Гипоксическое прекондиционирование донорской области: клинико-морфологическая оценка состояния аутодермотрансплантата кожи

Введение

Одной из основных этиологических причин возникновения хронических ран мягких тканей при диабете является тканевая гипоксия на фоне поражения сосудов нижних конечностей [1]. Синдром диабетической стопы развивается у 8–10% таких больных, при этом, по данным ВОЗ, за период с 1980 по 2014 г. количество больных диабетом увеличилось в 4 раза [2]. Современные возможности эндоваскулярной хирургии с большой вероятностью позволяют предотвратить ампутацию конечности при критической ишемии [3], однако при этом сохраняются хронические раны и встает задача закрытия раневого дефекта в условиях тканевой гипоксии. Трудности решения этой задачи обусловлены особенностью раневого процесса на фоне гипергликемии — нарушением микроциркуляции в области раневого дефекта: в базальной мембране артериол накапливаются гликопротеины, утолщается стенка капилляров, что резко затрудняет диффузию кислорода [4].

Эффективным способом закрытия хронических ран служит свободная кожная пластика расщепленным лоскутом [5]. Известно, что ключевым фактором в процессе приживления аутодермотрансплантата является активность ангиогенеза [6–8]. В нормальных условиях кожный трансплантат, помещенный в реципиентную рану, получает питание путем диффузии, а прорастание сосудов отмечается на 5-е сутки после операции [9]. Для подготовки трансплантата к условиям недостатка кислорода и повышения вероятности его выживания в стрессовых условиях гипоксии предложено несколько методов гипоксического прекондиционирования донорской области перед взятием расщепленного кожного лоскута [10]. Суть любого из методов гипоксического прекондиционирования сводится к снижению уровня микроциркуляции в донорской области и имитации таким образом гипоксического состояния тканей в области раневого дефекта, при этом контроль кровоснабжения осуществляют при помощи лазерной доплеровской флоуметрии или тканевой оксиметрии.

Ранее нами [11] по данным иммуноферментного анализа было установлено, что в результате гипоксического прекондиционирования (снижения микроциркуляции в коже донорской области) путем нанесения двух параллельных разрезов кожи и подкожной клетчатки глубиной до поверхностной фасции повышается концентрация специфического цитокина и кислородочувствительного белка — индуцированного гипоксией фактора (HIF-1α, hypoxia-inducible factor 1α). Этот фактор, накапливаясь в тканях в условиях гипоксии, отвечает за экспрессию белков, контролирующих доставку кислорода в клетку, и является ключевым регулятором для основных факторов ангиогенеза. Кроме того, результаты фундаментальных исследований [12] позволяют предположить, что накопление цитокина HIF-1α в коже донорского участка приведет к активации процессов ангиогенеза и в аутодермотрансплантате, взятом из этой области. Данных, позволяющих объективно оценить изменения активности ангиогенеза и репаративной регенерации в кожном трансплантате после его гипоксической тренировки, в доступной литературе мы не обнаружили.

Цель исследования — оценить эффективность метода гипоксического прекондиционирования донорской области путем клинико-морфологического изучения свойств сформированного аутодермотрансплантата.

Материалы и методы

Клиническое исследование одобрено Этическим комитетом по проведению научных исследований с участием человека в качестве объекта исследования Приволжского федерального исследовательского университета и выполнено в полном соответствии с действующими нормативно-правовыми актами. Критериями включения в исследование явились:

добровольное информированное согласие пациента на участие в исследовании;

нейроишемическая форма синдрома диабетической стопы II стадии по F.M. Wagner;

выполненная не ранее чем за 14 сут до включения пациента в исследование реконструктивная сосудистая операция на артериях нижних конечностей;

наличие магистрального кровотока в артериях нижних конечностей по данным ультразвуковой доплерографии;

состояние реципиентной раневой поверхности, оцениваемое в 16–17 баллов по Шкале готовности реципиентной раны к свободной аутодермопластике НИИ им. Ю.Ю. Джанелидзе.

