Атомно-силовая микроскопия — дополнительный метод в биомедицинских морфологических исследованиях

Timashev P.S., Koroleva A.V., Konovalov N.A., Kotova S.L., Solovieva A.B.

Ключевые слова: атомно-силовая микроскопия; внеклеточный матрикс; коллаген; соединительная ткань; фликкер-шумовая спектроскопия; наномеханика; PeakForce QNM®.

Цель исследования — продемонстрировать потенциал атомно-силовой микроскопии (АСМ) в диагностике морфологических изменений во внеклеточном матриксе (ВКМ) соединительной ткани, связанных с патологическими процессами. Представлен авторский опыт по применению АСМ в биомедицинских исследованиях заболеваний соединительной ткани как в научных, так и в клинических целях.

Материалы и методы. В зависимости от области применения (экспериментальное или клиническое) образцы получали или от экспериментальных животных, или от пациентов при хирургическом вмешательстве, или post mortem.

АСМ-изображения фиксированных срезов ткани получали на микроскопе Solver P47 в полуконтактной моде. Для картирования механических свойств изображения получали на воздухе в моде PeakForce Quantitative Nanomechanical Mapping (PeakForce QNM^®) на атомно-силовом микроскопе MultiMode 8 (Bruker, США). Области интереса для сканирования выбирали в соответствии с гистологическими отнесениями для образца на основе изображения этого образца в оптическом микроскопе, совмещенном с атомно-силовым микроскопом. Для количественной параметризации изменений морфологии ВКМ, визуализированных с помощью АСМ, использовали фликкер-шумовую спектроскопию.

Результаты. Показано, что АСМ обнаруживает видимые отклонения от нормальной морфологии ВКМ в патологических тканях. АСМ и смежные методики могут прослеживать связанные с патологией изменения на разных уровнях организации коллагена в ВКМ. В микромасштабе АСМ способна детектировать разрыхление и дезорганизацию коллагеновых волокон или обратный процесс их упаковки в плотные параллельные пучки при фиброзе. АСМ может также определять соотношение между коллагеновыми и неволокнистыми компонентами матрикса, например при воспалительном или опухолевом процессе. На уровне коллагеновых фибрилл АСМ может обнаруживать ранние признаки деструкции и ремоделинга ВКМ, невидимые на уровне оптической микроскопии. Параметры фликкер-шумовой спектроскопии обеспечивают количественное описание морфологических изменений, обнаруживаемых АСМ-визуализацией. Методы PeakForce QNM^® и наноиндентирования позволяют получить дополнительные данные об изменениях ВКМ по изменению их наномеханических и адгезионных свойств.

Данные всех АСМ-исследований хорошо коррелируют с результатами гистологических исследований и зачастую имеют большую чувствительность к патологическим изменениям ВКМ.

Заключение. АСМ может служить ценным дополнительным диагностическим методом для отслеживания патологических изменений в соединительной ткани.

