Роль генетических факторов человека в естественной селекции доминирующего генотипа вируса гепатита C в этнически близких популяциях бурят и халха-монголов

Введение

Разработка комплекса мер профилактики и внедрение в клиническую практику препаратов прямого противовирусного действия привели к стабилизации уровня заболеваемости хроническим вирусным гепатитом С (ХГС). В настоящее время, по данным ВОЗ, количество больных ХГС существенно сократилось — со 160 до 71 млн. человек [1, 2]. В 2016 г. на 69-й Всемирной ассамблее здравоохранения была принята резолюция, в которой продекларировано существенное снижение заболеваемости вирусным гепатитом в мире к 2030 г. вплоть до его полной элиминации. Необходимо учитывать, что в странах Азиатско-Тихоокеанского региона сосредоточено более 50% всех инфицированных на планете [1]. В Азии наблюдаются самые высокие показатели заболеваемости гепатоцеллюлярной карциномой и частоты формирования цирроза печени в исходе вирусных гепатитов [1].

Вирус гепатита С (HCV) отличается высокой изменчивостью и широким генотипическим разнообразием. Определенные генотипы HCV превалируют в отдельных географических регионах. Например, генотип 1 (HCV-1) доминирует в странах Южной и Северной Америк, Австралии и Европе (53–71%), в то время как генотип 3 (HCV-3) наиболее распространен в Азии (40%), а генотип 4 (HCV-4) — в Северной Африке и на Ближнем Востоке (около 71%) [3]. Несмотря на большой объем информации, связанной с распространением генотипов HCV в конкретных странах, до конца неясен механизм формирования стабильных эпидемических генотипов в ограниченных географических ареалах.

В Монголии отмечается один из наиболее высоких показателей заболеваемости вирусным гепатитом C в Азии, при этом превалирующее распространение среди всех генотипов имеет HCV-1b (98,8%) [4, 5]. Феномен абсолютного доминирования HCV-1 не наблюдается ни в соседней Бурятии, ни в Китае, ни в других азиатских странах [3]. Такую высокую концентрацию одного генотипа в популяции жителей Монголии достаточно сложно объяснить особенностями эпидемиологии вирусного гепатита C в этой стране, или «эффектом основателя». При этом в России, в том числе в этнически близкой Бурятии, доля HCV-1b не превышает 57,1% [6], а в Китае — 56,8% [3].

Одним из вероятных объяснений имеющегося феномена может быть наличие определенной толерантности населения к заражению HCV-2/3, при котором HCV-1 получает селективное преимущество. Можно предположить, что вышеуказанная предрасположенность имеет генетическую природу и может быть обнаружена при сравнительном исследовании генетического полиморфизма этнически близких популяций монголов и бурят. Важным для объяснения причин естественной селекции доминирующего генотипа HCV на территории Монголии может стать исследование полиморфизма генов врожденного иммунитета, кодирующих синтез мембранных и внутриклеточных адаптерных молекул — эффекторов иммунного ответа на HCV [7–9].

Цель исследования — определить роль полиморфизма генов врожденного иммунитета в популяционной селекции генотипов вируса гепатита С, циркулирующих в этнически близких группах монголоидов: бурят и халха-монголов.

Материалы и методы

Представленные исследования проводили с 2013 по 2017 г. на территории России (Республика Бурятия) и Монголии. Сбор материала осуществляли в лечебно-профилактических учреждениях Бурятии и Монголии: Республиканской клинической инфекционной больнице (Улан-Удэ, Республика Бурятия) и Национальном центре по изучению инфекционных болезней (Улан-Батор, Монголия).

Генетическое определение однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП) генов врожденного иммунитета выполнено у 400 больных ХГС, среди которых 200 человек принадлежат к этнической группе халха-монголов, проживающих в Улан-Баторе, и 200 человек — к этнической группе бурят, проживающих в Улан-Удэ. Среди представителей монголоидной расы в Монголии наиболее многочисленной является этническая группа халха-монголов, которая составляет более 85% от общей численности населения [10].

На обеих территориях больных отбирали сплошным случайным методом из всех обратившихся в Гепатологический центр инфекционной больницы Улан-Удэ (Республика Бурятия) и Центр по изучению инфекционных заболеваний Улан-Батора (Монголия). Диагноз ХГС устанавливали на основании данных анамнеза, клинического обследования, определения активности печеночных трансаминаз, выявления анти-HCV IgG и РНК HCV. Контрольную группу (n=531) составили практически здоровые лица, из которых 220 были бурятами, а 311 — халха-монголами.

