Фенотипические особенности поведения мышей с нокаутом по гену Sip1

Введение

Пороки развития головного мозга в настоящее время все чаще стали исследоваться в качестве причины эпилепсии, задержки в развитии, неврологического дефицита и умственной отсталости у человека [1]. В последнее время значительный прогресс достигнут в определении генов, которые контролируют различные аспекты развития коры [2, 3]. Поэтому выявление и характеристика мутантных мышей с пороками развития коры, идентификация и характеристика генов, отвечающих за эти мутации, а также изучение влияния этих генов на поведение позволят значительно улучшить понимание генетической регуляции развития коры и последующих нарушений в работе мозга.

Ген Sip1 кодирует важный транскрипционный фактор в организме млекопитающих. Показано, что он играет критическую роль в регуляции процессов эпителиально-мезенхимального перехода во время эмбриогенеза и при развитии опухолей [4], в процессах миграции эктодермальных маркеров при развитии хрусталика глаза [5]. Нокаут по Sip1 приводит к гиперчувствительности кожи, атрофическим рубцам и гипермобильности суставов, связанной с нарушением процесса коллагенового фибриллогенеза [6]. Кроме того, Sip1 является важнейшим транскрипционным фактором, регулирующим основные аспекты развития ЦНС. Установлено, что мутации в человеческом гене Sip1 вовлечены в патогенез синдрома Мовата–Вильсона, характеризующегося тяжелой умственной отсталостью и агенезией мозолистого тела [7]. Ген Sip1 необходим для формирования внутрикортикальных, межкорковых и кортико-подкорковых связей в переднем мозге мышей. Удаление его из всех постмитотических нейронов в неокортексе приводит к нарушению формирования мозолистого тела, передней комиссуры и образования кортикоспинального тракта [8].

Нокаут по определенному гену является удобной моделью для исследования роли продукта данного гена в живом организме. Известно, что частичная мутация гена Sip1 приводит к изменению NMDA- и AMPA-рецепторов в нейронах неокортекса in vitro. Такие нейроны более чувствительны к воздействию NMDA- и AMPA-агонистов в сравнении с данными мышей дикого типа (WT) [9]. В нашей работе исследования проводились на кондициональном мутанте с удалением гена Sip1 из постмитотических клеток коры головного мозга. Поведенческое фенотипирование является необходимым этапом для дальнейшего исследования данной линии мышей и вклада гена Sip1 в реализацию сенсомоторных функций и функционального состояния нервной системы.

Цель исследования — поведенческое фенотипирование мышей, гомо- и гетерозиготных по гену Sip1, играющему важнейшую роль в развитии коры головного мозга млекопитающих.

Материалы и методы

Исследования проводили на базе SPF вивария Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского. При работе с животными руководствовались «Правилами для проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Россия, 2010) и «Международными рекомендациями (этический кодекс) по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (CIOMS и ICLAS, 2012), при этом неукоснительно соблюдались этические принципы, установленные Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (Страсбург, 2006). На проведение экспериментальных исследований на животных получено разрешение Этического комитета Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского.

Животные. Для создания линии мышей, мутантных по гену Sip1, использовали метод Cre-рекомбинации, в ходе которой ген Sip1, фланкированный loxP-сайтами, при экспрессии Cre-белка в нейроне вырезался из ДНК. Мышиная линия c фланкированным геном Sip1 впервые была получена Y. Higashi с соавт. [10]. Экзон 7 гена Sip1 длиной 2 Кбайта содержит примерно половину белковой кодирующей последовательности. Делеция экзона 7 приводит к преждевременной терминации трансляции, вызванной сдвигом рамки считывания в следующем экзоне 8. В данной мышиной линии экзон 7 фланкирован loxP-сайтами, что ведет к инактивации белка после Cre-опосредованного удаления этого экзона. Для генерации кондиционального мутанта с удаленным геном Sip1 из постмитотических клеток коры головного мозга мыши Sip1 fl/fl были скрещены с мышами NexCre [11–13]. У этих мышей Cre-рекомбиназа экспрессируется под Nex-промотором, который обеспечивает экспрессию только в постмитотических клетках неокортекса. При этом формируются две группы мутантных животных: гомозиготные (ген Sip1 не представлен в обоих аллелях) и гетерозиготные (ген Sip1 не представлен в одном аллеле) — по данному гену.

