BDNF-опосредованная регуляция функционального состояния митохондрий клеток головного мозга в условиях гипоксии

Введение

Гипоксия является одним из ведущих факторов повреждения клеток головного мозга, сопровождающих травматические и ишемические процессы. Повышенная чувствительность ткани мозга к дефициту кислорода обусловлена большим расходом энергии на осуществление его функций. Мишенью для гипоксии/ишемии служат митохондрии. Снижение концентрации кислорода вызывает нарушения электрон-транспортной функции их дыхательной цепи и является фазным процессом (рис. 1). Причем повреждения неспецифичны, так как всегда начинаются в области митохондриального ферментного комплекса I (NAD-зависимый участок дыхательной цепи) и затем распространяются на область цитохромов В, С и цитохромоксидазу [1–8].

Рис. 1. Схема работы митохондриальной дыхательной цепи: а — в условиях нормоксии; б — в условиях гипоксии; ЦТК — цикл трикарбоновых кислот

Вопросы фармакологической коррекции гипоксии головного мозга в настоящее время относятся к числу приоритетных биолого-медицинских проблем. При разнообразии препаратов — антигипоксантов — существуют различные ограничения в их применении при патологиях головного мозга, обусловленные наличием большого количества побочных эффектов и сложностью прохождения через гематоэнцефалический барьер. Отметим, что большой научный интерес сегодня представляют молекулы эндогенного происхождения, способные реализовать внутриклеточные молекулярные каскады с участием генетического аппарата клетки и не только запустить клеточные адаптационные механизмы, но и подкрепить их перестройкой энергетического обмена. Такое свойство позволяет потенциальным молекулам-антигипоксантам активировать необходимые процессы, например нейропротекции или нейропластичности.

Ряд исследований [9, 10] показал, что среди химических веществ, потенциально способных контро­лировать уровень метаболизма клетки в условиях сниженного содержания кислорода, выделяется нейротрофический фактор головного мозга (BDNF — brain-derived neurotrophic factor). В частности, установлено, что BDNF оказывает влияние на показатель дыхательного контроля митохондрий клеток головного мозга (увеличивается скорость окислительного фосфорилирования). Этот эффект опосредуется работой магистрального пути TrkB-сигнализации (сигнальный каскад, работающий при связывании BDNF с TrkB через митоген-активированную протеинкиназу — MAP) [9]. Также показано [10], что превентивное введение нейротрофического фактора повышает устойчивость животных к действию острой гипобарической гипоксии посредством увеличения времени жизни на высоте и предотвращает нарушение пространственной памяти в постгипоксический период.

В данной работе сделан акцент на изучение возможности BDNF модулировать эффекты гипоксии при регуляции функционального состояния митохондрий посредством связи BDNF — TrkB.

Цель исследования — изучить влияние TrkB-опосредованного действия BDNF на выживаемость животных и работу I, II комплексов дыхательной цепи митохондрий клеток головного мозга при моделировании острой гипобарической гипоксии in vivo.

Материалы и методы

Эксперименты in vivo были выполнены на мышах (половозрелых самцах) линии СВА массой 20–25 г. Содержание животных в сертифицированном виварии Национального исследовательского Нижегородского государственного университета и исследовательская работа проводились в соответствии с требованиями приказов №1179 МЗ СССР от 11.10.1983 и №267 МЗ РФ от 19.06.2003, а также в соответствии с международными правилами «Guide for the Care and Use of Laboratory Animals», отвечали требованиям Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (Cтрасбург, 2006) и были согласованы с биоэтической комиссией Национального исследовательского Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского.