Генетическое исследование проведено в соответствии с Хельсинкской декларацией (2013) и одобрено Этическим комитетом Иркутского государственного медицинского университета. Все обследуемые лица дали информированное согласие на его проведение.

Генотипирование вируса методом ПЦР осуществляли с использованием набора «АмплиСенс-НСV-генотип» (Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора РФ).

С целью оценки возможного влияния генетических маркеров на селекцию определенного генотипа вируса, доминирующего в популяции, в указанных выборках больных и здоровых лиц выполнены генетические исследования двенадцати ОНП девяти генов: IFNL1 (rs30461); IFNL3 (rs12979860 и rs8099917); IFNL4 (rs368234815); CD209 (rs4804803); TLR3 (rs3775291 и rs13126816); TLR7 (rs179008 и rs179009); IFITM (rs12252); MyD88 (rs6853); IFIH1 (rs1990760). При выборе ОНП авторы рассматривали полиморфизмы в генах, которые кодируют синтез рецепторов или адаптерных молекул, имеющих большое значение в качестве противовирусных факторов врожденного иммунитета [11]. Предварительный анализ источников литературы [7–9, 11, 12] показал наличие сигнальных белков, чьи гены практически не изучались при вирусном гепатите С, но которые играют большую роль в обеспечении врожденной устойчивости при других вирусных инфекциях.

Молекулярно-генетические исследования осуществляли с использованием амплификатора для проведения ПЦР в режиме реального времени Rotor-Gene Q (Qiagen Hilden, Германия). Амплификацию определенных участков генов выполняли с помощью соответствующих праймеров. Анализ генотипов гена IFNL3 проводили с помощью набора реагентов для определения ОНП rs8099917 и rs12979860 «АмплиСенс» (Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора РФ) методом ПЦР-РВ. Для определения остальных генотипов использовали праймеры и зонды собственного дизайна (табл. 1), синтезированные в НПФ «Синтол» и ЗАО «Евроген» (Россия).

Таблица 1. Вариабельные сайты генов врожденного иммунитета и праймеры для их определения в ПЦР

Для повышения эффективности амплификации использовали технику «горячего старта» с полимеразой TaqF («Интерлабсервис», Россия). Режим ПЦР: денатурация пробы при температуре 95°С в течение 15 мин, а затем 45 циклов: 95°С — 15 с, 60°С — 30 с.

Статистическую обработку первичных материалов проводили с использованием общепринятых параметрических и непараметрических критериев статистики в программе Statistica 6.1 (StatSoft Inc., США). Для статистического анализа кандидатных генетических исследований использовали программу SNPStats (http://bioinfo.iconcologia.net/SNPStats). Для каждого ОНП статистический анализ был выполнен по различным моделям наследования: кодоминантной, доминантной, рецессивной, сверхдоминантной и лог-аддитивной. При этом модель с наименьшим значением информационного критерия Акаике (Akaike information criterion) для каждого генного полиморфизма принималась в качестве наиболее вероятной [13]. При анализе результатов генетических исследований проводили сравнение показателей встречаемости аллелей генов и их комбинаций в виде генотипов. Распределение генотипов по каждому локусу проверяли на соответствие закону Харди–Вайнберга. Расчет отношения шансов (OR — оdds ratio) проводили при уровне доверительного интервала 95% CI (95% confidence interval). Расчет величины OR при нулевом значении показателя осуществляли по методу Вульфа–Холдейна [14]. Уровень статистической значимости принят при р≤0,05.

Результаты

Сравнительный анализ клинико-лабораторных показателей у больных ХГС монголов и бурят приведен в табл. 2.

Таблица 2. Клинико-лабораторная характеристика больных хроническим гепатитом С в этнических группах бурят и монголов (M±m)

Клиническая симптоматика не показала каких-либо особенностей течения ХГС. Единственное статистически значимое отличие такого показателя, как уровень гемоглобина в крови, отражает физиологическую реакцию организма на климато-географические условия проживания монголов. Город Улан-Батор расположен на межгорном плато на высоте 1300–1350 м над уровнем моря, что на 600–800 м выше, чем Улан-Удэ [10].

