15, 19 [10, 11]. Основными положительными их маркерами являются фактор p63, субъединица G-2 белка ABCG2 [12, 13]. Среди наиболее используемых в качестве отрицательных маркеров — цитокератин 3 (CK3) и цитокератин 19 (CK19), а также белок коннексин 43, которые типичны для дифференцированных клеток. СК3 является маркером окончательной дифференцировки, он окрашивает все дифференцированные клетки роговичного и лимбального эпителия, но не окрашивает клетки конъюнктивального эпителия. СК19 присутствует во всех конъюнктивальных и лимбальных эпителиальных клетках, а также в периферических базальных клетках роговицы. К сожалению, до настоящего времени не найдено одного конкретного маркера ЛЭСК, поэтому комбинация положительных и отрицательных маркеров является наиболее надежным способом фенотипирования предполагаемых ЛЭСК в лимбальном эпителии.

Цель исследования — разработать метод культивирования лимбальных эпителиальных стволовых клеток для дальнейшей их пересадки на скаффолд из фибринового клея и последующей трансплантации реципиентам с недостаточностью лимбальных стволовых клеток.

Материалы и методы

Клеточная культура. Забор лимбальных клеток осуществляли у взрослого кролика в условиях операционной. Выкраивали участок лимба протяженностью 2–3 мм, толщиной 200 мкм, захватывая по 1,5 мм роговицы и конъюнк­тивы. Все манипуляции с животными проводили в соответствии с нормативами, указанными в руководстве «Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (ILAR publication, 1996, the National Academy Press)»; с национальным стандартом РФ ГОСТ 33044-2014 «Принципы надлежащей лабораторной практики»; с этическими принципами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (принятой в Страсбурге 18.03.1986 г. и подтвержденной в Страсбурге 15.06.2006 г.). Протокол исследования одобрен Этическим комитетом НижГМА.

Всю работу по обработке ткани и культивированию клеток выполняли в асептических условиях в ламинарном боксе. Ткань лимба предварительно несколько раз отмывали в растворе Хэнкса («ПанЭко», Россия) с антибиотиком — 100 мкг/мл гентамицина (КРКА, Словения).

При посадке культуры использовали два метода: 1) механическая и ферментативная диссоциация ткани лимба и высаживание на пластик суспензии клеток; 2) высаживание на пластик ткани лимба без предварительной диссоциации.

Метод 1. Выделенная ткань лимба механически и ферментативно дезагрегировалась: измельчалась при помощи двух скальпелей до размеров 1 мм³, затем обрабатывалась 0,25% раствором трипсина (Invitrogen, США) в течение 15 мин с экспозицией в термостате при 35,5ºС. Для инактивирования трипсина к суспензии добавляли избыток среды Dulbecco’s modified Eagle’s medium и Ham’s F12 — DMEM-F12 (Invitrogen, США) с 10% фетальной бычьей сыворотки («ПанЭко», Россия). Затем суспензию центрифугировали 5 мин при 1000 об./мин. Осадок ресуспендировали в ростовой среде: DMEM-F12 и 10% фетальной бычьей сыворотки. Суспензию клеток, полученную от одного био­птата, в 3 мл среды заливали в пластиковые чашки Петри диаметром 60 мм. Клетки прикреплялись к пластику и активно пролиферировали.

Метод 2. Ткань лимба механически при помощи двух скальпелей разобщали на части по 5–8 мм и помещали в пластиковые чашки Петри диаметром 60 мм в ростовой среде DMEM-F12 и 10% фетальной бычьей сыворотки.

Органотипические культуры (биоптаты) и диссоциированные клетки культивировали при 35,5ºС и 5% СО₂ в инкубаторе для культур клеток МСО-18AlC (Sanyo, Япония) до достижения монослоя культуры 90–100% конфлюэнтности. Замену 1 мл среды производили каждые 3 дня.

