Антитромботическая модификация шовного материала: сохранение свойств при длительном хранении

Введение

История создания шовного материала берет свое начало за 2000 лет до нашей эры, но совершенствование нитей продолжается по сей день [1, 2]. Актуальным направлением является придание шовным материалам биологической активности [3–9]. В настоящее время на рынке отмечается большое разнообразие модифицированных шовных материалов с различной терапевтической направленностью [5, 6, 10, 11]. В основном представлены нити с антибактериальной активностью [4, 7, 9, 11]. В то же время шовный материал с антитромботическим действием для применения в реконструктивной сосудистой хирургии отсутствует. При этом число реконструктивных операций на различных сосудистых бассейнах ежегодно увеличивается [12, 13]. Предложенный нами способ химической антитромботической модификации шовного материала [14] позволяет снизить количество ранних и отдаленных осложнений в сосудистой хирургии.

Важным качеством шовных материалов является сохранение стерильности, биосовместимости и заданных биологических свойств в течение запланированного срока хранения [1, 2]. Для немодифицированных шовных материалов срок хранения в среднем составляет 5 лет в зависимости от используемого вида стерилизации. Для модифицированных нитей эти сроки могут отличаться, что зависит от биологически активных компонентов, входящих в состав покрытия. Этот момент следует учитывать при разработке модифицированного шовного материала. Ранее нами было показано [14], что предложенный способ химической модификации шовного материала с использованием биодеградируемого полимера 3-полигидроксибутиратоксивалериата (ПГБВ) и нефракционированного гепарина позволяет повысить био- и гемосовместимость нитей.

Цель исследования — оценка эффективности антитромботического покрытия на поверхности модифицированного шовного материала после трех лет хранения в стандартных условиях.

Материалы и методы

В исследовании использовали нить на основе полипропилена Serapren 3,0. Для последующей модификации на ее поверхность наносили слой биоде­градируемого полимера ПГБВ с молекулярной массой 280 кДа, синтезированного в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН (Пущино, Московской области). ПГБВ обладает высокой биосовместимостью, поскольку мономер, входящий в состав данного полимера, является естественным продуктом обмена веществ животных и человека и в норме присутствует в крови [15]. Для модификации применяли 3% раствор ПГБВ в хлороформе. Данная концентрация раствора является оптимальной, поскольку позволяет формировать на поверхности нити ровное покрытие толщиной 6–7 нм. В качестве лекарственного вещества, оказывающего антитромботический и антипролиферативный эффект, использовали нефракционированный гепарин («Белмедпрепараты», Беларусь).

Модификацию шовного материала нефракционированным гепарином проводили в три стадии [14]: 1) инициация центров привитой сополимеризации на поверхности слоя биополимера методом озонирования; 2) создание дополнительного подслоя полиметакрилоилхлорида, имеющего в своем составе активные хлорангидридные группы, которые могут образовывать с гепарином прочные ковалентные связи; 3) химическая прививка гепарина на образованный подслой из его раствора в бикарбонатном буфере при температуре 2–5°С в течение 10 ч, затем 14 ч при комнатной температуре. Далее следовала сушка на воздухе при комнатной температуре. Модифицированные образцы шовного материала хранили при комнатной температуре в защищенном от света месте в индивидуальной упаковке. Срок хранения — три года от даты модификации.

Равномерность модифицирующего покрытия оценивали при помощи сканирующей электронной микроскопии на микроскопе Hitachi S-3400N (Hitachi, Япония). Исследуемые образцы монтировали на специальные столики и методом ионного распыления наносили золото-палладиевое покрытие, используя вакуумный пост Emitech SC7640 (Quorum Technologies, Англия).

Сохранность и наличие гепарина в поверхностном слое шовного материала изучали методом спектроскопии комбинационного рассеяния света (КРС) высокого пространственного разрешения (микро-Раман или микро-КРС-спектроскопия) с применением спектрометра HoribaLabRAM HR800 (HORIBA, Франция). Локальное сканирование поверхности образца проводили возбуж­дающим лазерным излучением с предварительной прецизионной калибровкой мощности лазерной накачки для выполнения неразрушающего молекулярного анализа. Последовательное спектральное сканирование осуществляли по продольной пространственной координате Z (в глубину покрытия, в направлении от поверхности) с шагом 1 мкм. Выбор области исследований в плоскости XY (т.е. вдоль нити) выполняли случайным образом со статистическим усреднением результатов измерений.

Биосовместимость in vivo оценивали путем подкожной имплантации крысам-самцам субпопуляции Wistar (масса 55–70 г) образцов из ксеноперикарда «КемПериплас» («НеоКор», Кемерово), прошитых модифицированным и немодифицированным шовным материалом. Фрагменты «КемПериплас» размером 6×6 мм имплантировали в качестве контроля. Срок имплантации составил 2 мес, после чего образцы ксеноперикарда вместе с частью окружающих тканей извлекали и помещали в забуференный формалин. Тканевую реакцию на шовный материал оценивали методом световой микроскопии (Axio Imager A1; Carl Zeiss, Германия). Окраску препаратов осуществляли по методу Ван–Гизона. Все манипуляции с животными проводили в соответствии с нормативами, указанными в руководстве «Guide for the Care and Use of Laboratory Animals» (National Research Council, 2011); с национальным стандартом РФ ГОСТ 33044–2014 «Принципы надлежащей лабораторной практики»; с этическими принципами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (Страсбург, 2006). Протокол исследования одобрен Этическим комитетом Научно-исследовательского института комп­лексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний.

