Возможности интерференционной микроскопии в изучении прижизненного состояния эритроцитов при воздействии на них низкоинтенсивным лазером для коррекции стресса

А.В. Дерюгина, М.Н. Иващенко, П.С. Игнатьев, М.Н. Таламанова, А.Г. Самоделкин

Ключевые слова: лазерная интерференционная микроскопия; прижизненное состояние эритроцитов; низкоинтенсивное лазерное излучение; стресс.

Цель исследования — изучение корригирующего действия низкоинтенсивного лазерного излучения на прижизненное морфофункциональное состояние эритроцитов при стрессе с помощью интерференционной микроскопии.

Материалы и методы. Исследовали образцы крови интактных и стрессированных крыс при действии низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ) в экспериментах in vitro. Длина волны излучения НИЛИ — 890 нм. Изучали морфологию эритроцитов методом лазерной интерференционной микроскопии, концентрацию малонового диальдегида и аденозинтрифосфата спектрофотометрически.

Результаты. Установлено, что действие НИЛИ не вызывает значимых изменений дискоидальной формы эритроцитов и метаболических процессов в клетках, но характеризуется появлением выростов на поверхности. Стрессовое воздействие определило уменьшение количества дискоцитов при значительном увеличении эхиноцитов, стоматоцитов и дегенеративно-измененных форм с изменением микрорельефа поверхности, сочетающееся с увеличением окислительных процессов. Воздействие НИЛИ на образцы крови стрессированных животных привело к уменьшению патологических форм эритроцитов с восстановлением поверхностной архитектоники клеток.

Введение

Эритроцит — универсальная модель для изучения процессов, происходящих на клеточной мембране под действием самых различных агентов. Детальное исследование изменений морфофункциональных показателей эритроцитов под влиянием различных раздражителей позволяет полнее установить возможные последствия и определить наиболее эффективные пути их коррекции.

Особого внимания заслуживают исследования влияния стресса на эритроциты, поскольку стрессовые воздействия являются неотъемлемой частью современной жизни людей и минимизация их приобретает особую актуальность [1]. Большую роль в решении данной проблемы играет поиск фармакологических и физических средств и методов, повышающих адаптационный резерв клеток. Арсенал фармпрепаратов в настоящее время состоит из большого числа различных средств, применение которых позволяет снизить реакцию центральной нервной системы на поступающие раздражители, предотвратить значительный выброс катехоламинов и развитие гиперметаболического состояния [2]. Однако фармакотерапия часто сопровождается возникновением различной степени выраженности побочных эффектов, что диктует необходимость поиска немедикаментозных методов. Перспективным с этой точки зрения является использование низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ), зарекомендовавшего себя как эффективный и доступный способ лечения различных патологий [3]. Однако вопрос о возможных механизмах биологического действия лазерного излучения на клетки организма при стрессе остается открытым [4].

Анализ современных тенденций развития науки в области визуализации биообъектов показывает, что на первый план выходят новейшие технологии, которые обладают высокой точностью, чувствительностью, оперативностью и информативностью, позволяют объективизировать получаемую научную информацию, выявлять и оценивать новые аспекты влияния различных факторов на морфофункциональные показатели изучаемых цитообъектов.

Достаточно перспективной в этом отношении является лазерная интерференционная микроскопия, основанная на комплексном оптико-геометрическом подходе к прижизненному анализу морфофункциональных характеристик форменных элементов периферической крови. Важная особенность данной технологии — то, что регистрируемая величина оптической разности хода лучей в интерферометре позволяет получать количественную информацию об объемном распределении показателя преломления биологического объекта и его морфологии [5].

Все вышеизложенное определило направление выбранного исследования и методические подходы к реализации поставленных научных задач.

Материалы и методы

Объектом исследования явилась цельная кровь крыс, которым моделировали стресс внутрибрюшинным введением раствора адреналина гидрохлорида (0,1 мг/кг), — опытная группа и кровь интактных животных — контрольная группа. Каждая группа включала по 10 особей.

При работе с животными руководствовались Приказом №199н «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики» (Россия, 2016) и «Международными рекомендациями (этический кодекс) по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (CIOMS и ICLAS, 2012), при этом неукоснительно соблюдались этические принципы, установленные Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (Страсбург, 2006). На проведение экспериментальных исследований на животных получено разрешение Этического комитета Нижегородской государственной сельскохозяйственной академии.

