Гистоморфологические изменения перитуморальной зоны у больных локализованным раком предстательной железы как предикторы прогрессии заболевания

Введение

В официальном отчете по состоянию онкологической помощи населению России в 2016 г. указано, что в Ростовской области диагноз рака предстательной железы (РПЖ) имел минимальный показатель морфологического подтверждения — 80,2% по сравнению со среднероссийским — 94,7% [1]. В 2015 г. показатель морфологической верификации диагноза РПЖ в 6 регионах страны, включая Ростовскую область (82,1%), был также низким [2]. Такая проблемная ситуация в последнее время привела в регионе к ответному росту гистологических исследований при РПЖ, накоплению информации, требующей системного анализа совокупности сведений. Исследование гистоморфологических изменений в препаратах предстательной железы, полученных при оперативном лечении РПЖ, для конкретного больного имеет высокое диагностическое значение, а при изучении совокупности сведений может раскрыть прогностический потенциал в отношении общих закономерностей онкологического заболевания.

Все сказанное обусловливает актуальность морфологических исследований при РПЖ. С учетом того факта, что более половины пациентов с впервые верифицированным диагнозом РПЖ (56%) имеют I–II стадию заболевания [1], усилия специалистов должны быть направлены именно на верификацию локализованных форм заболевания и состояний, предшествующих развитию злокачественной опухоли предстательной железы. После радикальной простатэктомии морфологическому исследованию подвергаются не только образцы опухолей, но и участки перифокальной зоны предстательной железы, хирургического края [3]. Однако сведения о тканевых и клеточных особенностях в окружении аденокарциномы простаты (простатическая интраэпителиальная неоплазия (ПИН), признаки склерозирующего аденоза, неспецифического бактериального хронического простатита (ХП)) в литературе встречаются редко [4–6]. Между тем патологические изменения перитуморальной зоны могут служить благоприятной средой для мутагенеза в стромальных и эпителиальных клетках, увеличивающей возможность возникновения мутаций и генетическую нестабильность в прилегающих специфических клетках [7].

Концепция, основанная на том, что факторы окружения и микроокружения играют важную роль в возникновении и развитии опухоли, образовании рецидивов и метастазов, существует с 1990 г. Под термином «микроокружение» подразумевается комплекс факторов, характеризующих события внутри опухоли [8]. Процессы, происходящие в ткани в непосредственной близости от опухоли, входят в понятие «окружение опухоли», или «перитуморальная зона» [9]. Опухолевая прогрессия при РПЖ зависит как от молекулярных изменений эпителиальных клеток, так и от многочисленных изменений стромы, окружающих тканевых и клеточных элементов, обеспечивающих необходимые условия для пролиферации, миграции и инвазии раковых клеток [10, 11].

Изучение связи хронического воспаления, фиброза, дисплазии, гиперплазии в перитуморальной зоне с пролиферативным потенциалом опухолевых клеток может быть полезным для понимания возможных причин ранних рецидивов злокачественных новообразований.

Цель исследования — изучение диспластических, гиперпластических и воспалительных изменений перитуморальной зоны у больных локализованным раком предстательной железы после радикальной простатэктомии и их связи с пролиферативной активностью опухолевых клеток.

Материалы и методы

Работа выполнена в Центре урологии, нефрологии и гемодиализа Областной больницы №2 Ростова-на-Дону, а также в отделении онкоурологии, патологоанатомическом отделении Ростовского научно-исследовательского онкологического института в 2015–2017 гг.

Гистоморфологические исследования операционных биоптатов проведены у 309 больных с локализованным РПЖ (T_1c–T_2cN₀M₀) после радикальной простат­эктомии. Возраст больных общей клинической группы составлял 54–79 лет, в среднем — 65,6±2,5 года.

Критерии включения больных в исследование:

локализованный РПЖ (Т_1с–Т_2с);

наличие данных дооперационного уровня простатспецифического антигена (ПСА);

гистологическое исследование образцов опухоли и перитуморальной зоны;

отсутствие отдаленных метастазов.

Исследование проведено в соответствии с Хель­синкской декларацией (2013) и одобрено Этическим комитетом Ростовского научно-исследовательского он­ко­логического института. От всех пациентов получено информированное согласие.