Структуру и динамику развития культур оценивали с помощью инвертированного микроскопа DM1000 (Leica Microsystems, Германия). Для оценки скорости развития культур использовали показатель времени достижения монослойной культурой 90–100% конфлюэнтности.

После образования клетками монослоя лимбальные стволовые клетки снимали с поверхности пластика методом трипсинизации и пересаживали на био­резорбируемый носитель — скаффолд. Скаффолд формировали в виде полупрозрачной пленки из фибринового клея Ивисел (Johnson&Johnson, Россия) на дне лунки культурального планшета с диаметром 15,4 мм. Клетки на скаффолде культивировали при постоянных условиях 35,5°С, 5% CO₂ в увлажненном инкубаторе для культур клеток (MCO-18AIC).

Иммуноцитохимическое фенотипирование клеточных культур. Протокол окрашивания клеток в культуре включал в себя фиксацию 70% этанолом, инкубацию клеток с первичными антителами — моноклональными мышиными антителами к CK19, clon Ks19.1 (Lab Vision Corporation, США) и к CKpan, clon AE1/AE3 (Lab Vision Corporation, США). В случае иммунофлюоресцентного окрашивания в раствор дополнительно добавляли первичные кроличьи поликлональные антитела к белку SOX2 (Abcam, США) или белку виментину [EPR3776] — Cytoskeleton Marker (Abcam, США). Визуализацию комплекса с антителами проводили либо с использованием системы детекции UltraVision Quanto (Lab Vision Corporation, США) и ее протокола (без блокирования пероксидазной активности и протеинового блока) — ядра клеток в этом случае докрашивали гематоксилином Майера, либо с использованием вторичных козьих антимышиных антител с флюоресцентными зондами Goat Anti-Mouse IgG H&L — Alexa Fluor® 488 (Thermo Fisher, США) и антикроличьих антител Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody — Alexa Fluor® 555 (Thermo Fisher, США) — ядра клеток в этом случае докрашивали красителем Hoechst 33342 (BD Pharmingen, США).

Окрашенные флюоресцентными маркерами клетки просматривали с помощью конфокального флюоресцентного лазерного сканирующего микроскопа LSM 710 (Carl Zeiss, Германия).

Результаты

Культивирование диссоциированных клеток лимба на пластике до пересадки на скаффолд. При культивировании диссоциированных клеток лимба и органотипической культуры лимбальной ткани наблюдалась различная динамика роста монослоя стволовых лимбальных клеток.

При культивировании клеток лимба первым методом в 1-е сутки первичная культура была представлена клеточной суспензией (рис. 1, а). Некоторые клетки начинали прикрепляться к пластику на 1–2-е сутки, на 5-е сутки культура диссоциированных клеток лимба состояла из фенотипически разнородных клеток, большинство из которых находилось в суспензии, лишь единичные клетки были прикреплены к дну чашки Петри (рис. 1, б). В дальнейшем прикрепившиеся клетки пролиферировали, образуя скопления клеток в виде клонов на дне чашки Петри. Стадия 90–100% конфлюэнтности наблюдалась через 3 нед (22,0±2,6 сут) после посадки диссоциированных клеток (рис. 1, в).

Рис. 1. Развитие культуры диссоциированных лимбальных стволовых клеток: а — 1-е сутки, суспензия клеток сразу после высаживания на дно чашки Петри; б — 5-е сутки, фенотипически разнородные клетки, большинство из которых находится в суспензии; в — 21-е сутки, однородный монослой в виде тонкой пленки

При культивировании клеток лимба вторым методом в 1-е сутки первичная культура была представлена тканевым биоптатом лимба размером 5–8 мм (рис. 2, а). На 2-е сутки культивирования ткань лимба прикреплялась к пластику и в нижней части биоптата; клетки, разнородные по фенотипическому составу, активно пролиферировали (рис. 2, б). Разрастаясь, культура закрывала бóльшую часть дна чашки Петри однородным монослоем в виде тонкой пленки, видной невооруженным глазом. Скорость пролиферации клеток и образования монослоя была значительно выше, чем при культивировании диссоциированных клеток (рис. 2, в). Стадия 90–100% конфлюэнтности наблюдалась через 7,5±0,5 сут.

