Применение вирусного вектора AAV-Syn-BDNF-EGFP как нейропротективного агента при моделировании гипоксии in vitro

Введение

Ишемический инсульт головного мозга характеризуется выраженным повреждением функций ЦНС после кратковременной или длительной окклюзии кровеносных сосудов головного мозга. В настоящее время активно ведется поиск эффективных стратегий предотвращения и терапии ишемических повреждений мозга, способов поддержания функциональной активности нейронных сетей. Следует отметить, что ишемическое повреждение головного мозга является многофакторной патологией. Ключевыми повреждающими фак­торами при нарушении кровоснабжения головного мозга служат гипоксия (кислородная депривация), снижение поступления энергетических субстратов к нервным клеткам (глюкозная депривация) и окислительный стресс.

Показано [1–4], что эффективным подходом для коррекции ишемических повреждений головного мозга является применение нейротрофического фактора головного мозга BDNF. Это — один из ключевых представителей семейства нейротрофинов, который обеспечивает рост и развитие головного мозга в эмбриогенезе, а также образование и поддержание нормального функционирования нейронных сетей в постнатальном периоде [5, 6]. BDNF участвует в модуляции синаптической передачи в гиппокампе и некоторых отделах коры головного мозга [7–10]. Многочисленные работы свидетельствуют о том, что применение экзогенного нейротрофина повышает устойчивость нервных клеток к повреждающему действию факторов ишемии как in vitro, так и in vivo [11–14]. BDNF снижает гибель нейронов, уменьшает объем очага инсульта, ускоряет восстановление неврологического статуса и когнитивных способностей животных [15, 16]. Еще одной интересной особенностью BDNF является способность поддерживать жизнеспособность нейронов, не входящих в нейронные сети, в раннем онтогенезе. Эта особенность может позволить поддерживать жизнеспособность нейронов, потерявших связи с другими нейронами в результате разрушения нейронных сетей, в постишемическом периоде в течение достаточно длительного времени.

Одно из перспективных направлений современной медицины — разработка биотехнологических методов доставки в организм различных соединений, обладающих нейропротекторным действием, в том числе с помощью вирусных векторов для генной терапии. Это позволяет повысить на продолжительный срок уровень продукции нужного белка, избежать необходимости длительного приема лекарственных препаратов, оказывать воздействие на строго определенный тип клеток. Сейчас активно изучаются возможности применения вирусных векторов, доставляющих ген BDNF в нервные клетки, при нейродегенеративных заболеваниях и травмах нервной системы. Например, работами S. Liu с соавт. [17] показано, что применение аденоассоциированного вирусного вектора, несущего ген BDNF, стимулирует рост аксонов после травмы спинного мозга. Продемонстрирован положительный эффект применения вирусных векторных систем BDNF при дегенерации нейронов сетчатки [18, 19], атаксии Фридриха [20], болезни Альцгеймера [21]. Однако имеются и данные, свидетельствующие о сложности использования подобных способов доставки. Например, в работе E. Dekeyster с соавт. [22] положительного эффекта — сверхэкспрессии BDNF — при применении вирусной доставки при глаукоме не наблюдалось.

Несмотря на это, инициация экспрессии BDNF с помощью вируса может рассматриваться как новый подход к созданию эффективных методов терапии ишемического инсульта головного мозга. Подобные исследования в мире только начинаются. Известны примеры успешного использования модифицированного вируса AAV-BDNF [23]. При введении его в субвентрикулярную зону взрослым крысам за 14 дней до проведения окклюзии правой средней мозговой артерии показано улучшение восстановления локомоторной функции после инсульта. Этот процессс может быть связан с усилением миграции нейропрогениторных клеток у экспериментальных животных.

Цель исследования — разработать и изучить влияние вируса AAV-Syn-BDNF-EGFP на жизнеспособность первичных культур клеток гиппокампа в норме и при моделировании одного из факторов ишемии (гипоксии) in vitro.

