Изучение биосовместимости ацеллюлярных матриксов легких приматов и возможностей их использования в качестве тканеинженерных конструкций

Последнее десятилетие характеризуется стремительным ростом как аллергической и инфекционной патологии, так и злокачественных новообразований органов дыхания, которые наряду с болезнями сердечно-сосудистой системы приобретают большую социальную значимость [1]. Существующие методы терапевтического воздействия и даже органная трансплантация не способны в полной мере решить проблему лечения хронических заболеваний органов дыхания. В связи с этим большой интерес представляет регенеративная медицина, в арсенале которой имеются потенциально новые методы лечения. Например, тканевая инженерия предлагает использование рецеллюляризированных биологических каркасов легких, полученных путем децеллюляризации от доноров, подходящих не по всем параметрам, в качестве ex vivo модели регенерации легких. При этом снижения иммуногенности каркасов и отсутствия необходимости постоянной иммуносупрессивной терапии после трансплантации предполагается достичь за счет рецеллюляризации собственными стволовыми клетками реципиента или эндогенными клетками-предшественниками [2]. Более того, органы после децеллюляризации являются перспективной моделью изучения взаимодействия клеток и внеклеточного матрикса при таких патологических изменениях легких, как эмфизема или фиброз, а также при изучении возрастных изменений [3, 4].

Биологические каркасы, полученные от мелких лабораторных животных, широко используют в качестве модели для отработки протоколов децеллюляризации и рецеллюляризации, изучения биосовместимости матриксов и межклеточного взаимодействия [5, 6]. Однако полученные на моделях грызунов результаты не всегда можно оптимально и без потери качества транслировать на более крупных животных в связи со значительными межвидовыми и физиологическими отличиями, а также техническими затруднениями [7, 8]. Это обусловливает необходимость модификации протоколов децеллюляризации органов при работе с крупными животными с последующей оценкой качества получаемых каркасов и способности к поддержанию адгезии, роста и пролиферации клеток.

Цель исследования — изучение биосовместимости ацеллюлярного матрикса на модели легких приматов, максимально приближенной к легким человека по анатомо-морфологическим характеристикам, полученного в результате децеллюляризации детергент-энзиматическим методом, а также оценка перспектив использования предложенного протокола для создания тканеинженерных конструкций.

Материалы и методы

Получение ацеллюлярного каркаса легких приматов. Для проведения децеллюляризации использовано 3 органокомплекса «сердце–легкие» взрослых самцов макак-резус (Macaca mulatta). Изъятие органов проводили на базе НИИ медицинской приматологии (Сочи) во время аутопсии, после естественной смерти животных. Органы промывали изотоническим раствором хлорида натрия и помещали в стерильный фосфатный буфер с добавлением 1% пенициллина-стрептомицина (Thermo Fisher Scientific Inc., США). Органокомплексы транспортировали в специализированном контейнере при температуре не выше 4°С в лабораторию фундаментальных исследований в области регенеративной медицины на базе Кубанского государственного медицинского университета (Краснодар), где и выполняли децеллюляризацию каркасов с последующей оценкой качества полученного матрикса. Время транспортировки не превышало 24 ч. Все манипуляции осуществляли с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ МЗ СССР №755 от 12.08.1972 г.) и Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986) после одобрения протокола исследования локальным этическим комитетом (протокол №30/1 от 2014 г.). При разработке способа децеллюляризации легких низших приматов в качестве опорного использован детергент-энзиматический метод воздействия, ранее успешно модифицированный и примененный нами для получения биологического каркаса легких крыс [6]. Модификация коснулась увеличения продолжительности экспозиции и концентрации раствора дезоксихолата натрия, а также способа введения децеллюляризирующих агентов. Кроме того, не представлялось возможным использовать систему вентиляции Harvard Inspira Advanced Safety Ventilator (Harvard Apparatus, США), предназначенную для грызунов, ввиду неэффективности обеспечиваемых ею параметров дыхательного объема и жизненной емкости легких из-за большого веса животного. В связи с этим перфузию детергентами дополнительно выполняли через трахею, с естественным оттоком, под постоянным контролем скорости и объема поступающего раствора для исключения повреждения альвеол. Концентрация дезоксихолата натрия была увеличена до 2%. Однако дополнительные методы физической децеллюляризации (например, замораживание с последующим постепенным оттаиванием) были отклонены при предварительной оценке качества каркаса вследствие выраженного повреждающего воздействия [9]. Суммарная продолжительность воздействия детергентов и энзимов составила 48 ч.