В настоящее исследование включены результаты лечения 10 больных (7 женщин и 3 мужчин) с хроническими ранами мягких тканей, сформировавшимися в результате гнойно-некротических осложнений синдрома диабетической стопы. Все пациенты находились на лечении в отделении гнойной хирургии Городской клинической больницы №30 Н. Новгорода в 2016–2017 гг. Возраст больных варьировал от 55 до 85 лет, средний возраст составил 63,2±8,1 года. Все больные страдали сахарным диабетом 2-го типа. Пациенты были разделены на две группы: основная (n=5) — с гипоксическим прекондиционированием донорской зоны и контрольная (n=5) — со свободной кожной пластикой традиционным способом.

Подготовка дефекта мягких тканей (реципиентной раны) к кожной пластике в обеих группах осуществлялась одинаково: ежедневная смена повязок с мазью на полиэтиленоксидной основе; механическое удаление остатков нежизнеспособных тканей и фибрина; за двое суток перед выполнением кожной пластики использовали повязки с протеолитическими ферментами (химотрипсин). У пациентов основной группы донорскую область (переднелатеральная область бедра) предварительно подвергали гипоксическому прекондиционированию по методике В.В. Бесчастнова и соавт. [11]: под местной анестезией наносили два параллельных разреза кожи глубиной до поверхностной фасции длиной 10 см на расстоянии 5 см друг от друга. Под контролем лазерной доплеровской флоуметрии выполняли мобилизацию лоскута кожи до снижения показателя микроциркуляции на 50% от исходного, после чего на разрезы накладывали внутрикожный косметический шов нитью Пролен 4,0.

Объектом изучения служила хроническая рана мягких тканей, закрытая при помощи свободной кожной пластики. Исследовали также процессы репаративной регенерации и ангиогенеза в кожном трансплантате, сформированном из донорской области, не подвергавшейся и предварительно подвергавшейся гипоксическому прекондиционированию, и косметический эффект при заживлении донорской раны. Научная гипотеза заключалась в том, что трансплантат кожи, сформированный из донорской области с предварительным гипоксическим прекондиционированием, имеет бóльшую площадь приживления ввиду стимуляции выделения проангиогенных факторов. Критериями, позволяющими оценить правильность этого предположения, служили: относительная площадь приживления трансплантата; степень экспрессии белка Ki-67, которая позволяет судить о скорости размножения клеток, поскольку этот протеин экспрессируется во всех фазах клеточного цикла кроме фазы G0 (синтетическая); а также концентрация проангиогенных факторов: CD31, Fli-1, васкулярного эндотелиального фактора роста (VEGF) по данным иммуногистохимического анализа.

У всех больных электродерматомом выполняли забор расщепленного кожного трансплантата, затем его на 2 мин помещали в физиологический раствор, содержащий 4 мг дексаметазона, после чего перфорировали и фиксировали на реципиентной ране. На донорскую рану пациентам основной группы с целью скорейшего заживления области разрезов накладывали повязку, содержащую гистоэквивалент-био­пластический материал на основе гиалуроновой кислоты и коллагена (G-Derm, Россия), пациентам контрольной группы — стерильную марлевую повязку, пропитанную 5% раствором перманганата калия.

На 3-и сутки после свободной аутодермопластики выполняли первую перевязку реципиентной раны. Из дистального края трансплантата сосудистыми ножницами иссекали жизнеспособный участок (биоптат) размерами 5×5 мм. Материал фиксировали в растворе нейтрального 10% формалина. Стандартную гистологическую проводку осуществляли на аппарате Excelsior ES (Thermo Scientific, США). После проводки изготовляли парафиновые блоки с использованием заливочной станции HistoStar (Thermo Scientific, США). Срезы толщиной 4–6 мкм получали на микротоме Microm HM 325 (Thermo Scientific, США). Срезы окрашивали гематоксилином и эозином.

Двойное последовательное иммуногистохимическое окрашивание проводили в автоматизированном модуле BOND-MAX, используя систему детекции вond polymer refine detection (протокол F) и Bond polymer refine red detection (протокол J) (Leica Biosystems, Великобритания). Были использованы моноклональные антитела к Ki-67 — clon SP6 (Lab Vision Corporation, США), к CD31 антигену — clon JC70A (Lab Vision Corporation, США), к Fli-1 — clon MRQ-1 (Cell Marque, США) и антитела к VEGF — polyclonal (Diagnostic BioSystems, США).