Материалы и методы

Плазмиды. Для разработки необходимого вирусного конструкта были использованы плазмиды AAV-Syn-EGFP, pDP5, DJvector, pHelper. AAV-Syn-EGFP — плазмида, полученная на основе бактериальной плазмиды pUC19 и несущая последовательности человеческого промотора белка синапсина hSyn, WPRE-энхансера, SV40 polyA сигнальную последовательность, фланкированную ITR-повторами (inverted terminal repeat) из аденоассоциированного вируса серотипа 2 (AAV2). Три остальные плазмиды (pDP5, DJvector, pHelper) представляют собой набор вспомогательных плазмид, необходимых для сборки аденоассоциированного вирусного вектора, которые несут гены Rep, Cap.

Выделение суммарной РНК. Выделение суммарной РНК из биологических образцов (ткани мозга мыши) для последующей наработки кДНК, кодирующей белок BDNF, проводили по стандартному протоколу с применением реагента Extract RNA («Евроген», Россия).

Полимеразная цепная реакция. При проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР) для наработки клонируемых фрагментов гена BDNF использовали коммерческий набор реактивов Phusion High-Fidelity PCR Kit, включающий Phusion High-Fidelity ДНК-полимеразу (Thermo FisherScientific, США). Преимуществом данной полимеразы является повышенная скорость и точность работы фермента. Для выполнения ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) использовали обратную транскриптазу MMLV («Евроген», Россия).

Плазмидное клонирование. Очистку полученной последовательности BDNF выполняли с помощью коммерческого набора Isolate II PCR and Gel Kit (Bioline, Великобритания) согласно протоколу производителя. Для конструирования плазмиды использовали ферменты фирм Thermo Fisher Scientific (США) и New England Biolabs (США). Рестрикцию клонируемого фрагмента BDNF и плазмиды AAV-Syn-EGFP-kid2 осуществляли рестриктазами EcoRI и BamHI с образованием липких концов (рис. 1). Лигазную смесь в дальнейшем использовали для трансформации компетентных клеток E. coli TopTEN.

Рис. 1.Схема клонирования фрагмента гена BDNF в плазмиду-шаттл

Трансформация бактериальных клеток E. сoli плазмидной ДНК, наработка и выделение плазмидной ДНК. Для трансформации использовали компетентные клетки E. сoli TopTEN. Бактериальные клетки для проведения трансформации выдерживали на льду 15–20 мин, после чего вносили полученную в результате плазмидного клонирования плазмиду AAV-Syn-BDNF-EGFP в объеме 1/10 от объема клеток и смесь инкубировали 20 мин на льду. Затем клетки подвергали тепловому шоку при 42°C в течение 45 с на водяной бане и инкубировали на льду 3 мин. После 30–90-минутной инкубации при 37°С с непрерывным встряхиванием (200–300 об./мин) в трехкратном объеме среды SOB для культивирования прокариотических клеток трансформированные клетки рассевали на чашки Петри, содержащие LB-среду (Luria–Bertani), агар и ампициллин (100 мкг/мл). Культивирование на чашках проводили при 37°C 12–16 ч, после чего частью полученных колоний наращивали объем бактериальной массы в жидких мини- и максикультурах с дальнейшим выделением плазмидной ДНК с помощью коммерческих наборов ISOLATE II Plasmid Mini Kit (Bioline, Великобритания) и NucleoBond Xtra Midi/Maxi (MACHEREY-NAGEL, Германия) согласно протоколу производителя.

Культивирование клеточной линии эмбриональной почки человека HEK 293T и проведение трансфекции. Условия культивирования клеточной линии HEK 293Т соответствовали указанным в паспорте культуры: среда — DMEM; сыворотка эмбриональная бычья — 10%; антибиотик гентомицин — 15 мкг/мл. Процедура пересева — снятие клеток, с использованием трипсина 0,25% и раствора Версена 0,02% (1:2–1:3), кратность рассева — 1:2–1:3, оптимальная плотность — (3,0–5,0)·10⁴ кл./см². Культивирование осуществляли в СО₂-инкубаторе при 37ºС, 5% СО₂, 80% влажности.