Оценка качества и биосовместимости ацеллюлярного матрикса легких приматов. Первичную морфологическую оценку качества полученных ацеллюлярных матриксов выполняли стандартными методами гистологической окраски гематоксилином и эозином и флюорофором (4’,6-диамидино-2-фенилиндола) DAPI для оценки сохранности архитектоники каркаса и эффективности элиминации ядерного материала. Количественное определение остаточной ДНК проводили колориметрическим методом на спектрофотометре NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific Inc., США) [6, 9, 10]. Количественную оценку содержания компонентов внеклеточного матрикса (гликозаминогликанов, коллагеновых волокон и фактора роста эндотелия сосудов — VEGF) до и после проведения децеллюляризации осуществляли с помощью анализа площади позитивно окрашенных участков образцов в узкой спектральной области с оптической плотностью выше пороговой на основе принципа цветовой деконволюции [11, 12]. Предварительная подготовка образцов включала окрашивание альциановым синим для качественного определения содержания гликозаминогликанов, а также проведение иммуногистохимического анализа на содержание коллагена и VEGF. В качестве первичных антител использовали поликлональные антитела в разведении 1:100 к коллагену 1-го типа (ab 34710; Abcam, США) и VEGF (ab 46154; Abcam, США) соответственно. Микрофотографии для последующего морфометрического анализа получали с помощью микроскопа Olympus IX51 с камерой Olympus XC30 (Olympus Corporation, Япония). Изображения сохраняли в формате tif размером 2080×1544 пикселей. Для анализа микрофотографий выбирали случайные поля зрения без артефактов и краевых дефектов для нативных и децеллюляризированных образцов (для каждого из 6 образцов не менее 12 полей зрения). Полученные микрофотографии обрабатывали в программе Rawtherapee для нормализации по балансу белого и экспозиции. Сравнительный морфометрический анализ выполняли с использованием разработанного нами программного обеспечения Morphostain [https://github.com/meklon/morphostain; опубликовано под свободной лицензией GNU GPL v. 3.0]. В процессе анализа выделены каналы отдельных красителей с использованием метода цветовой деконволюции [12]. После сегментации красителей автоматически определены области с интенсивностью окраски, превышающей заданный порог, затем так же рассчитана площадь окрашенных участков.

Биосовместимость каркасов тестировали при проведении XTT-тестов через 48 и 72 ч культивирования клеток на ацеллюлярном матриксе. Рецеллюляризацию опытных образцов (n=6) выполняли в статических условиях в 96-луночных планшетах. Клеточную суспензию в объеме 100 000 клеток на 200 мкл культуральной среды наносили непосредственно на поверхность каркаса. В качестве положительного контроля (n=6) использовали клетки, культивированные на пластике без биологического каркаса; в качестве негативного контроля (n=6) и для исключения фонового влияния биологического матрикса на измеряемую оптическую плотность использованы образцы ацеллюлярного матрикса легких, не заселенные клетками. В качестве клеточного ресурса выбраны мультипотентные мезенхимные стволовые клетки макак-резус 6–7-го пассажей. Клеточную принадлежность использованных для рецеллюляризации клеток верифицировали с помощью иммунофенотипирования методом проточной цитофлюориметрии и направленной дифференцировкой в три клеточные линии. Для изучения поверхностных клеточных маркеров использованы антитела к CD34 (Lot 3277660), CD45 (Lot 3095590), CD73 (Lot 2237759), CD90 (Lot 2296945), CD105 (Lot 31516310) (Beckman Coulter, США). Типирование клеточных линий выполняли дважды: непосредственно в первичной культуре и на пятом пассаже с помощью проточного цитофлюориметра Beckman Coulter (США) на базе НИИ медицинской приматологии (Сочи). Индуцированную дифференцировку проводили по стандартной методике с использованием среды StemPro (Thermo Fisher Scientific Inc., США) по примененной нами ранее технологии окрашивания с помощью Oil Red O (оценка адипогенной дифференцировки), толуидиновым синим (оценка хондрогенной дифференцировки) и ализариновым красным (оценка минерализации матрикса) [6].