Распределение больных в зависимости от клинической стадии РПЖ было следующим: с Т_1с — 28 (9,1%); с Т_2а — 33 (10,7%); с Т_2b — 89 (28,8%); с Т_2с — 159 (51,5%). Высокая степень гистопатологической дифференцировки (менее 7 баллов по шкале Глисона) встречалась у 22 больных (7,1%), умеренная (7 баллов по шкале Глисона) — у 283 (91,6%) и низкая (более 7 баллов по шкале Глисона) — у 4 (1,3%).

Полученный хирургом материал после радикальной простатэктомии помещали в 4% раствор забуференного формалина, сразу отправляли в патолого­анатомическое отделение, где хранили не более 24 ч. Для морфологического исследования патологоанатом формировал образцы опухолевой ткани (не менее 3 кусочков), перитуморальной зоны (2 см от опухоли и более из обеих долей железы) путем отсечения конусовидных кусочков размером 1,0×0,5 см. Затем отрезки тканей поперечно нарезали на 15–20 пластинок толщиной 0,3 мм.

При микроскопическом исследовании определяли гистологический тип опухоли, степень гистопатологической дифференцировки. У всех больных гистологический тип опухоли был представлен аденокарциномой. В зависимости от результатов гистологического исследования биоптатов перитуморальной зоны пациентов разделили на подгруппы со следующей патологией: ПИН-2, ПИН-1, доброкачественная гиперплазия предстательной железы (ДГПЖ), ХП.

Для гистологического исследования с помощью световой микроскопии пластинки ткани железы фиксировали в 10% растворе формалина, забуференном по Лилли при рН=7,4, затем заливали в парафин по принятой методике. Серийные срезы толщиной 3–5 мкм депарафинировали по стандартной схеме, окрашивали гематоксилином и эозином. Образцы исследовали в световом микроскопе TOPIC-T (CETI, Нидерланды).

В работе использовали гистологическую классификацию простатита: легкая, умеренная и выраженная степень (Тhe North American Chronic Prostatitis Collaborative Research Network and the International Prostatitis Collaborative Network, 2001) [12]. К высокой степени простатической интраэпителиальной неоплазии относили умеренную и выраженную дисплазию (ПИН-2), к низкой степени — легкую (ПИН-1).

Всем пациентам до операции в сыворотке крови определяли концентрацию ПСА с помощью иммуноферментного анализа на фотометре Multiscan Р2 (Thermo Fisher Scientific Inc., Финляндия).

Иммуногистохимическое исследование проводили в соответствии со стандартным протоколом. Подготовленные серийные срезы наклеивали на поли-L-лизиновые стекла. Депарафинизацию осуществляли в термостате при температуре 60ºС в течение часа. После погружения в ксилол срезы регидрировали проводкой по спиртам в убывающей концентрации в течение 15 мин. Восстановление антигенной активности осуществляли методом теплового демаскирования в 0,01 М цитратном буфере в миниавтоклаве EnVision/HRP (Dako Cytomation, Дания). Блокирование эндогенной пероксидазной активности выполняли с помощью 3% перекиси водорода в течение 10 мин. В работе были использованы моноклональные мышиные антитела к белку Ki-67 (1:200, Diagnostic Biosystems, Испания).

Микроскопическое исследование проводили с использованием светового микроскопа Axioskop 40 (Carl Zeiss, Германия); окуляр — ×10, объективы — ×5, ×10, ×20, ×40, ×100. На первом этапе выявляли локусы с наибольшим числом «положительных» клеток. Положительными считали клетки, окраска ядер которых не вызывала сомнений. Индекс Ki-67 определяли как отношение количества клеток с интенсивной ядерной реакцией к общему числу клеток (не менее 300 клеток). Если индекс Ki-67 был меньше или равен 25%, эта ситуация расценивалась как 1 балл, от 26 до 50% — как 2 балла, от 51 до 75% — как 3 балла и от 76 до 100% — как 4 балла [13].

Статистическая обработка результатов проведена с помощью программы Statistica 10.0 (StatSoft, США). Количественные показатели представлены в виде средней и ошибки средней. Различие долей анализировали с помощью критерия согласия Пирсона c² и критерия Фишера. Различие средних оценивали с помощью непараметрического критерия Манна–Уитни.

Результаты

Отсутствие гистологических изменений в перитуморальной зоне у больных локализованным РПЖ установлено у 52 из 309 пациентов (16,8%). У 257 (83,2%) наблюдались сочетанные с аденокарциномой гистопатологические процессы, структура которых представлена в табл. 1.