Для трансфекции клеточной линии использовали шаттл-плазмиду AAV-Syn-BDNF-EGFP и хелперные плазмиды pDP5, DJvector, pHelper. Экспрессирующую и хелперные плазмиды смешивали в эквимолярном количестве (20 мкг каждой) с культуральной средой DMEM. К смеси DNA/DMEM добавляли смесь PEI/DMEM и инкубировали 15 мин при комнатной температуре, после чего доводили объем DMEM до 15 мл. Культуральную среду HEK 293Т заменяли на смесь PEI/DNA/DMEM на 4–5 ч при 37ºС, 5% СО₂. После этого выполняли полную замену среды на DMEM, содержащую 2% сыворотки, и клетки инкубировали 3–5 дней при 37ºС, 5% СО₂.

Выделение и очистка аденоассоциированных вирусных частиц. Клетки HEK 293T после трансфекции снимали с подложки с помощью фосфатно-солевого буферного раствора (PBS), не содержащего Ca²⁺, Mg²⁺, центрифугировали при 1000 об./мин в течение 5 мин и растворяли осадок в 2 мл лизирующего буфера. Лизат троекратно подвергали циклу замораживания/размораживания (–80ºС). После последнего размораживания лизат клеток центрифугировали при 2000 об./мин в течение 5 мин. Затем проводили ферментативную обработку бензоназой для удаления нуклеотидов и нуклеиновых кислот, не защищенных вирусным капсидом, и центрифугировали при 2000–2500 об./мин в течение 5 мин для осаждения различных белковых гранул и обломков крупных молекул, после чего супернатант фильтровали через 0,45 мкм фильтр. Дополнительную очистку и концентрацию вирусного препарата проводили на колонках Amicon Ultra-15 (Millipore, Великобритания).

Культивирование диссоциированных клеток гиппокампа. Материалом для исследований служили культуры диссоциированных клеток гиппокампа, полученных от 18-дневных эмбрионов мышей линии C57BL/6. Основные правила содержания и ухода за экспериментальными животными соответствовали «Правилам для проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Россия, 2010) и «Международным рекомендациям (этическому кодексу) по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (CIOMS и ICLAS, 2012), при этом неукоснительно соблюдались этические принципы, установленные Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (Страсбург, 2006). На проведение экспериментальных исследований на животных получено разрешение Этического комитета Национального исследовательского Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского.

Ферментативную диссоциацию клеток эмбрионального гиппокампа проводили при помощи его обработки 0,25% раствором трипсина (Gibco, США). Культивирование первичных культур осуществляли в нейробазальной среде Neurobasal^TM (Thermo Fisher Scientific, США) в комплексе с биоактивной добавкой В27 (Thermo Fisher Scientific, США), L-глутамином (Thermo Fisher Scientific, США), эмбриональной телячьей сывороткой («ПанЭко», Россия) согласно ранее разработанному протоколу [24] в течение 21 дня in vitro на стеклах, покрытых полиэтиленимином (Sigma, США) для повышения адгезии клеток на их поверхность. Исходная плотность культуры на матрице составляла 9000 кл./мм². Жизнеспособность культур поддерживалась в условиях СО₂-инкубатора MCO-18AIC (Sanyo, Япония) при температуре 35,5^оС и газовой смеси, содержащей 5% СО₂.

Иммуноцитохимия. В работе использовались первичные поликлональные куриные антитела к BDNF и вторичные поликлональные антитела, конъюгированные с флюоресцентной меткой, — Goat anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 647) (Abcam, США). Культуры клеток фиксировали в 4% растворе параформальдегида в растворе PBS в течение 20 мин при комнатной температуре, для пермеабиализации клеток использовали раствор 0,2% Triton X-100/PBS. Визуализацию препаратов проводили с помощью флюоресцентного конфокального микроскопа Zeiss 510 NLO (Carl Zeiss, Германия).

Моделирование гипоксии происходило на 14-й день культивирования путем замены на 10 мин культуральной среды на среду с низким содержанием кислорода. Вытеснение кислорода осуществляли путем насыщения культуральной среды аргоном. Эксперимент проводили в герметичной камере, в которой воздух также был замещен на аргон.