Статистическая обработка данных. Выпол­нена методами вариационной статистики на персональном компьютере с использованием программного обеспечения GraphPad Prism v. 6.04 (источник — www.graphpad.com). Полученные результаты представлены в виде M±m, где M — среднее арифметическое, m — стандартная ошибка среднего. Вероятность возможной ошибки определяли по таблице t-критерия Стьюдента для парных сравнений. Для выборок, отличных от нормального распределения сравниваемых совокупностей, использован критерий Манна–Уитни. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

Результаты. Рутинные методы гистологической окраски образцов легких приматов подтвердили полное отсутствие ядер и клеточных элементов. Повреждения альвеолярной структуры и архитектоники матрикса в целом выражены незначительно (рис. 1). Количественное содержание резидуальной ДНК после децеллюляризации составило 148,3±16,22 нг/мг ткани (19,2%), в то время как в нативных легких оно равнялось 771,2±67,99 нг/мг ткани (p=0,0001). Положительное окрашивание сульфатированных гликозаминогликанов альциановым синим отмечено как на срезах нативных легких, так и в децеллюляризированных образцах. В то же время количественный пересчет площади положительного окрашивания продемонстрировал снижение уровня гликозаминогликанов после воздействия детергентов. Тенденция уменьшения содержания компонентов внеклеточного матрикса отмечалась при количественном расчете суммарной площади положительного окрашивания для VEGF, при этом статистически значимых изменений содержания коллагеновых волокон 1-го типа не обнаружено (p=0,1595, критерий Манна–Уитни) (рис. 2). Это согласуется с полученными нами ранее данными [11] по снижению содержания эластина после завершения децеллюляризации легких в результате повреждающего воздействия детергентов.

Рис. 1. Морфологическая характеристика альвеолярной структуры легких приматов до (а) и после (б) децеллюляризации; окрашивание гематоксилином и эозином; об. ×20; ок. ×10

Рис. 2. Количественная характеристика содержания белков внеклеточного матрикса нативных и децеллюляризированных легких приматов: ГАГ_НЛ и ГАГ_ДЛ — содержание гликозаминогликанов в нативных и децеллюляризированных легких; Кол 1_НЛ и Кол 1_ДЛ — содержание коллагена 1-го типа в нативных и децеллюляризированных легких; VEGF_НЛ и VEGF_ДЛ — содержание VEGF в нативных и децеллюляризированных легких; * — p=0,0001

В результате иммунофенотипирования клеток выявлено отсутствие экспрессии CD34 и CD45 и положительная экспрессия CD73, CD90 и CD105. Количественное распределение клеток в зависимости от наличия поверхностных маркеров представлено в таблице.

Иммунофенотипирование мультипотентных мезенхимных стволовых клеток (ММСК) приматов на примере трех самцов Macacca mulatta

Воздействие на клеточную культуру специализированных индукционных сред способствует направленному адипогенезу, хондрогенезу и остеогенезу, что качественно подтверждено наличием положительного окрашивания. Все это не оставляет сомнений относительно принадлежности использованной культуры к мультипотентным мезенхимным стволовым клеткам.

Результаты ХТТ-тестов на второй и третий день культивирования показали, что каркас не является токсичным, способствует адгезии, поддержанию роста и метаболической активности клеток (рис. 3).