Все исследования проводили на мышах, гетеро- (+/–) и гомозиготных (–/–) по гену Sip1, их поведение сравнивали с поведением животных дикого типа.

Все мыши были в возрасте 20–30 дней при проведении аудиогенной стимуляции и 2 мес (массой 21–25 г) — при проведении остальных тестов. С момента отсадки от матерей животные содержались группами в индивидуально вентилируемых клетках (Techniplast, Италия) при 12-часовом цикле день/ночь, температуре 22°С и влажности воздуха 65%; доступ к пище и воде был свободным. Все поведенческие исследования проводили в течение световой фазы цикла — с 10 до 15 ч дня.

Тестирование поведения животных

Аудиогенная стимуляция. В 20–30-дневном возрасте все самцы и самки мышей из пометов подвергались аудиогенной стимуляции. Их помещали в стеклянную круглую колбу, которая располагалась в звукоизолирующем боксе с двойными стенками, изготовленном из пенополистирола. После одноминутной адаптации в боксе включался электромеханический звонок с интенсивностью звука 110 дБ. Звук подавался однократно и выключался сразу после возникновения судорожного припадка или через 60 с после включения [14]. Фиксацию поведения проводили с помощью видеокамеры Microsoft LifeCam MSCR-LC-Cinema (Microsoft, США). Степень проявления аудиогенных судорог в ответ на звуковую стимуляцию оценивали по следующей шкале [15]:

0 баллов — отсутствие реакции на звук в течение 60 с;

1 балл — фаза «манежного бега», или двигательного возбуждения, когда животные совершали неконтролируемые движения в камере после начала стимуляции;

2 балла — начало клонических судорог с падением животного на брюшко (начало судорог);

3 балла — падение на бок, клонические судороги передних и задних конечностей;

4 балла — тонические судороги передних конечностей, клонус задних конечностей;

5 баллов — тонические судороги передних и задних конечностей, сопровождающиеся ригидностью всего тела животного.

Далее для исследования поведения взрослых животных в различных тестах были взяты только двухмесячные самцы, поскольку известно о влиянии половых гормонов и фазы эстрального цикла на поведение и способность к обучению у самок [16]. Оценивали следующие показатели: масса тела, наличие на теле проплешин, присутствие физических аномалий, вздыбливание шерсти, повреждение вибрисс [17]. После чего проводили поведенческое фенотипирование в следующей последовательности: неврологическое и сенсомоторное исследование (координации, лазания, локомоторных и ориентировочных реакций); тест «свет–темнота» (изучение тревожности); тест «открытое поле» (изучение двигательной и ориентировочно-исследовательской активности); акустическая реакция вздрагивания и престимульное ингибирование — PPI (исследование сенсомоторной фильтрации); тест Кроули (исследование социальной активности и направленности животного на получение нового социального опыта); формирование условной реакции пассивного избегания (способность к обучению).

Сенсомоторное исследование. Тест включал в себя оценку моторных функций и некоторых рефлексов. Для проверки рефлекса разведения задних конечностей мышь подвешивали за хвост в течение 1 мин. Нормальная реализация данного рефлекса предполагает разведение задних конечностей в разные стороны от средней линии живота, а сокращение одной конечности в сторону средней линии живота или сцепление конечностей (hind limb clasping) рассматривается как патология [17].

Для выявления дефицита моторной координации и равновесия использовали набор сенсомоторных тестов «прогулка по приподнятой перекладине». В течение эксперимента фиксировали время, затраченное животным на выполнение каждой из поставленных задач. Максимальное время выполнения задачи составляло 120 с. Мыши были подвергнуты тестированию по следующим критериям:

1. Способность к движению. Животное помещали на ровную поверхность, фиксировали время, за которое данная особь выходила из круга диаметром 30 см.

2. Движение по перекладинам. Использовали плоские перекладины шириной 1, 2 и 3 см и круглые — диаметром 3 и 0,5 см. Мышь помещали на середину перекладины 50 см длиной, концы которой находились на двух платформах высотой 50 см над мягким основанием. Фиксировали латентный период достижения платформы. Если животное падало, время считалось равным 120 с.

3. Удерживание за провод. Мышь подвешивали передними лапами за горизонтальный провод, расположенный между двумя платформами на высоте 50 см над мягким основанием. Фиксировали время до падения.