Кровь исследуемых групп подвергали облучению в течение 15 мин в чашках Петри диаметром 3 см. На расстоянии 1 см от поверхности мембран находился источник лазерного излучения, в качестве которого применяли лазерный терапевтический аппарат «Успех» («Восход», Россия), представляющий собой малогабаритную автономную матрицу из 10 лазерных диодов. Длина волны излучения — 890 нм. Частота повторения импульсов — 415 Гц. Суммарная импульсная мощность излучения — 30 Вт, минимальное значение плотности средней мощности излучения в плоскости выходного окна аппликатора — 193 мкВт/см². Площадь выходного отверстия — 20 см². Контролем служила необлученная кровь тех же особей.

Во всех группах изучали морфологию эритроцитов, концентрацию малонового диальдегида (МДА) и аденозинтрифосфата (АТФ) в них. Исследование проводили через час после облучения. Перед измерением необлученную и облученную кровь 3 раза центрифугировали с физиологическим раствором при 3000 об./мин по 10 мин.

В каждой серии проведено исследование 10 проб.

Изучение комплексной фазометрии эритроцитов выполнено методом лазерной модуляционной интерференционной микроскопии на микроскопе МИМ-340 (Уральский оптико-механический завод им. Э.С. Яламова, Россия). В работе использовали лазер с длиной волны 650 нм и объектив с увеличением 30 (NA=0.65), разрешение по поверхности — до 15 нм, разрешение по вертикали — 0,1 нм, возможность контроля изделий с глубиной рельефа — до 600 нм. Для захвата изображений применяли CCD-видеокамеру VS-415U (НПК «Видеоскан», Россия) с разрешением 782x582 пикселей. Регистрация морфологии нативных клеток без предварительной фиксации позволяла визуализировать модификацию клеток в режиме реального времени, изучать их морфологию и динамику внутриклеточных процессов.

Концентрацию МДА исследовали по образованию окрашенного триметинового комплекса с максимумом поглощения при 532 нм [6]. Для расчета концентрации использовали коэффициент молярной экстинкции: E =1,56 ∙10^–5М^–1∙см^–1.

Измерение концентрации АТФ проводили неэнзиматическим методом в фильтрате гемолизированных эритроцитов [7]. В пробах определяли неорганический фосфор, регистрируя плотность окраски на фотометре КФК-3 (Загорский оптико-механический завод, Россия) при длине волны 660 нм. Концентрацию фосфора определяли по калибровочной кривой, используя стандартный раствор KH₂PO₄ [8].

Полученные результаты обрабатывали с помощью пакетов прикладных программ BIOSTAT и Microsoft Excel. Достоверность различий средних определяли по t-критерию Стьюдента.

Результаты и обсуждение

С помощью лазерной интерференционной микроскопии были визуализированы эритроциты двояковогнутой формы, стоматоциты, эхиноциты и дегенеративно-измененные эритроциты. У животных интактной группы 89% эритроцитов были представлены дискоцитами, 11% приходились на клетки эхиноцитарной, стоматоцитарной и дегенеративно-измененной формы. Использование НИЛИ у них не вызывало значимых изменений морфологии клеток (рис. 1).

Рис. 1. Морфология эритроцитов в исследуемых группах

* — статистически значимые различия с показателями интактной группы; ⁺ — с показателями группы; «стресс»; р<0,05

При стрессе отмечалась морфологическая неоднородность эритроцитарного пула: снижение количества дискоцитов, увеличение переходных (эхиноцитов, стоматоцитов) и дегенеративно-измененных форм (каплевидных, мишеневидных, сфероцитов и дегмацитов).

Воздействие НИЛИ на образцы крови стрессированных животных привело к увеличению количества дискоцитов за счет уменьшения эхиноцитов (в 2 раза относительно показателей группы «стресс»). При этом сохранялось высокое содержание морфологически измененных форм клеток.

Анализ морфометрических показателей, проводимый с помощью лазерной интерференционной микроскопии, позволил получить высококонтрастные изображения эритроцитов без обработки их фиксаторами. Кроме того, были построены 3D-модели эритроцитов с учетом неоднородности оптичеcкой плотноcти клеточныx cтpуктуp, которые дают возможность анализировать изменение показателя пpеломления клетки и cвидетельcтвуют об изменении внутpиклеточной концентpации и/или пеpеpаcпpеделении вещеcтв внутpи клетки [9].

Результаты экспериментов показали, что у эритроцитов интактной группы животных мембрана имела ровную поверхность, внутриклеточные структуры были равномерно распределены с равномерным распределением гемоглобина (рис. 2, а). После действия НИЛИ эритроциты характеризовались появлением большого количества выростов и выпуклостей (рис. 2, б). Следует подчеркнуть, что при схожести дискоидальной формы эритроцитов и их размеров как у интактных образцов, так и при действии НИЛИ использование лазерной интерференционной микроскопии позволило выявить заметные отличия фазовых изображений в данных группах.