Рис. 3. Результаты тестов на биосовместимость каркасов через 48 и 72 ч культивирования: КК — клетки на ацеллюлярном каркасе; каркас — незаселенный децеллюляризированный матрикс; клетки — контрольные клетки, культивируемые на пластике; * — p≤0,05; ** — p=0,0016

Обсуждение. Детергент-энзиматический ме­тод децеллюляризации нативных органов широко используется при получении ацеллюлярных матриксов для тканевой инженерии. Трансляция методик децеллюляризации легких мелких лабораторных животных на более крупные модели требует значительной модификации как самих протоколов получения биологических каркасов, так и способов оценки качества и биосовместимости матриксов. Ряд ведущих исследователей США и Западной Европы [13–15] предлагают несколько протоколов получения ацеллюлярного матрикса легких свиней и приматов. Однако использованные протоколы предполагают длительную обработку нативных органов растворами детергентов — от 3 до 7 сут [13–15], что создает угрозу бактериальной и вирусной контаминации получаемого матрикса. Вызывает сомнение эффективность использования забуференного 10% формалина в качестве консерванта [13] при последующей рецеллюляризации матрикса в связи с токсичностью примененного метода предварительной обработки. Кроме того, ряд исследователей используют агрессивные растворы детергентов, такие как додецилсульфат натрия, что приводит к почти полному разрушению волокон ламинина и коллагена 1-го типа и к выраженному снижению эластина и коллагена 4-го типа во внеклеточном матриксе [15]. Исследование цитотоксичности полученных каркасов зарубежные авторы [13, 15] проводили лишь путем регистрации пролиферативной активности клеток на каркасе в процессе культивирования, что занимает не менее 7 дней. Применение МТТ-теста для оценки способности клеток пролиферировать на децеллюляризированных каркасах [14] ограничено токсичностью реагентов, что оставляет простор для разработки новых методов оценки цитотоксических свойств ацеллюлярных матриксов.

Предлагаемые в данной работе использование натриевой соли дезоксихолевой кислоты в качестве основного детергента, увеличение времени экспозиции растворов и повышение их концентрации способствуют полному удалению чужеродного клеточного материала без выраженных структурных повреждений внеклеточного матрикса. Суммарная продолжительность воздействия децеллюляризирующих агентов была снижена и составила 48 ч, что уменьшило риск развития контаминации. При окрашивании альциановым синим с последующим расчетом площади положительного окрашивания образцов нативных и децеллюляризированных легких приматов отмечены значительные количественные изменения состава внеклеточного матрикса (снижение содержания сульфатированных гликозаминогликанов после децеллюляризации), которые невозможно было установить при проведении окрашивания тех же образцов альциановым синим с проведением качественной визуальной оценки результатов. Выявленные изменения не ухудшают биосовместимость каркасов и не влияют на клеточную активность, хотя и снижают комплаенс легочной ткани после децеллюляризации. В связи с этим требуется разработка методов обогащения каркасов после децеллюляризации. XTT-тест, использованный авторами для оценки метаболической активности и жизнеспособности клеток на каркасах, позволил оценить цитотоксические свойства каркасов в максимально короткие сроки. Полученные матриксы не обладали токсическими свойствами и не угнетали пролиферативную и метаболическую активность клеток.

Заключение. Проведенные исследования по получению и изучению биосовместимости ацеллюлярных матриксов легких приматов являются важным этапом на пути создания трехмерных биологических каркасов. Отсутствие цитотоксических свойств децеллюляризированных матриксов, их способность поддерживать клеточный рост и создавать надлежащее микроокружение на модели легких приматов, максимально приближенной по анатомо-морфологическим особенностям к человеку, свидетельствуют о потенциальной возможности клинического применения тканеинженерных конструкций легких.

Финансирование исследования. Работа выполнена в рамках комплексной НИР «Клеточные механизмы регенерации интраторакальных органов и тканей. Разработка тканеинженерных конструкций с использованием биологических и синтетических каркасов».