Все животные были разделены на следующие группы: 1-я — интактные; 2-я — контрольные животные, подвергшиеся острой гипобарической гипоксии без введения изучаемых веществ; 3-я — животные с острой гипобарической гипоксией и превентивным введением (внутрибрюшинно) селективного блокатора TrkB-рецепторов ANA-12 в концентрации 0,5 мг/кг; 4-я — животные с острой гипобарической гипоксией и превентивным введением (интраназально) BDNF в концентрации 4 мкг/кг; 5-я — группа сравнения, животные с острой гипобарической гипоксией и превентивным введением 1% диметилсульфоксида (ДМСО) в комбинации с Twееn 20 для исключения влияния растворителей ANA-12 на исследуемые параметры. Выбор дозы используемых веществ был основан на результатах предшествующих исследований [10, 11]. Введение препаратов осуществляли за 45 мин до моделирования острой гипобарической гипоксии.

Для моделирования острой гипобарической гипоксии мышей помещали в барокамеру, в которой создавали давление 220–240 мм рт. ст., что соответствует высоте 10 000 м над уровнем моря [12].

Определение функциональной активности митохондрий проводили через 24 ч после моделирования острой гипобарической гипоксии. Выделение митохондрий осуществляли стандартным дифференциальным центрифугированием [13]. Все манипуляции выполняли на льду. Оборудование и среды выделения были охлаждены. После декапитации животных быстро вскрывали черепную коробку, иссекали головной мозг (не более 20 с), помещали его в предварительно охлажденную фарфоровую ступку и промывали ледяной средой выделения следующего состава: 70 мМ сахароза, 210 мМ маннитол, 30 мМ HEPES, 0,1 мМ ЭДТА (рН=7,4), после чего удаляли мозжечок. Большие полушария и стволовую часть мозга подвергали гомогенизации в среде выделения в стеклянной гомогенизаторной пробирке, помещенной в лед. Тефлоновый пестик гомогенизатора c клиренсом, исключавшим разрушение митохондрий, приводили в движение электромотором. Соотношение массы ткани и среды выделения — 1:7. Полученный гомогенат мозга подвергали предварительному центрифугированию при 2700 об./мин (температурный интервал от –3 до 0ºС, 10 мин). Супернатант сливали в пробирку и подвергали центрифугированию в течение 15 мин при 8500 g. Осажденные митохондрии промывали холодной (+4ºС) средой выделения и ресуспендировали в среде, содержавшей 210 мМ маннитола, 70 мМ сахарозы, 0,1 мМ ЭГТА, 10 мМ HEPES (pH=7,4), и вновь центрифугировали в течение 15 мин при 8500 g. Полученную суспензию митохондрий хранили на льду, не допуская замораживания. Определение содержания белка в изолированных митохондриях проводили по методу Брэдфорда.

Потребление кислорода изолированными митохондриями регистрировали полярографически при помощи респирометра высокого разрешения OROBOROS Oxygraph-2k (OROBOROS Instruments, Австрия) в 2 мл среды инкубации (маннит — 210 мМ, сахароза — 70 мМ, ЭГТА — 0,1 мМ, HEPES — 10 мМ, рН=7,4) при постоянном перемешивании. Скорость потребления кислорода выражали в пикомолях за 1 с в расчете на 1 мг белка митохондрий.

Потребление кислорода в камере фиксировали с использованием программного обеспечения DatLab5 (OROBOROS Instruments, Австрия).

Состояние дыхательной цепи митохондрий оценивали, используя следующие параметры: скорость потребления кислорода митохондриями при высоком содержании в среде инкубации субстратов — 5 мМ глутамата и 5 мМ малата (субстраты I комплекса) (рис. 2, состояние 1); скорость окислительного фосфорилирования дыхательной цепи в присутствии 5 мМ аденозиндифосфата (АДФ) (рис. 2, состояние 2); ингибирование работы I комплекса 0,5 мкМ ротеноном (рис. 2, состояние 3) и интенсивность работы II комплекса дыхательной цепи при его стимулировании 10 мМ сукцинатом натрия (рис. 2, состояние 4).