Рис. 2. Фазово-интерференционный портрет эритроцита интактных животных:

а — без облучения; б — после действия НИЛИ на образцы крови

Фазовые портреты эритроцитов в группе стрессированных животных без облучения характеризовались появлением значительного количества эхиноцитов (рис. 3, а), изменялась архитектоника и количество отростков, увеличивалась сферичность клеток (рис. 3, б). Изменялся также геометрический размер клетки в сторону уменьшения (в большем количестве клеток) и увеличения объема клеток. Действие НИЛИ на образцы крови стрессированных животных приводило к уменьшению стомато-эхиноцитарной трансформации клеток с восстановлением дискоидальной формы (см. рис. 3, б). При этом дискоциты имели различную степень двояковогнутости с сохранением шипов. Изменялись кривизна и глубина центрального углубления: соотношение диаметра эритроцита и диаметра впадины значительно отличалось от контрольного значения: 16±4 и 20±2 ед. соответственно (р<0,05). При этом сохранялись необратимо измененные (предгемолитические) эритроциты в виде стоматоцитов и дегенеративно-измененных клеток.

Рис. 3. Фазово-интерференционные портреты эритроцитов в группе стрессированных животных:

а — до облучения; б — при действии НИЛИ на образцы крови

Важным преимуществом лазерной интерференционной микроскопии по сравнению c другими методами визуализации является способность c высокой точностью оценить перераспределение оптической плотности внутри клетки. По данным [10], этот метод позволяет представить интерференционные изображения цветовых каналов и результирующее цветное изображение (рис. 4).

Рис. 4. Кривые пропускания красного (R), зеленого (G) и синего (B) светофильтров матрицы

Анализ полученных результатов свидетельствует, что у интактных эритроцитов без облучения и при действии НИЛИ характеристики длин волн фазовых портретов находятся в области 500–600 нм, при стрессе и действии НИЛИ на фоне стресса у эритроцитов в фазовом портрете преобладает увеличение длины волны до 600–650 нм. Данная динамика может быть связана с несколькими процессами, происходящими в клетках. Так, характерные максимумы поглощения для оксигемоглобина (HbO₂) наблюдаются на длинах волн 541 и 576 нм, для других форм гемоглобина с Fе²⁺ они также находятся в области 500–600 нм. При окислении железа и увеличении количества метгемоглобина происходит смещение спектра к 630 нм [11]. Кроме того, увеличение длины волны может свидетельствовать об увеличении плотности упаковки гемоглобина. В частности, показано, что наиболее характерно для порфиринов проявление молекулярной агрегации, которая существенно меняет физико-химические свойства веществ [12]. Следует учитывать также, что изменение фазового портрета может быть связано с изменением внутpиклеточныx продуктов метаболизма в клетке [13]. Показано, что смещение спектра в сторону 650 нм наблюдается при увеличении H₂O₂ [13]. В наших экспериментах анализ окислительного метаболизма по концентрации МДА и энергетических процессов — по содержанию АТФ выявил, что при стрессе наблюдалось значительное увеличение окислительных процессов в клетке (в 3 раза по сравнению с интактными образцами) и снижение энергетических показателей (в 2 раза по сравнению с интактными клетками) (см. таблицу). При действии НИЛИ на фоне стресса метаболические процессы восстанавливались, но не достигали уровня интактных клеток.

Концентрация МДА и АТФ эритроцитов в исследуемых группах (М±m)

При стрессе усиление ПОЛ рассматривается как универсальный механизм повреждения клеток [14]. Нарастание прооксидантных процессов нарушает состояние липидного и белкового компонентов, что может отражаться на показателях жизнеспособности и морфологии клеток [15, 16]. Показано, что НИЛИ способно уменьшать процессы ПОЛ, оказывая упорядочивающее воздействие на жидкокристаллическую структуру липидного бислоя, которая накладывает ограничения на протекание этих процессов [17]. Анализ поверхности структуры эритроцитов методом лазерной интерференционной микроскопии позволил выявить увеличение шероховатостей поверхности мембраны при стрессе (рис. 5), что, по всей вероятности, объясняется усилением липопероксидации и нарушением белковой фазы, тогда как восстановление поверхностной архитектоники при действии НИЛИ соотносится со снижением окислительных процессов.

Рис. 5. Объемные изображения фрагментов мембраны эритроцита при стрессе (а) и при действии низкоинтенсивного лазерного излучения на фоне стресса (б), поле зрения — 800х800 нм

Заключение

Фазовая картина эритроцитов при действии на них низкоинтенсивного лазерного излучения на фоне стресса, полученная с использованием лазерной интерференционной микроскопии, свидетельствует об изменении морфологии эритроцитов, которое сопровождается перераспределением плотности клеток и их поверхностной архитектоникой, что может зависеть от метаболической активности эритроцитов.