4. Поворот в цилиндре. Мышь помещали в замкнутый цилиндр (3 см диаметром и 13 см длиной) носом к закрытой стенке цилиндра. Фиксировали время до разворота в противоположную сторону.

5. Поворот на наклонном экране. Мышь помещали мордочкой вниз в центр наклонного экрана (платформа из проволочной сетки размером 20×20 см) на высоте 50 см над столом под углом 45°. Фиксировали время до разворота вверх на 180°.

Тест «свет–темнота». Поведенческая модель исследования тревожности в данном тесте основана на изучении ситуативной тревожности [18]. Исследование поведения проходило в установке, состоящей из светлого (25×25×24 см) и темного (19×11×12 см) отсеков, соединенных между собой перегородкой с отверстием (Panlab/Harvard Apparatus, Испания). Мышь помещали в светлый отсек спиной к темному отсеку и в течение 10 мин автоматически фиксировали следующие показатели: латентный период первого захода в темный отсек, время нахождения мыши в светлом и темном отсеках, а также количество переходов между отсеками.

Тест «открытое поле». Для изучения двигательной и ориентировочно-исследовательской активности при помещении в новое открытое пространство использовали тест «открытое поле», который проводили в инфракрасном актиметре (Panlab/Harvard Apparatus, Испания) с программным обеспечением ActiTrack. Установка представляет собой квадратную арену 40×40 см с бортиками высотой 20 см и включает две квадратные рамы и систему инфракрасных лучей для определения местонахождения животного. Животное помещали в центр арены, наблюдение за поведением осуществляли в течение 5 мин. Для анализа поведения установка виртуально была поделена на две зоны: центральную (20×20 см) и периферическую. Автоматически регистрировались следующие показатели: общее пройденное расстояние; расстояние, пройденное в каждой зоне; общее количество вертикальных стоек; количество вертикальных стоек в каждой зоне; средняя скорость движения (см/с); а также количество актов дефекации и мочевых точек, что является показателем, характеризующим уровень «эмоциональности» животного.

Акустическая реакция вздрагивания и престимульное ингибирование. Установка для исследования стартл-рефлекса (Panlab/Harvard Apparatus, Испания) создает любые комбинации звуков, шумов и белого шума. Экспериментальное животное помещали в эту установку в специальном боксе для фиксации правильного положения мыши в ней. Вздрагивание животного регистрировали при помощи измерения изменения силы давления животного на решетку под ним. Регистрация велась автоматически с использованием компьютерного обеспечения Packwin (Panlab/Harvard Apparatus, Испания), в котором реализовывался протокол эксперимента. После трехминутного периода привыкания животному на фоне белого шума (60 дБ) подавался следующий набор сигналов:

отсутствие звукового стимула — 5 раз;

престимул (80 дБ) — 5 раз;

стимул (100 дБ) — 5 раз;

последовательное предъявление престимула и стимула с интервалом 60 мс — 5 раз.

Данные сигналы подавались в случайном порядке, при этом измерялось вздрагивание животного в ответ на звуковой стимул. Величину PPI рассчитывали по формуле:

PPI=(Р–РР)/Р·100%,

где P — реакция вздрагивания на стимул, PP — реакция вздрагивания на последовательное предъявление престимула и стимула.

Исследование социального взаимодействия в тесте Кроули. Рабочая установка представляет собой прямоугольный бокс с высокими прозрачными стенками, разделенный на три отсека прозрачны­ми пере­городками (Panlab/Harvard Apparatus, Испа­ния). В крайних отсеках располагаются одинаковые проволочные цилиндры. Над установкой закреплена видеокамера Smart (Panlab/Harvard Apparatus, Испания) для регистрации перемещений и скорости животного в режиме реального времени.

Эксперимент проводили в три этапа.

1-й этап — экспериментальное животное помещается в центральный отсек и в течение 5 мин находится в установке; данный этап направлен на ознакомление животного с установкой.

2-й этап — в цилиндр 1 помещается незнакомое животное (партнер 1), экспериментальное животное в течение 8 мин находится в установке в центральном отсеке; данный этап направлен на исследование социального интереса животного.

3-й этап — в цилиндр 2 помещается другое незнакомое животное (партнер 2), экспериментальное животное в течение 8 мин находится в центральном отсеке установки; данный этап направлен на исследование социальной памяти и направленности животного на получение нового опыта.