Рис. 2. Характерный пример регистрации скорости потребления кислорода митохондриями Показано последовательное внесение компонентов дыхательной цепи к суспензии митохондрий, находящихся в среде инкубации: 1 — скорость потребления кислорода митохондриями при высоком содержании в среде инкубации субстратов I комплекса — 5 мМ глутамата и 5 мМ малата (переход электронов от атомов водорода NADH на ферменты дыхательной цепи); 2 — стимулирование окислительного фосфорилирования дыхательной цепи митохондрий внесением в среду инкубации митохондрий экзогенного 5 мМ АДФ (процесс окисления восстановленных эквивалентов NADH ферментами дыхательной цепи, сопровождающийся синтезом АТФ); 3 — ингибирование работы I комплекса 0,5 мкМ раствором ротенона (блокирование передачи электронов в I комплексе с железосерных кластеров на окисленный убихинон); 4 — сукцинатзависимый путь окисления субстратов (внесение в среду инкубации субстрата II комплекса дыхательной цепи сукцината)

Полученные результаты представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM). До­стоверность различий между экспериментальными группами определяли при помощи критерия Манна–Уитни в программе SigmaPlot 11.0 (Systat Software Inc., США). Различия считались статистически значимыми при p≤0,05.

Результаты

На первом этапе исследования проводили оценку нейропротективного эффекта BDNF при моделировании острой гипобарической гипоксии и выявление роли TrkB-рецепторов в его реализации.

Установлено, что выживаемость животных при моделировании гипоксии составила 27%; в группе мышей, которым вводили ANA-12, — 13%, что в 2 раза ниже контрольных значений; а в группе животных с применением BDNF — в среднем 40%, что в 1,4 раза выше, чем в группе контроля (рис. 3). Процент выживших мышей в группе с введением ДМСО не отличался от значений контрольной группы и также составил 27%.

Рис. 3. Выживаемость мышей линии CBA после моделирования острой гипобарической гипоксии

Следующим этапом исследования явилась оценка скорости потребления кислорода митохондриями в норме и при моделировании острой гипобарической гипоксии. Результаты показали, что базальная скорость потребления кислорода при окислении субстратов глутамата и малата в конт­рольной группе достоверно снижается по сравнению с интактными значениями на 25,5% и составляет 2096,99±200,90 пмоль/(с·мл) на 1 мг белка (рис. 4). Применение блокатора TrkB-рецепторов ANA-12 в условиях острой гипобарической гипоксии сохраняет показатели NADH-окисления в пределах конт­рольных значений. Превентивное введение BDNF оказывает положительное влияние на процесс окисления NADH при гипоксии. Не выявлено достоверных отличий между значениями интактной группы (2814,74±188,20 пмоль/(с·мл) на 1 мг белка) и группы с применением BDNF (2340,92±147,50 пмоль/(с·мл) на 1 мг белка).

Рис. 4. Базальная скорость потребления кислорода митохондриями на фоне избытка субстратов глутамата и малата * — статистически значимая разница значений с интактной группой, p≤0,05; # — с контрольной группой, p≤0,05; критерий Манна–Уитни

Скорость окислительного фосфорилирования дыхательной цепи митохондрий контрольной группы после моделирования гипоксии статистически значимо снижается на 24% относительно интактных значений и составляет 12 565,1±80,4 пмоль/(с·мл) на 1 мг белка (рис. 5). Однако отмечено увеличение скорости субстратного фосфорилирования АДФ в группах с применением ANA-12 и BDNF: эта скорость составила 18 466,8±474,9 и 17 909,5±954,6 пмоль/(с·мл) на 1 мг белка соответственно, что на 47 и 43% выше конт­рольных значений.

Рис. 5. Окислительное фосфорилирование дыхательной цепи митохондрий * — статистически значимая разница значений с интактной группой, p≤0,05; # — с контрольной группой, p≤0,05; критерий Манна–Уитни

Интересно отметить, что нами не обнаружено достоверных отличий между показателями активности II комплекса дыхательной цепи митохондрий (рис. 6). Интенсивность дыхания митохондрий клеток головного мозга при окислении сукцината в группах статистически значимо не отличалась от соответствующих конт­рольных значений (10 409,4±1329,1 пмоль/(с·мл) на 1 мг белка).