Литература

Frantz C., Stewart K.M., Weaver V.M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci 2010; 123(24): 4195–4200, https://doi.org/10.1242/jcs.023820.
Orgel J.P.R.O., Irving T.C., Miller A., Wess T.J. Microfibrillar structure of type I collagen in situ. Proc Natl Acad Sci USA 2006; 103(24): 9001–9005, https://doi.org/10.1073/pnas.0502718103.
Kuznetsov S.S., Dudenkova V.V., Kochueva M.V., Kiseleva E.B., Ignatieva N.Yu., Zakharkina O.L., Sergeeva E.A., Babak K.V., Maslennikova А.V. Multiphoton microscopy in the study of morphological characteristics of radiation-induced injuries of the bladder. Sovremennye tehnologii v medicine 2016; 8(2): 31–39, https://doi.org/10.17691/stm2016.8.2.04.
Mamalis A., Ho D., Jagdeo J. Optical coherence tomography imaging of normal, chronologically aged, photoaged and photodamaged skin. Dermatol Surg 2015; 41(9): 993–1005, https://doi.org/10.1097/dss.0000000000000457.
Maver U., Velnar T., Gaberšček M., Planinšek O., Finšgar M. Recent progressive use of atomic force microscopy in biomedical applications. Trends Analyt Chem 2016; 80: 96–111, https://doi.org/10.1016/j.trac.2016.03.014.
Graham H.K., Hodson N.W., Hoyland J.A., Millward-Sadler S.J., Garrod D., Scothern A., Griffiths C.E., Watson R.E., Cox T.R., Erler J.T., Trafford A.W., Sherratt M.J. Tissue section AFM: in situ ultrastructural imaging of native biomolecules. Matrix Biol 2010; 29(4): 254–260, https://doi.org/10.1016/j.matbio.2010.01.008.
Wen C.Y., Wu C.B., Tang B., Wang T., Yan C.H., Lu W.W., Pan H., Hu Y., Chiu K.Y. Collagen fibril stiffening in osteoarthritic cartilage of human beings revealed by atomic force microscopy. Osteoarthritis Cartilage 2012; 20(8): 916–922, https://doi.org/10.1016/j.joca.2012.04.018.
Stolz M., Gottardi R., Raiteri R., Miot S., Martin I., Imer R., Staufer U., Raducanu A., Düggelin M., Baschong W., Daniels A.U., Friederich N.F., Aszodi A., Aebi U. Early detection of aging cartilage and osteoarthritis in mice and patient samples using atomic force microscopy. Nat Nanotechnol 2009; 4(3): 186–192, https://doi.org/10.1038/nnano.2008.410.
Rigozzi S., Müller R., Stemmer A., Snedeker J.G. Tendon glycosaminoglycan proteoglycan sidechains promote collagen fibril sliding — AFM observations at the nanoscale. J Biomech 2013; 46(4): 813–818, https://doi.org/10.1016/j.jbiomech.2012.11.017.
Wallace J.M. Applications of atomic force microscopy for the assessment of nanoscale morphological and mechanical properties of bone. Bone 2012; 50(1): 420–427, https://doi.org/10.1016/j.bone.2011.11.008.
Sivasankar M., Ivanisevic A. Atomic force microscopy investigation of vocal fold collagen. Laryngoscope 2007; 117(10): 1876–1881, https://doi.org/10.1097/mlg.0b013e3180caa1df.
Lee S.J., Choi S., Kim M.S., Cheong Y., Kwak H.W., Park H.K., Jin K.H. Short-term effect of cryotherapy on human scleral tissue by atomic force microscopy. Scanning 2012; 35(5): 302–307, https://doi.org/10.1002/sca.21068.
Thomasy S.M., Raghunathan V.K., Winkler M., Reilly C.M., Sadeli A.R., Russell P., Jester J.V., Murphy C.J. Elastic modulus and collagen organization of the rabbit cornea: Epithelium to endothelium. Acta Biomaterialia 2014; 10(2): 785–791, https://doi.org/10.1016/j.actbio.2013.09.025.
Sridharan I., Ma Y., Kim T., Kobak W., Rotmensch J., Wang R. Structural and mechanical profiles of native collagen fibers in vaginal wall connective tissues. Biomaterials 2012; 33(5): 1520–1527, https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2011.11.005.
Jorba I., Uriarte J.J., Campillo N., Farré R., Navajas D. Probing micromechanical properties of the extracellular matrix of soft tissues by atomic force microscopy. J Cell Physiol 2017; 232(1): 19–26, https://doi.org/10.1002/jcp.25420.
Kwok J., Grogan S., Meckes B., Arce F., Lal R., D’Lima D. Atomic force microscopy reveals age-dependent changes in nanomechanical properties of the extracellular matrix of native human menisci: implications for joint degeneration and osteoarthritis. Nanomedicine 2014; 10(8): 1777–1785, https://doi.org/10.1016/j.nano.2014.06.010.
Kotova S.L., Timashev P.S., Guller A.E., Shekhter A.B., Misurkin P.I., Bagratashvili V.N., Solovieva A.B. Collagen structure deterioration in the skin of patients with pelvic organ prolapse determined by atomic force microscopy. Microsc Microanal 2015; 21(2): 324–333, https://doi.org/10.1017/s1431927615000148.
Timashev P.S., Kotova S.L., Belkova G.V., Gubar’kova E.V., Timofeeva L.B., Gladkova N.D., Solovieva A.B. Atomic force microscopy study of atherosclerosis progression in arterial walls. Microsc Microanal 2016; 22(2): 311–325, https://doi.org/10.1017/s1431927616000039.
Choy J.S., Mathieu-Costello O., Kassab G.S. The effect of fixation and histological preparation on coronary artery dimensions. Ann Biomed Eng 2005; 33(8): 1027–1033, https://doi.org/10.1007/s10439-005-4854-4.
Dorph-Petersen K.-A., Nyengaard J.R., Gundersen H.J.G. Tissue shrinkage and unbiased stereological estimation of particle number and size. J Microsc 2001; 204(3): 232–246, https://doi.org/10.1046/j.1365-2818.2001.00958.x.
Mirsaidov U., Timashev S.F., Polyakov Y.S., Misurkin P.I., Musaev I., Polyakov S.V. Analytical method for parameterizing the random profile components of nanosurfaces imaged by atomic force microscopy. Analyst 2011; 136(3): 570–576, https://doi.org/10.1039/c0an00498g.