Регистрировали время нахождения животного в каждом из трех отсеков установки и количество входов в каждый отсек [19, 20].

Условная реакция пассивного избегания. Пове­денческая модель условной реакции (рефлекса) пассивного избегания (УРПИ) напоминает обусловленный контекстом страх и является базисной моделью для оценки влияния различных факторов на формирование и воспроизведение памятного следа в норме и в условиях его нарушения (амнезия). Условный рефлекс вырабатывали в камере Shuttle Box LE918 (Panlab/Harvard Apparatus, Испания), состоящей из освещенного и темного отсеков (каждый размером 25×40×25 см) с полом из металлических прутьев, разделенных гильотинной дверцей.

Эксперимент проводили в два этапа.

1-й этап — выработка УРПИ: экспериментальное животное помещается в освещенный отсек хвостом к закрытой двери, через 120 с гильотинная дверца открывается, и животное в силу врожденного норкового рефлекса переходит в темную часть камеры (регистрируется время этого перехода — латентный период 1, ЛП1). Сразу после этого дверца между отсеками закрывается и через металлические прутья пола камеры животному наносится электрокожное раздражение (0,3 мА; 3 с).

2-й этап — воспроизведение: через 24 ч проводится тестирование выработанного навыка, для чего экспериментальное животное помещается в освещенный отсек при открытой дверце и фиксируется время перехода животного в темную камеру (латентный период 2, ЛП2). Время наблюдения составляет 180 с.

О степени запоминания животными электрошока судят по разности латентных периодов до перехода в темную камеру при выработке УРПИ и при тестировании его сохранности (∆ЛП).

Статистика. Результаты представляли в виде среднего ± ошибка среднего и сравнивали с помощью одно- и двухфакторного ANOVA (F) с последующим post/hoc сравнением выборочных средних (тест Ньюмена–Кеулса).

Результаты

Аудиогенная стимуляция. На протяжении эксперимента было протестировано всего 79 самцов и самок мышей в возрасте 20–30 дней (табл. 1). После аудиогенной стимуляции всего выявлено 2 животных с «манежным бегом» (1 балл), 1 животное с асимметричными тоническими судорогами передних конечностей и клоническими судорогами задних конечностей с падением на бок (4 балла) (рис. 1). Влияния наличия мутантного аллеля гена Sip1 на предрасположенность животных к аудиогенным припадкам не обнаружено (F_2,73=0,24; p=0,79).

---

Таблица 1. Результаты аудиогенной стимуляции мышей, мутантных по гену Sip1 и WT

---

Рис. 1. Этапы аудиогенных судорог у мышей: а — 3 балла, падение животного на бок, клонические судороги передних и задних конечностей (стрелки); б — 4 балла, асимметричные тонические судороги передних конечностей (стрелка) и клонические судороги задних конечностей с падением животного на бок

---

Показатели общего здоровья, рефлексы. При исследовании показателей общего здоровья мышей группы Sip1(+/–) не выявлено физических аномалий, изменений в массе тела животных, состоянии шерсти, однако у 14% самцов обнаружилось отсутствие вибрисс. Кроме того, нарушение рефлекса разведения задних лап встречалось в этой группе чаще (21%) по сравнению с группой WT (0%) (рис. 2, табл. 2).

---

Рис. 2. Нарушение рефлекса разведения задних конечностей у мышей, гетерозиготных по гену Sip1(+/–) (hindlimb clasping): а — норма; б, в — варианты нарушения рефлекса разведения конечностей

---

Таблица 2. Показатели общего здоровья и результаты сенсомоторного тестирования мышей, мутантных по гену Sip1 и WT

---

Мыши, гомозиготные по гену Sip1, не доживали до двухмесячного возраста: средняя продолжительность их жизни составила 39±13 дней, поэтому дальнейшее исследование поведения проводилось только в группе самцов с генотипом Sip1(+/–) в сравнении с WT.