Рис 6. Сукцинатзависимый путь окисления субстратов (активная работа II комплекса дыхательной цепи митохондрий при окислении сукцината)

Обсуждение

Исследование влияния BDNF на устойчивость мышей линии СВА к повреждающему действию гипоксии показало, что данный фактор в концентрации 4 мкг/кг повышает выживаемость животных. Однако этот эффект нивелируется при блокаде TrkB-рецепторов. Можно предположить, что защитные механизмы BDNF, обусловленные способностью зрелой молекулы белка связываться с данным рецептором, активируют внутриклеточные сигнальные каскады, повышающие выживаемость нервных клеток в условиях гипоксии. Так, при активации белкового комплекса NF-kB (nuclear factor kappa B) экспрессируются антиапоптотические белки семейств Bcl2 и IAP. Данный эффект наряду с активацией других факторов (например, с-jun, cIAP1) служит основным тормозящим апоптоз агентом [10, 14, 15].

Молекулярные механизмы любой формы гипоксии связаны с подавлением аэробного синтеза энергии, энергозависимых функций и, как следствие, формированием функционально-метаболических нарушений, которые вызывают дисфункцию митохондриального аппарата, выражающуюся в фазных изменениях активности митохондриальных ферментативных комплексов [16].

Нами показано, что в условиях недостатка кислорода снижение окислительной способности NADH-зависимого звена дыхательной цепи митохондрий опосредовано BDNF-TrkB-сигнализацией. Было установлено, что в условиях острой гипобарической гипоксии скорость потребления кислорода при окислении глутамата и малата коррелирует с показателями скорости потребления кислорода с применением селективного блокатора TrkB-рецепторов ANA-12. Однако превентивное введение BDNF восстанавливает скорость практически до интактных значений. Схожие данные были получены в работах А. Markham с соавт. [9]. Ученые показали, что BDNF влияет на работу I комплекса дыхательной цепи митохондрий клеток головного мозга при окислении глутамата и малата за счет MAP-киназы (одного из трех сигнальных каскадов при связывании BDNF с TrkB). Они также выявили, что данный эффект специфичен для митохондрий клеток головного мозга (на препаратах печени аналогичные изменения отсутствовали).

Нейротрофический фактор головного мозга также оказывает влияние на окислительное фосфорилирование посредством BDNF-TrkB-сигнализации, которое выражается в увеличении дыхательного контроля. Результаты наших исследований показывают, что в условиях острой гипобарической гипоксии BDNF поддерживает скорость синтеза АТФ в пределах интактных значений, но при этом блокада TrkB-рецепторов не влияет на изменение показателей окислительного фосфорилирования. Можно предположить, что при инактивации TrkB-рецепторов в условиях нехватки кислорода регуляция эндогенного BDNF опосредована за счет рецепторов TrkА и TrkС, которые находятся в активном состоянии.

Отсутствие достоверных изменений в значениях интенсивности дыхания по сукцинатзависимому пути окисления субстратов может быть связано с временным показателем постгипоксического периода. В литературе имеется немалое количество экспериментальных подтверждений нарушения электрон-транспортной функции I комплекса дыхательной цепи в условиях гипоксии, которая сохраняется первые 30 мин–2 ч реоксигенации. Нами показано, что через сутки после моделирования острой гипобарической гипоксии нормализуется работа II комплекса дыхательной цепи [1, 17].

Таким образом, способность BDNF положительно влиять на выживаемость и работу дыхательной цепи митохондрий клеток головного мозга демонстрирует его исключительную важность как компонента эндогенной антигипоксической системы защиты.

Заключение

Нейротрофический фактор головного мозга (BDNF)повышает устойчивость животных к действию острой гипобарической гипоксии и оказывает влияние на работу дыхательной цепи митохондрий посредством TrkB-сигнализации. Антигипоксический эффект реализуется за счет сохранения активности NADH-зависимого пути окисления субстратов.

Финансирование исследования. Исследование выполнено при поддержке Российского научного фонда (проект 17-75-10149).

Конфликт интересов. У авторов нет конфликта интересов.