Оценка жизнеспособности клеток в диссоциированных культурах гиппокампа. Жизнеспособность клеток оценивали на 1, 3 и 7-е сутки после проведения инфицирования разработанным вирусным конструктом, а также на 7-е сутки после моделирования гипоксии. С этой целью подсчитывали число клеточных ядер, окрашенных пропидий иодидом (Sigma, США), — мертвые клетки, и ядер, окрашенных бис-бензимидом (Sigma, США), — все клетки культуры. Долю погибших клеток рассчитывали как процентное соотношение между бис-бензимид-позитивными и пропидий иодид-позитивными клетками [24].

Функциональный кальциевый имиджинг. Иссле­до­вание функциональной метаболической активности клеток первичных культур гиппокампа проводили с помощью кальциевого имиджинга, позволяющего регистрировать изменение концентрации цитоплазматического кальция. В качестве флюоресцентного зонда использовали специфический кальциевый краситель Oregon Green 488 BAPTA-1 АМ — OGB1 (Invitrogen, США). Окрашивание выполняли по стандартному протоколу [25]. Регистрацию флюоресценции проводили с помощью лазерного сканирующего микроскопа LSM 510 NLO (Carl Zeiss, Германия). Регистрировали временны′е серии изображений поля флюоресценции OGB1. Флюоресценция красителя возбуждалась излучением аргонового лазера на длине волны 488 нм, регистрировалась с помощью светофильтра с полосой 500–530 нм. Анализировали изменение интенсивности флюоресценции (усл. ед.) выбранной области поля зрения, совпадающей с телом клетки. Выделение и анализ кальциевых осцилляций, полученных при помощи флюоресцентной конфокальной микроскопии, проводили с помощью оригинального программного пакета Astroscanner (свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ №2014662670). Также анализировали записи функции F(t) средней интенсивности флюоресценции OGB1 выделенной области поля от времени. Учитывали следующие параметры: длительность (с), частоту (количество кальциевых событий/мин), процент работающих клеток в культуре [25].

Анализ биоэлектрической активности. Для исследования изменений спонтанной биоэлектрической активности использовали мультиэлектродные матрицы MEА 60 (Multichannel Systems, Германия) и набор программного обеспечения Conductor™ (Alpha Med Scientific, Япония). Регистрацию внеклеточных потенциалов действия осуществляли на 7-е сутки развития культуры in vitro перед добавлением вирусного препарата и далее — ежедневно на протяжении 7 сут. Детектирование спайков (внеклеточных потенциалов действия) проводили по следующему алгоритму: выбиралась граница, равная 8σ, где σ — среднеквадратичное отклонение. При условии превышения амплитудой спонтанной активности данного порога событие считалось спайком, без превышения активности распознавалось как шум и не учитывалось при анализе данных. Критерием малой сетевой пачки служило наличие спайков минимум на четырех различных электродах матрицы с межспайковым интервалом не более 100 мс. При анализе полученных данных оценивали два основных показателя: среднее количество малых сетевых пачек и среднее количество спайков в ма­лой сетевой пачке. Полученные данные обрабатывали с использованием разработанного в программной среде MATLAB оригинального пакета алгоритмов MEAMAN [26].

Статистическая обработка данных. Полученные данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего (M±SEM). Достоверность различий между экспериментальными группами определяли с помощью пакета ANOVA в программе SigmaPlot 11.0 (Systat Software Inc., США). Различия считались статистически значимыми при p<0,05.