Исследование способностей животных к выполнению сенсомоторных задач показало отсутствие разницы между генотипами в тестах: время выхода из круга (F_1,28=1,72; р=0,19), скорость прохождения плоских перекладин шириной 3 см (F_1,28=1,16; р=0,29), 2 см (F_1,28=0,07; р=0,78), 1 см (F_1,28=0,56; р=0,46), скорость прохождения круглых перекладин диаметром 3 см (F_1,28=0,09; р=0,76) и 0,5 см (F_1,28=0,68; р=0,42), способность удержаться за провод (F_1,28=0,25; р=0,62), скорость поворота на наклонном экране (F_1,28=1,27; р=0,27) и разворот в цилиндре (F_1,28=1,56; р=0,22).

Тест «свет–темнота». Исследова­ние поведения животных в этом тесте выявило отсутствие различий между самцами групп Sip1(+/–) и WT по показателям латентного времени перехода в темный отсек (F_1,12=0,23; p=0,64) и количеству переходов между отсеками (F_1,12=2,48; p=0,14). Однако при исследовании времени, проводимого в светлом и темном отсеках, обнаружено, что самцы Sip1(+/–) проводили больше времени в темном отсеке (276,1±15,2 с) по сравнению с группой WT (204,7±15,2 с) (F_1,12=5,66; p=0,03).

Тест «открытое поле». Животные Sip1(+/–) не отличались от животных группы WT по показателям двигательной активности: общему пройденному расстоянию (F_1,48=1,65; p=0,21), средней скорости передвижения (F_1,48=1,7; p=0,19), а также по ориентировочно-исследовательской активности — общему количеству вертикальных стоек (F_1,48=2,3; р=1,14). Кроме того, не выявлено разницы в эмоциональном поведении этих животных, о чем свидетельствует равное количество дефекаций (F_1,48=3,50; p=0,07) и мочевых точек (F_1,48=1,03; p=0,32). Однако более детальный анализ поведения показал снижение числа вертикальных стоек в центре поля у мышей Sip1(+/–) (0,3±0,1) по сравнению с группой WT (2,7±0,8) (F_1,48=6,18; р=0,02).

Стартл-рефлекс. Мыши Sip1(+/–) не отличались от группы WT по выраженности акустической реакции вздрагивания (F_1,20=0,14; p=0,07), при этом значение PPI у них также не менялось (F_1,20=0,35; p=0,56).

Социальное взаимодействие. При исследовании социального интереса у животных обнаружено влияние наличия незнакомого партнера на время, проводимое в отсеке (F_1,26=8,67; p=0,007), и количество входов в отсек (F_1,26=7,53; p=0,01) (табл. 3). При этом самцы Sip1(+/–) проводили меньше времени в отсеке с незнакомым партнером (партнер 1) по сравнению с животными группы WT (p=0,03) и совершали большее количество входов в пустой отсек, чем в отсек с незнакомым партнером. Исследование социальной памяти не обнаружило различий между генотипами (F_1,26=0,01; p=0,91): самцы Sip1(+/–) и WT проводили больше времени в отсеке с новым незнакомым партнером (партнер 2), чем в отсеке с уже известным партнером (партнер 1) (p=0,005).

---

Таблица 3. Показатели поведения мышей в тесте социального взаимодействия

---

Условная реакция пассивного избегания. Анализ поведения мышей при выработке рефлекса пассивного избегания выявил увеличение латентного периода перехода в темный отсек на 2-й день по сравнению с 1-м у животных обеих групп (F_1,86=68,11; p<0,001) (рис. 3). При этом не обнаружено разницы латентных периодов перехода в темный отсек у мышей Sip1(+/–) и WT (F_1,43=0,02; p=0,89), что свидетельствует о равной способности к обучению.

---

Рис. 3. Время перехода в темный отсек при выработке условной реакции пассивного избегания у мышей Sip1(+/–) и WT; * — статистически значимая разница значений в 1-й и 2-й дни; p<0,05

---

Обсуждение результатов

Данная работа посвящена выявлению влияния наличия мутантного аллеля гена Sip1 на показатели здоровья и функциональное состояние ЦНС мышей. Современный протокол по поведенческому фенотипированию мутантных линий мышей (SHIRPA-протокол) включает более 40 пунктов и позволяет выполнять скрининг с выявлением различных нарушений в нервно-мышечной, сенсорной и вегетативной системах организма [21].

На 1-м этапе проводилась предварительная оценка общего здоровья животных, моторных и сенсорных функций, которая позволяет избежать ложной интерпретации результатов более сложных поведенческих задач. У всех исследуемых мышей наблюдалось хорошее состояние шерстного покрова, отсутствие лысин и вздыбливания шерсти.