Антитромботические свойства шовного материала оценивали на основании показателей агрегации тромбоцитов. Агрегационную активность тромбоцитов после контакта донорской крови с модифицированным и немодифицированным шовным материалом исследовали при помощи 4-канального анализатора агрегации тромбоцитов АРACT 4004 (LabiTec, Германия). Продолжительность контакта образцов с кровью составляла 3 мин. Кровь для исследования брали утром натощак посредством пункции локтевой вены в отдельные пластиковые пробирки с 3,8% цитратом натрия, в соотношении 9:1. Агрегацию тромбоцитов индуцировали раствором коллагена 2 мг/мл («Ренам», Россия).

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программы Statistica 6.0. Результаты представлены в виде медианы и квартильного отклонения. Статистически значимыми считали различия при p<0,05.

Результаты и обсуждение

На первом этапе исследования оценивали сохранность гепарина на поверхности модифицирующего слоя. При изучении колебательных спектров слоя гепарина на поверхности модифицированной нити основной акцент был сделан на анализе относительных интенсивностей линий КРС, характерных для сульфатных групп в его молекулярной структуре. Использованный метод спектроскопии микро-Раман позволяет измерять колебательные спектры при фотовозбуждении микроскопических объемов вещества (порядка единиц микрометров в кубе). В этом случае при лазерном 1D-, 2D- или 3D-сканировании любого образца, прозрачного в выбранной области частот лазерной накачки и неупругого рассеяния света, можно получить спектральную карту КРС с высоким разрешением по любым пространственным координатам. Спектры микро-КРС образцов шовного материала были измерены при инфракрасном лазерном возбуждении с длиной волны 785 нм. Это позволило полностью исключить влияние очень сильной паразитной фотолюминесценции, наблюдаемой в исследуемых материалах под действием электромагнитного излучения в видимой области длин волн.

Полученные спектры микро-КРС в диапазоне 100–1800 см^–1 (рис. 1) разнесены сверху вниз по мере заглубления каустики возбуждающего лазерного луча внутрь покрытия. Условная координата центра каус­тики по глубине в образце указана числом в микрометрах. Ноль микрометров соответствует поверхности образца. В выбранной аппаратной конфигурации каустика имеет собственную гауссову длину — около 2 мкм, поэтому координата –1 мкм (самый верхний спектр) соответствует случаю, когда центр каустики приподнят над поверхностью исследуемого объекта для получения сигнала от субмикронного по глубине участка образца. Цветовая кодировка помогает соотнести эту информацию непосредственно с графиками.

---

Рис. 1. Спектры микро-КРС по мере заглубления центра каустики лазерного луча внутрь образца (сверху вниз): 1 — шовный материал + гепарин, глубина 1 мкм; 2 — шовный материал + гепарин, глубина 0 мкм; 3 — шовный материал + гепарин, глубина 1 мкм; 4 — шовный материал + гепарин, глубина 2 мкм; 5 — шовный материал + гепарин, глубина 3 мкм; 6 — шовный материал + гепарин, глубина 4 мкм; 7 — референтный спектр комбинационного рассеяния света шовного материала (полипропилен + 3-полигидроксибутиратоксивалериат) без гепарина

---

На представленных фрагментах полученных спектров можно видеть значительное число пиков и спектральных полос неупругого рассеяния света, относимых к возбуждению набора валентных и деформационных колебаний для различных функциональных групп. В силу высокой прозрачности исследуемой системы на длине волны возбуждения КРС часть этих спектральных компонентов относится к полипропилену и ПГБВ, причем очень многие из них перекрываются линиями в спектре гепарина. Достоверная деконволюция таких интегральных компонентов в спектрах КРС не всегда возможна и эффективна. По этой причине мы ограничили ширину аналитической спектральной области узким диапазоном 1000–1100 см^–1, в котором могут быть обнаружены линии КРС, характеристичные для сульфо­групп в сульфатированных полисахаридах. На рис. 1 видно постепенное исчезновение сигнала от сульфогрупп в области 1085 см^–1 с ростом глубины возбуждения. Таким образом, спектральное исследование позволяет оценить толщину слоя гепарина в модифицированном шовном материале, которая составила около 2 мкм. Все другие пики свидетельствуют о наличии полипропилена и биополимера в составе покрытия.

Качество нанесенного покрытия после трех лет хранения изучали при помощи сканирующей электронной микроскопии. Оценивали равномерность и сохранность модифицирующего слоя (рис. 2). Выявлено, что поверхность модифицированной нити после трех лет хранения достаточно равномерно покрыта биодеградируемым слоем (рис. 2, в). При этом наблюдаются незначительные фрагментарные зоны с нарушенной целостностью модифицирующего слоя, что не является существенным и не влияет на антитромботические свойства нити, как показали результаты исследований, представленные далее.