Генотипическое разнообразие HCV было исследовано на основании анализа 200 ПЦР-позитивных проб крови больных ХГС, проживающих в Бурятии, и 200 — в Монголии (табл. 3). Установлено, что у монголов, больных ХГС, преобладает HCV-1 (98,0%), что значимо выше (р<0,001), чем у бурят (66,0%). Удельный вес других генотипов в каждой из сравниваемых групп был существенно меньше. Так, на НСV-2 и НСV-3 приходилось 2,0% у монголов и 34,0% — у бурят (р<0,001). Кроме указанных вариантов выявлены единичные пациенты с сочетанием двух и более генотипов, а также с нетипируемыми генотипами HCV, которые были исключены из статистического анализа с целью сохранения репрезентативности выборки.

Таблица 3. Удельный вес генотипов вируса гепатита С, вызвавших хронический вирусный гепатит С в этнической группе бурят и монголов (M±m)

На первом этапе работы проведено сравнение распространенности вариабельных сайтов изучаемых генов в популяциях здоровых лиц в этнических группах бурят и монголов (табл. 4).

Таблица 4. Распространенность однонуклеотидных полиморфизмов генов врожденного иммунитета среди здоровых лиц в этнических группах бурят и монголов

Установлены существенные различия в частоте встречаемости у этих лиц одного ОНП гена, кодирующего синтез интерферона-λ3, и трех ОНП генов, кодирующих синтез толл-подобных эндосомальных паттерн-распознающих рецепторов (TLR). Так, у здоровых монголов реже встречался GG-генотип TLR3 rs3775291 (OR=0,54; CI=0,38–0,77; p=0,0006). Вместе с тем значительно чаще встречались ТТ-генотип IFNL3 rs8099917 (OR=1,62; СI=1,06–2,49; p=0,026), GG-генотип TLR3 rs13126816 (OR=1,59; CI=1,10–2,30; p=0,013) и АА-генотип TLR7 rs179008 (OR=6,63; CI=1,85–23,75; p=0,00097). Последний из указанных генотипов отличался также тем, что 98,4% представителей этнической группы монголов являлись носителями доминантных АА-гомозиготных вариантов и лишь у трех обследованных в составе генотипа был обнаружен минорный Т-аллель.

Выявленные различия в частоте встречаемости этих четырех кандидатных генов у здоровых лиц обеих этнических групп послужили основанием для их дальнейшего изучения как потенциальных генетических факторов предрасположенности к инфицированию HCV-1 или толерантности к инфицированию HCV-2/3. Сравнительный анализ ОНП указанных генов в этнических группах монголов и бурят, больных ХГС, вызванным HCV-1, установил однотипные закономерности. В обеих группах значимо реже, чем у здоровых лиц, встречался ТТ-генотип IFNL3 rs8099917 (соответственно 65,9 и 77,7% у бурят; р=0,005 и 73,5 и 83,3% у монголов; р=0,002) и GG-генотип TLR3 rs3775291 (47,0 и 61,8% у бурят; р=0,007 и 56,1 и 72,0% у монголов; р=0,0002).

Сравнение генотипического разнообразия ОНП генов IFNL3 (rs8099917), TLR3 (rs3775291 и rs13126816), TLR7 (rs179008) у больных ХГС, инфицированных HCV-1 и HCV-2/3, было выполнено только в когорте больных бурят, так как в Монголии выявляются лишь единичные больные ХГС с не 1-м генотипом вируса. Проведенный анализ не позволил установить наличие ассоциации между генотипами вируса и генотипами ОНП изучаемых генов. Однако анализ по аллелям выявил значимо более высокую встречаемость Т-аллеля среди женщин-бурят, инфицированных не 1-м генотипом вируса (табл. 5).