Результаты

На первом этапе работы для увеличения экспрессии нейротрофического фактора ВDNF нейронами были выполнены конструирование и сборка плазмидного вектора, несущего кодирующую последовательность гена BDNF, с использованием методов молекулярного клонирования. Конструируемый плазмидный вектор по сути является основой для вируса. В состав плазмидного вектора вошли следующие последовательности (рис. 2): 1) человеческий промотор белка синапсина hSyn — сильный промотор, позволяющий экспрессировать необходимый ген только в нейрональных клетках; 2) WPRE-энхансер (woodchuck hepatitis posttranscriptional regulatory element) — регуляторный элемент, значительно усиливающий работу промотора синапсина hSyn; 3) мультилинкер для клонирования ORF (open reading frame) встраиваемого гена; 4) ген EGFP, который при необходимости вырезается соответствующими рестриктазами; 5) SV40 polyA сигнальная последовательность, фланкированная ITR-повторами — из AAV серотипа 2; 6) кассета генов, кодирующих устойчивость к ампициллину, необходимую для положительного отбора колоний, которые несут данную плазмиду (AmpR-промотор и AmpR-ген) и 7) последовательность, соответствующая нуклеотидной последовательности, которая кодирует функциональный белок BDNF.

Рис. 2. Карта плазмиды AAV-Syn-BDNF-EGFP-kid2 (построена с по­­мощью программы SnapGene Viewer 3.1.2)

В ходе работы для использования при амплификации нейротрофического фактора BDNF была подоб­рана система праймеров mBDNF-EcoRI-fw и mBDNF-BamHI-rv (5´-ATTGAATTCATGGGCCACATGCTGTCC-3´ и 5´-AATGGATCCAATCTTCCCCTTTTAATGGTCAGTG-3´), в состав которых внесены сайты рестрикции для последующей рестрикции и лигирования в конструируемый вектор.

Также были подобраны температура и время реакции, позволяющие амплифицировать олигонуклеотидную последовательность нейротрофического фактора BDNF. Начальная денатурация проводилась при температуре 95°C в течение 1 мин. Затем следовал рабочий цикл из трех процедур, повторяющийся 30 раз: 95°C — 15 с — денатурация, 65°C — 10 с — отжиг праймеров, 72°C — 40 с — элонгация. И после этого происходила финальная достройка цепей при температуре 72°C в течение 7 мин. В результате была получена последовательность, кодирующая нейротрофический фактор BDNF.

Сконструированная плазмида была наработана из клеток E. coli, правильность сборки подтверждена с помощью реакции рестрикции и ПЦР на клонируемый фрагмент гена BDNF, электрофоретически проведена проверка длин полученных фрагментов (рис. 3).

Рис. 3. Качественный анализ результатов ПЦР и рестрикции методом горизонтального электрофореза в агарозном геле: а — ПЦР: 1 — маркер длин ДНК; 2 — BDNF; б — рестрикция: 1 — маркер длин ДНК; 2 — рестрикция AAV-Syn-BDNF-EGFP ферментом EcoRI; 3 — рестрикция AAV-Syn-BDNF-EGFP ферментами EcoRI и BamHI

Следующим этапом работы явилось тестирование полученного вирусного вектора в первичных культурах клеток гиппокампа. С помощью конфокальной микроскопии была подтверждена экспрессия зеленого флюоресцентного белка EGFP в культурах, инфицированных разработанным вирусным конструктом. Для подтверждения эффективности инфицирования было проведено иммуноцитохимическое окрашивание культур с помощью моноклональных антител к BDNF (рис. 4). Отмечено, что в культурах, инфицированных разработанным вирусным конструктом, уровень продукции BDNF значительно повышается по сравнению с интактными культурами. Это означает, что разработанный вирусный конструкт эффективно инфицирует нейрональные клетки и вызывает увеличение экспрессии BDNF.

Рис. 4. Иммуноцитохимическое маркирование белка BDNF в первичной культуре клеток гиппокампа, инфицированной вирусным вектором AAV-Syn-BDNF-EGFP: красный канал — окрашивание антителами с флюоресцентной меткой Alexa Flor 647, зеленый канал — флюоресценция зеленого белка EGFP; а — интактная культура; б — культура, инфицированная вирусом AAV-Syn-BDNF-EGFP; 7-е сутки после инфицирования; ×40

Поскольку многие вирусы вызывают гибель нейрональных культур либо изменение функциональной активности нейронных сетей, на следующем этапе исследований проведена оценка жизнеспособности первичных культур клеток гиппокампа в течение 7 сут после инфицирования. Выявлено, что количество мертвых клеток в экспериментальной группе культур статистически значимо (ANOVA) не отличалось от показателей интактных культур на протяжении всего периода наблюдения (табл. 1).