Таблица 1. Структура морфологических изменений в перитуморальной зоне у больных локализованным раком предстательной железы (n=257) после радикальной простатэктомии

Хронические воспалительные изменения в перифокальной зоне с наличием скопления лимфоцитов, плазматических клеток и макрофагов в строме, появлением реактивной атипии ядер встречались чаще других патологических процессов (у 186 из 257; 72,4%). Доля выраженной степени тяжести ХП возрастала в ряду РПЖ < РПЖ + ДГПЖ < РПЖ + ПИН-2; доля умеренной по степени тяжести ХП — в ряду РПЖ + ПИН-2 < РПЖ + ДГПЖ = РПЖ; доля ХП легкой степени тяжести повышалась в ряду РПЖ + ПИН-2 < РПЖ < РПЖ (см. рисунок). Таким образом, наиболее выраженные хронические воспалительные изменения в перифокальной зоне наблюдались при одновременном выявлении аденокарциномы простаты и ПИН-2.

Распределение больных раком предстательной железы с различными сочетанными гистопатологическими изменениями в перитуморальной зоне по степени тяжести хронического простатита В таблице представлены доли в процентах, рядом со столбиковыми диаграммами — абсолютные числа

Второе место по частоте встречаемости в перитуморальной зоне занимала ПИН-2 — в 96 образцах из 257 (37,4%). Причем в 27,6% случаев (71 из 257) у больных локализованным РПЖ ПИН-2 выявлялась на фоне хронических воспалительных изменений в предстательной железе (см. табл. 1). В 25,3% случаев (65 из 257) отмечалось сочетанное протекание доброкачественных гиперпластических процессов. Причем в 11 случаях из 65 (17%) ДГПЖ была представлена склерозирующим аденозом. Микроскопически склерозирующий аденоз выглядел как очаг пролиферации мелких, тесно прилегающих друг к другу желез, окруженных выраженным веретеноклеточным стромальным компонентом. Цитоплазма железистых клеток — скудная, ацидофильная, ядра клеток — маленькие, моноформные, с умеренной окраской, без клеточного полиморфизма. Характерно постоянное присутствие базально-клеточного слоя клеток вокруг всех желез. Из непостоянно встречающихся признаков отмечались амилоидные тельца, кристаллоиды, редко — фигуры митоза, солидные очаги.

У больных локализованным РПЖ наличие сочетанной патологии в перифокальной зоне не приводило к статистически значимому изменению средних значений ПСА в сыворотке крови, что потребовало использовать более подробный частотный анализ и сравнение долей (табл. 2).

Таблица 2. Содержание простатспецифического антигена в сыворотке крови у больных локализованным раком предстательной железы с сочетанной патологией, абс. число/%

При частотном анализе установлено, что число больных с концентрацией ПСА в сыворотке крови более 21 нг/мл выше при сочетании РПЖ с ПИН-2 и ХП в перифокальной области по сравнению с изолированной аденокарциномой (16 против 2% при р=0,013).

Для оценки пролиферативной активности опухолевых клеток, в том числе и при РПЖ, традиционно используют иммуногистохимические исследования с антителами к Ki-67 [13]. Ki-67 относится к регуляторным белкам, его экспрессия совпадает со вступлением клетки в митоз. Для наибольшего числа больных с локализованным РПЖ вне зависимости от сочетанной патологии в перитуморальной зоне экспрессия Ki-67 характеризовалась 2 бал­лами (26–50% окрашенных клеток) (табл. 3).

Таблица 3. Распределение больных раком предстательной железы в зависимости от выраженности экспрессии Ki-67 в опухолевых клетках с учетом сочетанной патологии в перитуморальной зоне, абс. число/%

Однако только при сочетании аденокарциномы и ПИН-2 число клеток с экспрессией Ki-67 превышало 50% и характеризовалось 3 (8%) и 4 (1%) баллами. По сравнению с контролем, когда изменения в перифокальной зоне отсутствовали, у пациентов с сочетанием РПЖ + ПИН-2 оценка 1 балл при окраске на Ki-67 встречалась реже (p<0,0001), 2 балла — чаще (p<0,0001), в 9% случаев образцы были оценены 3–4 баллами. При сочетании РПЖ + ПИН-2 + ХП количество опухолевых клеток, экспрессирующих Ki-67, превышало 50% (3–4 балла) уже в 10% случаев. Следовательно, пролиферативная активность опухолевых клеток при одновременном протекании РПЖ и ПИН-2 была повышенной.