Таблица 5. Распространенность однонуклеотидных полиморфизмов гена TLR7 (rs179008) среди больных хроническим гепатитом С 1-го и не 1-го генотипов в сравнении с больными хроническим гепатитом С (не 1-й генотип) в этнической группе бурят женского пола, абс. число/%

Обсуждение

Исследование показало, что структура генотипов HCV существенно отличалась в Монголии и в соседней Бурятии. На территории Монголии обнаружено доминирующее преобладание HCV-1 (98,0%), что значимо выше (р<0,001) его распространенности на территории Бурятии (66,0%). В условиях полной сопоставимости групп по клинико-лабораторным и половозрастным показателям естественно предположить, что причиной доминирования 1-го генотипа вируса среди монголов может быть полиморфизм генов врожденного иммунитета, которые создают селективные преимущества для распространения данного генотипа или препятствуют циркуляции HCV-2/3 за счет генетической толерантности к инфицированию. Первыми работами в этом направлении, выполненными на этнических группах европеоидов, были исследования P. Wietzke-Braun с соавт. (2006) и E. Askar с соавт. (2009) [15, 16]. В одной из них был описан ОНП гена интерферон-регулирующего фактора IRF-1, который обеспечивает генетическую резистентность к HCV-3a [15]. В другой работе был обнаружен гомозиготный генотип ТТ rs3775291 гена TLR3, носители которого не болеют HCV-1a [16]. Поиски механизма этого явления привели авторов к выводу, что в основе резистентности некоторых людей к HCV-1a могут лежать активные реакции врожденного иммунитета. У лиц европеоидной расы, имеющих ТТ-генотип rs3775291, в ответ на индукторы обнаружена выраженная экспрессия гена TLR3 в клетках печени, обеспечивающая последующую активацию интерферон-регулирующего фактора-3 (IRF-3) и ядерного фактора κB(NF-κB), что приводит к интенсивной выработке интерферона-β и провоспалительных цитокинов [16].

В настоящей работе среди генетических факторов, которые могут оказывать влияние на формирование структуры циркулирующих генотипов HCV в популяции бурят и монголов, выявлены ОНП трех генов (IFNL3, TLR3 и TLR7), частота встречаемости которых существенно отличалась в изучаемых когортах.

Генотипы вариабельных сайтов IFNL3 относятся к одним из первых полиморфизмов, описанных при вирусном гепатите С, имеющих ассоциацию со спонтанным клиренсом вируса и ответом на противовирусное лечение препаратами интерферона и рибавирина [17]. В настоящем исследовании установлено, что благоприятный в отношении спонтанного клиренса HCV генотип ТТ rs8099917 IFNL3 существенно чаще встречается в популяции здоровых монголов, чем у бурят.

Другие ОНП, распределение которых значимо отличалось среди здоровых монголов и бурят, были локализованы в генах TLR3 (rs3775291, rs13126816) и TLR7 (rs179008). TRL относятся к паттерн-распознающим рецепторам и принимают активное участие в запуске и регуляции цитокинового воспаления. TLR3- и TLR7-рецепторы локализованы трансмембранно на эндосоме, куда попадает вирус после интернализации. Эти рецепторы распознают одно-, двуспиральную РНК, которая образуется в процессе репликации и сборки частиц практически всех РНК-содержащих вирусов. Полиморфизм генов TLR может оказывать влияние как на распознавание вируса (процессинг), так и на активацию сигнального пути, вызывающего воспаление (сигналинг). Сравнение полиморфизмов обоих генов показало существенные различия в частоте их встречаемости в сравниваемых этнических группах. Таким образом, обследование практически здорового населения монголов и бурят выявило три кандидатных гена, ОНП которых могут оказывать влияние на структуру генотипов HCV, циркулирующих в популяции.

Дальнейшие исследования были сосредоточены на анализе вышеуказанных четырех полиморфизмов в трех кандидатных генах IFNL3, TLR3 и TLR7 в популяции монголов и бурят, больных ХГС, вызванным различными генотипами вируса. Более частая встречаемость благоприятного генотипа ТТ rs8099917 гена IFNL3 среди здоровых лиц в сравнении с больными ХГС, вызванным HCV-1, как среди монголов, так и среди бурят, подтверждает хорошо известный факт генетической устойчивости носителей данного генотипа к инфицированию HCV [17]. Как показали полученные данные, исследование использования ОНП rs8099917 гена IFNL3 как прогностического фактора, применяемого для европеоидов и негроидов, приемлемо и для этнических групп монголоидов, проживающих на территории Бурятии и Монголии.