В отсутствие патологии поднятые за хвост взрослые грызуны, которых медленно опускают к горизонтальной поверхности, разводят все четыре конечности в ожидании контакта [22]. Наличие одного мутантного аллеля исследуемого нами гена Sip1 приводило к нарушению у животных рефлекса разведения конечностей (см. рис. 2). Такая же картина отмечена у мышей с поражениями мозжечка, базальных ганглиев и неокортекса, а также у трансгенных моделей болезни Альцгеймера [22]. Исследователи полагают, что лежащий в основе этих нарушений механизм, который включает церебелло-кортикоретикулярные и кортико-стриато-паллидоретикулярные пути, может быть связан с изменениями в передаче норадреналина и серотонина. Кроме того, для мышей c отсутствием гена Atg7, демонстрирующих нарушение рефлекса разведения конечностей, был показан специфический дефицит ЦНС, обусловленный дегенерацией неокортекса и мозжечка [23]. Сцепленность конечностей и позу летучей мыши демонстрировали трансгенные мыши с экспрессией цитоплазменного прионного белка Prp, у которых было обнаружено уменьшение толщины неокортекса [24].

Нельзя исключить, что обнаруженное нами отсутствие вибрисс у мышей Sip1(+/–) могло повлиять на результаты поведенческого тестирования животных. Известно, что дефицит сенсорной информации в раннем возрасте способен оказать влияние на реализацию поведения во взрослом состоянии. Для крыс, у которых была произведена обрезка вибрисс с 0-го по 3-й постнатальные дни, были характерны аномальные структура и функция соматосенсорной системы, а поведение отличалось более высокой исследовательской активностью и частыми социальными взаимодействиями [25]. Однако другой группой ученых показано, что исследовательская активность взрослых крыс линии Wistar, у которых были обрезаны вибриссы в период с 9-го по 20-й постнатальный день, характеризовалась более низкой внутригрупповой изменчивостью по сравнению с контрольными крысами [26], а выстригание вибрисс со 2-го по 9-й день жизни не вызывало подобных изменений [27]. Следовательно, именно с отсутствием вибрисс может быть связано обнаруженное нами снижение количества вертикальных стоек в центральной части поля у мышей Sip1(+/–) в тесте «открытое поле».

Как уже было сказано, пороки развития головного мозга в настоящее время стали чаще исследоваться в качестве причины эпилепсии, задержки в развитии, неврологического дефицита и умственной отсталости у человека [1]. Аудиогенные судороги, развивающиеся рефлекторно у грызунов в ответ на звуковую стимуляцию, считаются одной из наиболее популярных и адекватных экспериментальных моделей генерализованной конвульсивной эпилепсии у человека [15, 28]. В нашей работе мы не обнаружили влияния наличия мутантного аллеля гена Sip1 на предрасположенность животных к аудиогенным припадкам.

Для оценки уровня тревожности животных использовали тест «свет–темнота», где основными показателями являются время нахождения в светлом и темном отсеках, а также количество переходов между ними [29]. Исследуемые самцы Sip1(+/–) проводили больше времени в темном отсеке, что свидетельствует о повышенной тревожности животных.

Тест «открытое поле» является широко используемым для исследования двигательной активности (пройденное расстояние), исследовательской активности (количество вертикальных стоек) и тревожности (время, проведенное в центре поля) в условиях мягкого стресса [30, 31]. Мыши Sip1(+/–) совершали достоверно меньше вертикальных стоек в центре поля по сравнению с животными группы WT, что косвенно свидетельствует об их повышенной тревожности и согласуется с данными, полученными нами в тесте «свет–темнота».

Исследование реакции вздрагивания используется для изучения многих свойств ЦНС, в том числе привыкания к звуку и престимульного торможения (снижение амплитуды вздрагивания после предварительного подпорогового стимула, что отражает функцию фильтрации сенсорных входов в ЦНС), которые нарушаются при шизофреноподобных состояниях. Исследование PPI предполагает, что вздрагивание животного в ответ на последовательное предъявление престимула и стимула с интервалом 60 мс будет меньше, чем вздрагивание животного в ответ на одиночный стимул. Рефлекс вздрагивания — это относительно простой рефлекс скелетной мускулатуры, который является следствием испуга и, по-видимому, служит для предотвращения потенциального повреждения организма [32, 33]. Отсутствие изменений величины реакции вздрагивания и PPI у мышей Sip1(+/–) свидетельствует о нормальном слуховом восприятии и отсутствии изменений выраженности эмоционального состояния страха у данных животных.