---

Рис. 2. Сканирующая электронная микроскопия поверхности шовного материала: а — немодифицированная нить; б — нить непосредственно после модификации; в — модифицированная нить через 3 года хранения; ×250

---

Для сравнения показана модифицированная нить, поверхность которой была изучена непосредственно после модификации (рис. 2, б). На поверхности визуализируется равномерное покрытие на протяжении всей нити без признаков слущивания и нарушения целостности.

Поскольку одним из важнейших свойств шовного материала является биосовместимость, изменение данного показателя оценивали при подкожной имплантации нитей лабораторным животным. При гистологическом исследовании удаленных образцов ксеноперикарда с частью окружающих тканей, прошитых модифицированной и немодифицированной нитью, были обнаружены различия в тканевой реакции на шовный материал (рис. 3).

---

Рис. 3. Световая микроскопия гистологических срезов: а — перикард, контроль; б — перикард + немодифицированный шовный материал; в — перикард + шовный материал, модифицированный гепарином; окраска по Ван–Гизону; ×200

---

При изучении образцов, прошитых немодифицированной нитью, выявлены признаки выраженного воспаления по типу гранулематозного (рис. 3, б). Коллагеновые волокна в области, прилегающей к нити, располагались рыхло, местами были фрагментированы. Вокруг нити наблюдали значительное скопление лимфоцитов, что свидетельствует о воспалительной реакции на шовный материал. При этом образцы, прошитые модифицированным шовным материалом, отличались незначительной лимфо-лейкоцитарной инфильтрацией, которая также располагалась по ходу шовного материала (рис. 3, в); коллагеновые волокна — извито расположенные, с сохраненной структурой.

Необходимо отметить, что образцы ксеноперикарда без швов, имплантированные крысам в качестве контроля, не вызывают воспалительной реакции, коллагеновые волокна извиты и компактно расположены (рис. 3, а). Полученные результаты свидетельствуют, что шовный материал способен вызывать существенную воспалительную реакцию. Эта воспалительная реакция может приводить к нарушению целостности окружающих тканей, в том числе и имплантированных, что, в свою очередь, в последующем может вызвать негативные последствия при имплантации кардио­васкулярных биологических протезов. Модификация шовного материала ПГБВ и гепарином позволяет снизить негативное влияние нити на окружающие ткани, протективный эффект сохраняется и через три года хранения.

Помимо повышения биосовместимости шовного материала разработанная модификация улучшает и гемосовместимость полипропиленовой нити. Установлено, что при контакте имплантируемого изделия с кровью одними из первых реагируют на чужеродный материал тромбоциты: происходит активация, адгезия и дальнейшая агрегация с высвобождением из них биологически активных веществ, потенцирующих клеточную агрегацию и свертывание белков крови [16]. Таким образом, по степени агрегации тромбоцитов можно судить о тромборезистентных свойствах шовного материала.

При изучении нами влияния шовного материала на степень агрегации тромбоцитов были получены результаты, еще раз подтверждающие, что шовный материал способен провоцировать повышение агрегации тромбоцитов [14]. Так, максимум агрегации тромбоцитов крови, не контактировавшей с шовным материалом, не превышал нормального уровня и составил 51,06 [51,02; 51,08] %. При этом образцы, прошитые немодифицированным шовным материалом, увеличили агрегацию тромбоцитов до 55,05 [55,04; 55,09] %. Несмотря на то, что результаты не имели статистической значимости (р=0,08), можно говорить о заметном повышении агрегационных свойств тромбоцитов крови. Модификация хирургической нити раствором ПГБВ и гепарина позволила статистически значимо (р=0,04) снизить агрегацию тромбоцитов до 44,53 [40,23; 48,38] %, что говорит о возможности улучшения био- и гемосовместимых свойств модифицированного шовного материала.

Таким образом, разработанная методика модификации на основе многоступенчатой химической реакции позволяет прочно закрепить покрытие на поверхности нити, которое сохраняется на протяжении трех лет.

Заключение

Полученные результаты продемонстрировали перспективность выбранного направления улучшения свойств хирургического шовного материала. Спустя три года хранения модифицированный 3-полигидроксибутиратоксивалериатом и гепарином шовный материал сохранил высокую биосовместимость и выраженную антитромботическую активность. Данная технология модификации шовного материала может быть использована для производства нитей с антитромботическими свойствами с целью применения в сердечно-сосудистой хирургии.

Финансирование исследования. Работа выполнена при поддержке комплексной программы фундаментальных научных исследований СО РАН в рамках фундаментальной темы НИИ КПССЗ №0546-2015-0011 «Патогенетическое обоснование разработки имплантатов для сердечно-сосудистой хирургии на основе биосовместимых материалов, с реализацией пациенториентированного подхода с использованием математического моделирования, тканевой инженерии и геномных предикторов».

Конфликт интересов. Авторы подтверждают отсутствие финансовых и других конфликтных интересов, способных оказать влияние на их работу.