Рис. 2. Развитие тканевого биоптата лимба без предварительной диссоциации: а — 1-е сутки, тканевой биоптат лимба сразу после помещения на субстрат; б — 3-и сутки, ткань лимба, прикрепленная к пластику, в нижней части образца разнородные по фенотипическому составу клетки активно пролиферируют; в — 5-е сутки, однородный монослой в виде тонкой пленки

Таким образом, оба метода культивирования обеспечивали рост культуры стволовых клеток лимба, достаточный для пересадки на скаффолд из фибринового клея, но скорость роста культуры была выше при культивировании без проведения предварительной диссоциации ткани лимба.

Пересадка лимбальных эпителиальных стволовых клеток на скаффолд. Клеточная культура после ферментативного снятия с пластика и посадки на скаффолд прикреплялась к фибриновому клею и пролиферировала на нем (рис. 3, а), образуя монослой в течение 15–17 сут после получения клеток первым способом и в течение 5–6 сут после получения клеток вторым способом.

Рис. 3. Культура лимбальных стволовых клеток на фибриновом клее: а — живая культура клеток на субстрате; б — иммуноцитохимическое маркирование клеток лимба на цитокератин PAN; в — окрашивание лимбальных клеток иммуноцитохимическим методом на цитокератин 19

Фенотипирование культуры лимбальных ство­­­ло­вых клеток. Иммуноцитохимическое и иммунофлюоресцентное маркирование выявило наличие в культуре единичных дифференцированных клеток с небольшим количеством цитокератинов (рис. 3, б, в). В образце присутствовали мелкие округлые клетки, цитоплазма которых четко окрашена антителами с флюоресцентным красителем к белкам СКpan и CK19 (рис. 4). Также присутствовало небольшое количество SOX2-положительных ядер (рис. 4, верхний ряд). Бóльшую часть культуры (>95%) составляли виментин-положительные клетки (рис. 4, нижний ряд).

Рис. 4. Экспрессия маркеров лимбальных стволовых клеток в образце: верхний ряд — наблюдается небольшое количество клеток с SOX2-положительными ядрами (зеленый цвет), также присутствует округлая клетка с положительным маркированием на цитокератин PAN (красный цвет), ядра клеток окрашены Hoechst 33342 (синий цвет); нижний ряд — положительное маркирование большей части культуры клеток на виментин (зеленый цвет), в нескольких клетках наблюдается его коэкспрессия с цитокератином 19 (красный цвет). Ядра клеток окрашены Hoechst 33342 (синий цвет)

Результаты иммуноцитохимического и иммунофлюоресцентного анализа показали, что в большей части культурального образца присутствовали виментин-положительные клетки с незначительным количеством SOX2-, СКpan- и CK19-позитивных клеток. Отсутствие в большинстве культивируемых клеток экспрессии маркеров дифференцировки (СКpan и CK19) при наличии виментина как маркера «стволовости» свидетельствовало о том, что образец состоял из лимбальных стволовых клеток.

Таким образом, культивирование биоптата лимба без предварительной диссоциации клеток позволяет сохранить клеточный состав, пролиферативный потенциал и значительно увеличить скорость наращивания клеточной массы лимбальных стволовых клеток (стадия 90–100% конфлюэнтности наблюдается через неделю при культивировании биоптата и через 3 нед — при культивировании диссоциированных клеток).

Заключение. Разработанный способ культивированиямонослойного трансплантата лимбальных эпителиальных стволовых клеток на основе биорезорбируемого фибринового клеяИвисел может быть использован для разработки методалечения лимбальной недостаточности с помощью клеточных технологий.

Финансирование исследования. Исследование не финансировалось никакими источниками.

Конфликт интересов не заявляется.