Таблица 1. Доля живых клеток в диссоциированных культурах гиппокампа после инфицирования культуры вирусом AAV-Syn-BDNF-EGFP, % (M±SEM)

Для оценки влияния вирусного конструкта на нейросетевую активность первичных культур клеток гиппокампа были проанализированы основные параметры функциональной кальциевой и биоэлектрической активности культур в течение 7 сут после проведения вирусного инфицирования (экспериментальная группа) и интактных культур.

Спонтанную биоэлектрическую активность регистрировали непосредственно перед инфицированием (7-е сутки культивирования (7 DIV)) и далее после инфицирования ежедневно на протяжении 7 сут (до 14 DIV). Согласно ранее опубликованным данным [27–29], этот период развития является ключевым этапом формирования сетевой активности нейронных сетей диссоциированных культур in vitro. Анализ биоэлектрической активности показал, что применение разработанного конструкта не оказывает угнетающего действия на спонтанную биоэлектрическую активность первичных культур клеток гиппокампа. Как в интактных, так и в инфицированнных культурах на протяжении всего периода наблюдения регистрировалась спонтанная пачечная активность, характерная для данных сроков развития нейронных сетей invitro.

Установлено, что после инфицирования AAV-Syn-BDNF-EGFP на 7-е сутки развития культур in vitro спонтанная биоэлектрическая активность статистически значимо не изменялась ни по одному из исследуемых параметров (количество малых сетевых пачек, количество спайков в пачке) на протяжении 6 сут после инфицирования (рис. 5).

Рис. 5. Растровые диаграммы спонтанной биоэлектрической активности диссоцииро­ванной культуры гиппокампа в постгипоксическом периоде: а — 1-е сутки после инфицирования (7 DIV); б — 7-е сутки после инфицирования (14 DIV); слева — интактная культура; справа — культура, инфицированная вирусом AAV-Syn-BDNF-EGFP

К 7-м суткам после инфицирования (14 DIV) отмечена тенденция к интенсификации сетевой активности в культурах с гиперэкспрессией BDNF по сравнению с интактными культурами по параметру числа спайков в сетевой пачке (интактные — 281,5±82,7; после инфицирования AAV-Syn-BDNF-EGFP — 402,3±111,3). Количество пачек за 10 мин в интактных и инфицированных культурах статистически значимо не отличалось (интактные культуры — 31,8±8,5; инфицированные вирусом AAV-Syn-BDNF-EGFP — 37,20±9,30).

Для оценки структурно-функционального состояния нейронных сетей на клеточном уровне наиболее информативным является многофакторный анализ различных показателей кальциевого гомеостаза в нервной ткани. Динамика концентрации ионов Ca²⁺ в цитоплазме нервных клеток позволяет оценить метаболическую активность как нейронов, так и глии [25].

Были проанализированы такие параметры кальциевой активности нейрональных культур, как количество клеток, проявляющих спонтанную кальциевую активность, частота и длительность кальциевых осцилляций.

Установлено, что применение разработанного вируса не влияет на основные показатели функциональной кальциевой активности первичных культур клеток гиппокампа (табл. 2), однако отмечена тенденция к увеличению частоты кальциевых событий в группе культур, инфицированных вирусом (конт­роль — 1,42±0,16 осц./мин, инфицированные культуры — 1,79±0,15 осц./мин). Доля клеток, проявляющих активность, изменялась незначительно.