Для оценки пролиферативной активности подсчитывали количество Кi-67-положительных клеток в дермотрансплантате (в 10 полях зрения) при увеличении в 400 раз. Реакция с моноклональными антителами к Ki-67 позволяет определить количество клеток, подвергшихся делению, поскольку белок экспрессируется только в ядрах пролиферирующих клеток и выявляется в G1- (в конце фазы), G2-, S- и M-фазах клеточного цикла с максимальной экспрессией в фазах G2 и M [13]. Индекс пролиферации (ИП) определяли по формуле

ИП=(n/N)·100%,

где n — количество меченых ядер; N — общее число ядер в поле зрения микроскопа.

Для планиметрической оценки динамики площади приживления трансплантата проводили макрофото­съем­ку реципиентной раны при помощи цифровой фотокамеры. Площадь аутодермотрансплантата измеряли на фотоснимках, используя программу ImageJ.

Для оценки результатов свободной кожной пластики расщепленным лоскутом использовали показатель Р — доля площади приживления аутодермотрансплантата, который рассчитывали по формуле

Р=S₁/S₂·100%,

где S₁ — площадь трансплантата непосредственно после пересадки на реципиентную рану, см²; S₂ — площадь трансплантата на 14-е сутки после операции, см².

Для статистической обработки полученных данных использовали компьютерную программу Statistica 6.0. Для оценки статистической значимости различий при сравнении групп по качественному признаку применяли точный метод Фишера, по количественному признаку — U-критерий Манна–Уитни. Выборочные параметры, приводимые далее, имеют следующие обозначения: Ме — медиана, Q₁ — верхний квартиль, Q₃ — нижний квартиль, n — объем анализируемой подгруппы, р — величина статистической значимости различий. Критическое значение уровня значимости принимали равным 5% (р≤0,05).

Результаты

Оценка эффективности лечения хронической раны мягких тканей показала, что доля площади приживления аутотрансплантата кожи в основной группе составила 91 [84; 95]%, в контрольной — 56 [52; 64]% (p=0,007).

Заживление донорских ран в контрольной группе отмечено на 18 [16; 21]-е сутки, при этом на перевязках больные чувствовали дискомфорт в связи с высыханием повязок и прилипанием их к ране, наблюдались участки изъязвления, формирование грубого рубца. У всех больных основной группы неосложненное заживление донорских ран зафиксировано на 14 [12; 17]-е (р=0,002) сутки, а лечение под повязками G-Derm протекало менее болезненно (рис. 1, а). В основной группе косметический эффект лечения донорской раны все больные оценивали как хороший. В отдаленном послеоперационном периоде формировался мягкий эластичный подвижный участок кожи телесного цвета (рис. 1, б).

---

Рис. 1. Заживление донорской раны у пациентки Е.: а — покрытие гистоэквивалент-биопластическим материалом G-Derm после процедуры гипоксического прекондиционирования; б — вид раны через 1 год: А — рубцы после формирования двух параллельных разрезов; Б — участок донорской раны после формирования трансплантата, рубцевание

---

Гистологическая картина образцов аутодермотрансплантата основной группы представляла собой богатоклеточный фрагмент кожи с большим количеством сосудов эндотелиального типа (рис. 2, а). В конт­рольной группе имелись бедноклеточные участки (рис. 2, б).

---

Рис. 2. Микрофото аутодермотрансплантата основной (а) и контрольной (б) группы; окраска гематоксилином и эозином; x200

---

На поверхности трансплантата, контактирующей с реципиентным ложем, отображаются выраженные явления ангиогенеза с формированием капилляров. При двойном последовательном иммуногистохимическом окрашивании с использованием антител к Ki-67 и CD31 антигенам в основной группе отмечали повышенную пролиферацию эндотелиальных клеток дермы (рис. 3, а) по сравнению с контрольной (рис. 3, б).