Для оценки влияния мутантного аллеля гена Sip1(+/–) на когнитивные функции и способность животных к обучению проанализировано сохранение следов памяти при выработке условного рефлекса пассивного избегания. Полученные результаты разницы латентных периодов перехода в темный отсек в 1-й и 2-й день исследования свидетельствуют о равной способности мышей групп Sip1(+/–) и WT к обучению.

Следующий этап поведенческого фенотипирования представлял собой оценку более тонких функциональных особенностей нервной системы, связанных с индивидуальным и социальным поведением животных.

Социальное поведение — это поведение, требующее для своей реализации по крайней мере еще одного представителя своего вида. Сюда относят все варианты межсамцовых взаимодействий, репродуктивное (половое) и родительское поведение [34]. Понятие «социальное узнавание» как феномен и экспериментальная парадигма было введено в употребление в 1980-е гг. [35]. Оно основано на безусловном поведенческом ответе (интересе) животного при подсадке незнакомого партнера. При исследовании социального интереса и социального распознавания нового объекта нами обнаружено снижение реакции социальной активности у мышей Sip1(+/–) по сравнению с WT: при наличии незнакомого социального партнера мыши предпочитали находиться в пустом отсеке. Исследование направленности животных на получение нового социального опыта не выявило отличий группы Sip1(+/–) от контрольной. Поведение экспериментальных животных соответствовало норме: мышь стремилась больше времени провести с новым животным, чем с уже знакомым ей по предыдущему этапу. Это говорит об отсутствии нарушений социальной памяти.

К похожим результатам пришла группа японских ученых при попытке создания модели синдрома Мовата–Вильсона, обнаружив, что мыши Sip1 демонстрируют повышенную тревожность и нарушение коммуникативных способностей [36], но, в отличие от наших результатов, эта группа показала снижение двигательной активности у мышей. Скорее всего, такое различие связано с тем, что время тестирования в тесте «открытое поле» у данных авторов составило 1 ч.

Проведенное исследование позволяет предположить, что молекулярный механизм участия гена Sip1 в регуляции сенсомоторных функций и тревожности мышей может заключаться в следующем. Транскрипционный фактор Sip1 имеет высокий уровень экспрессии в постмитотических нейронах неокортекса. Кондициональная делеция Sip1 в молодых нейронах вызывает преждевременную генерацию нейронов верхних слоев за счет нейронов нижних слоев, преждевременную и усиленную генерацию глиальных предшественников и усиленный постнатальный астроцитогенез. Преждевременное образование нейронов верхних слоев сопровождается повышенной экспрессией нейротрофина-3. Ген Sip1 сдерживает образование сигнальных факторов в постмитотических нейронах, что дает обратный сигнал предшественникам регулировать время переключения клеточной судьбы, количество нейронов и усиление глиального кортикогенеза [12]. Кроме того, экспрессия Sip1 наблюдается в высокодифференцированных клетках ЦНС, таких как серотонинергические и дофаминергические нейроны [37], с нарушением работы которых связывают развитие патологической тревожности [38, 39].

Таким образом, нарушение процессов своевременной нейрональной миграции и дифференцировки, регулируемых фактором Sip1, способно привести к повышенной эмоциональной лабильности и нарушению сенсомоторных реакций у взрослых животных.

Заключение

Наличие мутантного аллеля гена Sip1 не влияло на двигательную активность, способность к обучению, реакцию вздрагивания и величину престимульного ингибирования у мышей, однако имело определенное влияние на неврологические функции, тревожность и социальный интерес животных. Полученные данные позволяют предположить, что мутация в гене Sip1 приводит к нарушению нейрофункциональных взаимодействий, ведущих к неврологическому дефициту и изменению поведенческого ответа в условиях мягкого стресса.

Финансирование исследования. Статья подготовлена при поддержке Российского научного фонда (грант №15-14-10021) по приоритетному направлению деятельности «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований с привлечением молодых исследователей».

Конфликт интересов. У авторов нет конфликта интересов.

рис