Таблица 2. Основные параметры спонтанной кальциевой активности на 7-е сутки (14 DIV) после инфицирования культуры вирусом AAV-Syn-BDNF-EGFP (M±SEM)

На заключительном этапе работы выполнено исследование нейропротекторного действия разработанного вирусного конструкта и проведено сравнение эффективности использования рекомбинантного белка BDNF (Merk, Франция) и увеличения экспрессии BDNF с помощью разработанного вируса при моделировании гипоксии — одного из факторов ишемии. Моделирование гипоксии проводили через 7 сут после инфицирования культур (14 DIV). Рекомбинантный BDNF в концентрации 1 нг/мл добавляли в культуральную среду контрольных культур за 20 мин до моделирования гипоксии. Установлено, что гипоксия вызывает достоверное (ANOVA, р<0,05) снижение количества живых клеток в культуре к 7-м суткам постгипоксического периода (интактные — 88,3±2,3%; гипоксия — 62,9±1,8%). Исследование показало, что как превентивная аппликация рекомбинантного BDNF, так и стимуляция экспрессии BDNF с помощью разработанного вирусного конструкта позволяют предотвратить снижение жизнеспособности клеток в культуре в постгипоксическом периоде (доля живых клеток в группе «гипоксия + BDNF» — 81,6±4,1%; «гипоксия + AAV-Syn-BDNF-EGFP» — 89,2±5,2%) (рис. 6).

Рис. 6. Доля живых клеток в диссоциированных культурах гиппокампа на 7-е сутки после моделирования гипоксии (14DIV) * — различия статистически значимы по сравнению с контролем; # — по сравнению с гипоксией, ANOVA (p<0,05)

Обсуждение

В литературе показано [1, 4, 6, 11], что BDNF обладает выраженным нейропротекторным действием при моделировании различных факторов ишемии, в том числе гипоксии. Применение рекомбинантного BDNF повышает устойчивость нервных клеток к действию повреждающих факторов ишемии как in vitro [14, 24], так и in vivo [2, 14, 30, 31]. Это делает перспективным использование нейротрофических факторов в клинической терапии ишемических повреждений головного мозга. Существуют исследования, подтверждающие участие данного нейротрофина в регенерации ЦНС после гибели значительной части функционально значимых нейронов [32]. Однако системное применение рекомбинантных белков всегда приводит к временному эффекту, который требует их постоянного приема. Целенаправленная доставка генов к конкретным областям нервной системы в зоне повреждения может быть намного более эффективным подходом к долгосрочному лечению повреждений ЦНС [19, 20].

В результате проведенного исследования нами был разработан вирусный конструкт, содержащий последовательность гена BDNF, для повышения экспрессии BDNF нейронами головного мозга и изучены его возможности.

Как известно, при культивировании нейронные сети проходят несколько характерных стадий формирования морфофункциональной активности [27–29]. Наше исследование in vitro показало, что гиперэкспрессия BDNF не оказывает значимого эффекта на формирование как биоэлектрической, так и кальциевой активности и, таким образом, безопасна для применения в целях восстановления нормальной функциональной активности при ишемическом повреждении головного мозга. Показано также отсутствие цитотоксичности вирусного препарата при исследовании жизнеспособности культур клеток гиппокампа.

Проведенные эксперименты свидетельствуют, что повышенная экспрессия BDNF позволяет снизить гибель нервных клеток при моделировании гипоксии in vitro. Продемонстрированный нейропротекторный эффект сопоставим с действием экзогенно вводимого рекомбинантного BDNF. Полученные результаты могут явиться фундаментальной базой для разработки метода генной терапии тяжелого ишемического повреждения головного мозга, а также нейродегенеративных заболеваний, одним из патогенетических компонентов которых является гипоксия.

Заключение

Разработан аденоассоциированный вирусный вектор AAV-Syn-BDNF-EGFP, несущий последовательность гена BDNF, предназначенный для увеличения экспрессии нейротрофического фактора головного мозга. Применение разработанного вектора для инфицирования первичных культур клеток гиппокампа мыши приводит к увеличению продукции BDNF клетками культуры, при этом не оказывает негативного влияния на жизнеспособность и функциональную активность нейронных сетей первичных культур гиппокампа. Продемонстрированы нейропротекторные свойства гиперэкспрессии BDNF при моделировании гипоксии in vitro.

Финансирование исследования. Исследование вы­полнено при поддержке государственного задания (проекты 17.3335.2017/ПЧ и 6.6379.2017/БЧ) в части получения вирусного конструкта и при поддержке Российского научного фонда (проект 17-75-10149) в части исследования его нейропротекторных свойств.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов, о которых необходимо сообщить.