---

Рис. 3. Гистологическая картина аутодермотрансплантата основной (а) и контрольной (б) группы: пролиферация клеток дермы, Ki-67-позитивные клетки (коричневое окрашивание); мембраны эндотелиальных клеток (красное окрашивание); двойное последовательное иммуногистохимическое окрашивание с использованием антител к Ki-67 и CD31 антигенам; x200

---

Сетчатый слой трансплантата, сформированного традиционным способом, содержал незначительные очаги некроза соединительной ткани, в подкожно-жировой клетчатке преобладали явления отека и воспаления. В ткани трансплантата после гипоксического прекондиционирования значительно менее были выражены явления стаза эритроцитов в сосудах сосочкового слоя. Кроме того, отмечено существенное уменьшение количества и распространенности кровоизлияний в сосочковом и сетчатом слоях дермы, значительное уменьшение признаков некроза и некробиоза тканей трансплантанта, а также практически полное отсутствие признаков нарушений в системе микроциркуляции.

По данным иммуногистохимического исследования гистологических препаратов ИП в контрольной группе составил 17 [13; 24]%, в основной — 29 [22; 33]% (р=0,011).

На поперечном срезе дермы в основной группе определяется значительное количество клеток, экспрессирующих рецепторы к VEGF (рис. 4, а), в контрольной же группе их количество было минимальным (рис. 4, б).

---

Рис. 4. Микрофото аутодермотрансплантата основной (а) и контрольной (б) группы: клетки, экспрессирующие рецепторы к васкулярному эндотелиальному фактору роста; иммуногистохимическое окрашивание с применением антител к VEGF; x400

---

В составе тканей аутодермотрансплантата иммуногистохимически было выявлено большое число клеток, экспрессировавших белок Fli-1, при этом преобладающее количество эндотелиальных клеток также отмечалось в основной группе (рис. 5).

---

Рис. 5. Микрофото аутодермотрансплантата основной (а) и контрольной (б) группы Иммуногистохимическое окрашивание с применением антител к Fli-1; x200

---

Обсуждение

Большинство современных исследователей сходятся во мнении, что ключевым компонентом морфогенеза хронических ран является гипоксия, при этом адекватным ответом организма служит усиление активности ангиогенеза для обеспечения транспорта кислорода в тканях [14, 15]. Растущий интерес к возможности активного воздействия на процессы ангиогенеза обусловливает необходимость разработки новых методов кожной пластики, в том числе на основе регуляции ангиогенеза путем гипоксического прекондиционирования, а также поиска объективной оценки эффективности новых способов хирургического вмешательства.

В настоящей работе в качестве одного из критериев, позволяющих оценить направленность воздействия на раневой процесс гипоксического прекондиционирования, выбрана пролиферативная активность в ткани аутодермотрансплантата. Одним из наиболее достоверных маркеров пролиферативной активности клеток кожи считается экспрессия белка Ki-67 [16]. Полученные в нашем исследовании результаты свидетельствуют о значительном повышении активности процессов пролиферации тканей аутодермотрансплантата, подвергнутого гипоксическому прекондиционированию.

Поскольку пролиферативная активность напрямую зависит от своевременного и полноценного включения трансплантата в общий системный кровоток, то закономерным является и увеличение активности роста новых сосудов, что и было зафиксировано в результате двойного последовательного иммуногистохимического окрашивания препаратов с использованием антител к Ki-67 и CD31 антигенам. В частности, оценка экспрессии эндотелиального маркера CD31 свидетельствует о более активном формировании сосудистого русла в тканях трансплантатов основной группы. Кроме того, в ткани аутодермотрансплантата после гипоксического прекондиционирования зафиксировано увеличение экс­прессии VEGF, который считается основным среди всех ангиогенных факторов.

Таким образом, метод предварительного гипоксического прекондиционирования аутодермотрансплантата является перспективным способом повышения эффективности свободной кожной пластики, о чем свидетельствуют данные иммуногистохимических методов.

Заключение

Гипоксическое прекондиционирование донорской области перед свободной пластикой расщепленным кожным лоскутом обеспечивает активацию процессов ангиогенеза и репаративной регенерации в ткани аутодермотрансплантата, а также увеличивает площадь его приживления с 56 [52; 64] до 91 [84; 95]% (p=0,007).

Финансирование исследования и конфликт интересов. Исследование не финансировалось какими-либо источниками, и конфликты интересов, связанные с данным исследованием, отсутствуют.