Средний балл полуколичественного параметра экспрессии Ki-67 в опухолевых клетках был статистически значимо выше (p<0,05) при сочетании РПЖ и ПИН-2 (2,09±0,04 балла), РПЖ + ПИН-2 + ХП (2,11±0,04 балла) по сравнению с изолированным РПЖ (1,60±0,07 баллов), с РПЖ + ПИН-1 (1,66±0,09 балла), РПЖ + ХП (1,72±0,06 балла), РПЖ + ДГПЖ (1,78±0,06 балла) (табл. 4).

Таблица 4. Балльная оценка и межгрупповой сравнительный анализ экспрессии Ki-67 в опухолевых клетках у больных раком предстательной железы с учетом сочетанной патологии в перитуморальной области

Сходной по величине оказалась оценка экспрессии Ki-67 у больных с РПЖ + ПИН-2 и РПЖ + склерозирующий аденоз.

Итак, пролиферативная активность опухолевых клеток у больных РПЖ повышается при сочетанном протекании в перитуморальной зоне диспластических процессов и разрастании стромальных компонентов в предстательной железе, что может сказаться в последующем на сроках рецидивирования злокачественного образования.

Обсуждение

В работе проведено гистоморфологическое исследование патологических процессов, протекающих в перифокальной зоне одновременно с аденокарциномой предстательной железы. Выяснилось, что в участках, не пораженных опухолью, чаще встречались признаки ХП (72,4%), ПИН-2 (37,4%) и их сочетания (27,6%). В работах других авторов при гистологическом исследовании операционных биоптатов предстательной железы у пациентов с верифицированным РПЖ указывалось на сочетание аденокарциномы и ПИН в 40–73% [4, 5], РПЖ и ХП — в 86,2% [14]. Безусловно, факт выявления одновременно протекающей патологии не являлся основной целью. Главное, необходимо знать последствия такой ассоциации для течения основного заболевания. Научные работы в этом направлении отсутствуют, рассматривается лишь последовательная связь между фоновыми патологическими процессами в железе и РПЖ в проспективном отношении [15]. Так, в предстательной железе хроническое воспаление ассоциировано с фиброзом стромы, на фоне которого развивается пролиферативная воспалительная атрофия — предшественник ПИН и РПЖ [16].

В настоящее время в литературе встречаются доказательства того, что очаги пролиферативной воспалительной атрофии обладают более высокой пролиферативной активностью, повышенной экспрессией маркера пролиферации Ki-67 по сравнению с эпителием, окружающим опухоль, и нормальным эпителием [17]. Поэтому считается, что такая атрофия — вариант регенерации, а сами очаги могут называться «регенераторными». По уровню пролиферации они сопоставимы с фенотипом ПИН [18].

В нашей работе при оценке экспрессии Ki-67 установлено, что наличие ПИН-2, а также ПИН-2 с ХП в перитуморальной зоне сочетается с повышением пролиферативной активности клеток аденокарциномы. Склерозирующий аденоз относится к нетипичному варианту ДГПЖ. Частота этой патологии при резецировании предстательной железы по поводу ДГПЖ составляет 2% [18]. В нашем исследовании склерозирующий аденоз встречался в 4,3% случаев (11 из 257), а среди всех случаев ДГПЖ — в 17% (11 из 65). Сочетание склерозирующего аденоза и РПЖ сопровождалось тенденцией к повышению пролиферативной активности клеток аденокарциномы по сравнению с контрольной группой, хотя тенденция не достигла статистической значимости (p=0,087). Малое число случаев одновременно присутствующих РПЖ и склерозирующего аденоза в перитуморальной зоне требует накопления информации в этом направлении для дополнительного изучения связи между признаками.

Заключение

У больных раком предстательной железы целесообразно проводить гистологическое исследование как операционных опухолевых биоптатов, так и перифокальных зон, поскольку выявленная зависимость гистологических изменений перитуморальной зоны и пролиферативной активности опухолевых клеток служит предиктором прогрессии онкологического заболевания.

Финансирование исследования. Исследование не финансировалось никакими источниками.

Конфликт интересов. У авторов нет конфликта интересов.