Кроме ОНП гена IFNL3 был обнаружен еще один вариабельный сайт rs13126816 гена TLR3, GG-генотип которого маркирует устойчивость к заболеванию вирусным гепатитом С, вызванным HCV-1. Этот ОНП также был универсальным и касался обеих этнических групп. Носители GG-генотипа имели меньший риск заболевания по сравнению с остальными лицами: среди монголов — в два раза, а среди бурят — в 1,8 раза. Предшествующее исследование этого ОНП у европеоидов [18] показало, что макрофаги людей, носителей G-аллеля, способны к быстрой и мощной продукции интерферона-β. По данным исследования, выполненного в США в этнических группах европеоидов, афроамериканцев и латиноамериканцев [18], G-аллель rs13126816 гена TLR3 был ассоциирован с высокой частотой спонтанного клиренса HCV-1. Этот же ОНП ассоциирован с устойчивостью индивидуумов к вирусу герпеса [19]. Таким образом, в исследуемых группах обнаружены два ОНП (rs8099917 IFNL3 и rs13126816 TLR3), дикие генотипы которых определяют устойчивость их носителей к инфицированию HCV-1.

Поиск генотипов генов, вовлеченных в реакции врожденного иммунитета, у больных ХГС, вызванным 1-м и 2/3-м генотипами HCV, не выявил их существенных отличий в группах. Вместе с тем анализ по отдельным аллелям установил, что Т-аллель rs179008 гена TLR7 более чем в два раза чаще встречается у женщин, больных ХГС, вызванным 2/3-м генотипом, чем 1-м (р=0,04). ОНП rs179008 гена TLR7 локализован в 3-м экзоне Х-хромосомы. По своему характеру данный ОНП является несинонимическим и характеризуется заменой в кодируемом белке глютамина (Gln) на лейцин (Leu). В результате сигнальный пептид рецептора TLR7 проявляет функциональную неполноценность [20]. В ответ на синтетические индукторы в дендритных клетках и гепатоцитах носителей минорного Т-аллеля наблюдается низкая экспрессия мРНК IFNL1, IL-10Rβ и IL-28Rα [21]. Кроме этого, Т-аллель ассоциирован с высокой вирусной нагрузкой, плохим ответом на противовирусную терапию и предрасположенностью к быстрому прогрессированию ВИЧ-инфекции у женщин [21, 22]. Мононуклеары здоровых людей, носителей Т-аллеля, in vitro слабо продуцируют IFN-α в ответ на индукторы интерферона [22]. Очевидно, более частая встречаемость мутантного гена TLR7 у женщин, больных ХГС, вызванным не 1-м генотипом вируса, является следствием слабого интерферонового и цитокинового ответа на инфицирование.

Как известно, HCV-2/3 проявляют более высокую чувствительность к IFN-α в отличие от HCV-1 и HCV-4. Генетическое нарушение синтеза IFN-α в ответ на инфицирование HCV-2/3 является весьма значимым фактором обеспечения длительной персистенции данных генотипов вируса. Редкое присутствие среди населения Монголии ТТ-генотипа rs179008 гена TLR7 (0,5%) определяет популяционную устойчивость населения к инфицированию HCV-2/3 и обусловливает абсолютное доминирование HCV-1. Причины отсутствия минорного мутантного Т-аллеля rs179008 гена TLR7 требуют дополнительных исследований и могут лежать у населения Монголии в основе особенностей структуры генотипов не только HCV, но и других вирусов, при которых реакции врожденного иммунитета играют существенную роль. Определенное значение может иметь и копийность гена TLR7, частота встречаемости которой среди населения Монголии остается неизученной.

Заключение

Проведенные исследования позволили обнаружить кандидатный ген TLR7, вариабельные сайты которого (rs179008) с различной частотой встречаются у женщин-бурят, больных 1-м и не 1-м (2/3) генотипами вируса. Т-аллель более чем в два раза чаще встречается у больных не 1-м генотипом вируса (17,1 и 8,2% соответственно). Низкая распространенность 2/3-го генотипов HCV на территории Монголии может быть обусловлена редкой встречаемостью среди населения мутантного Т-аллеля TLR7 (rs179008), ассоциированного с предрасположенностью к инфицированию HCV-2/3, что в настоящей работе продемонстрировано на примере этнической группы бурят.

Финансирование исследования. Работа выполнена за счет средств гранта Российского фонда фундаментальных исследований №16-54-44047.

Конфликт интересов. У авторов статьи конфликта интересов не имеется.