Применение лазерной интерференционной микроскопии является хорошим аналогом классической микрофлюориметрии. Полученные изображения эритроцитов позволяют исследовать морфологию клеток и рельеф, сопряженный с их физиологическим метаболическим состоянием, что дает возможность анализировать физиологический статус клеток.

Финансирование исследования. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований в рамках научного проекта №18-016-00195.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов.

Литература

Судаков К.В. Эволюция концепции стресса. Вестник Российской академии медицинских наук 2008; 11: 59–66.
Мусихин Л.В., Шветский Ф.М., Хосровян А.М., Молотова Н.Л., Бугровская О.И., Смольников П.В., Ширяев В.С. Некоторые аспекты применения низкоинтенсивного лазерного излучения в анестезиологической практике. Вестник интенсивной терапии 2009; 3: 75–83.
Babaev A.V., Gogolev D.E., Reiner O.V., Korochkin I.M., Fandeev A.V., Pivovarov V.Y., Fedulaev Y.N., Drachan K.M. Effect of intravenous low-intensity laser irradiation of the blood on clinical and laboratory parameters of hepatocellular insufficiency. Bull Exp Biol Med 2012; 153(5): 754–757, https://doi.org/10.1007/s10517-012-1818-1.
Luo G.-Y., Sun L., Liu T.C.-Y. Aquaporin-1-mediated effects of low level He-Ne laser irradiation on human erythrocytes. International Journal of Photoenergy 2012; 2012: 1–5, https://doi.org/10.1155/2012/275209.
Игнатьев П.С. Лазерная интерференционная микроскопия морфологии и динамики биологических объектов в реальном времени. Автореф. дис. … канд. физ.-мат. наук. М; 2011.
Krylov V.N., Deriugina A.V., Pleskova S.N., Kalinin V.A. Apoptotic nature of erythrocyte hemolysis induced by low doses of ionizing radiation. Biophysics 2015; 60(1): 79–84, https://doi.org/10.1134/s0006350915010170.
Виноградова И.Л., Багрянцева С.Ю., Дервиз Г.В. Метод одновременного определения 2,3 ДФГ и АТФ в эритроцитах. Лабораторное дело 1980; 7: 424–426.
Boyarinov G.A., Yakovleva E.I., Zaitsev R.R., Bugrova M.L., Boyarinova L.V., Solov’eva O.D., Deryugina A.V., Shumilova A.V., Filippenko E.S. Pharmacological correction of microcirculation in rats suffering from traumatic brain injury. Cell and Tissue Biology 2017; 11(1): 65–72, https://doi.org/10.1134/s1990519x17010023.
Berestovskaya Y.Y., Gerasimenko L.M., Yusipovich A.I., Maksimov G.V., Rubin A.B., Levin G.G., Shutova V.V. New possibilities of studying microbial objects by laser interference microscopy. Biophysics 2011; 56(6): 1063–1068, https://doi.org/10.1134/s0006350911060224.
Дьяченко А.А., Рябухо В.П. Определение оптических толщин слоистых объектов по интерференционным цветам изображений в микроскопии белого света. Компьютерная оптика 2017; 41(5): 670–679, https://doi.org/10.18287/2412-6179-2017-41-5-670-679.
Эрстенюк А.М. Лигандные формы гемоглобина в динамике кадмиевой интоксикации. Микроэлементы в медицине 2012; 13(2): 8−13.
Würthner F., Kaiser T.E., Saha-Möller C.R. J-aggregates: from serendipitous discovery to supramolecular engineering of functional dye materials. Angew Chem Int Ed Engl 2011; 50(15): 3376–3410, https://doi.org/10.1002/anie.201002307.
Lobanov A.V., Nevrova O.V., Barzilovich P.Yu., Roubtsova N.A., Komissarov G.G. Interaction of metal porphyrins and hydrogen peroxide: coordination, photocatalysis and electron transfer. In: Islamova R.M., Kolesov S.V., Zaikov G.E. (editors). Kinetics, catalysis and 46 mechanism of chemical reactions. From pure to applied science. Vol. 2. Tomorrow and perspectives. New York: Nova Science Publishers; 2012; p. 305–311.
Миронов В.А., Филиппов А.В., Ширшиков Ф.В., Черепнёв Г.В., Калачёва Н.В. Влияние биназы на некроз и апоптоз макрофагов в модели окислительного стресса. Ученые записки Казанского университета. Серия: Естественные науки 2012; 154(2): 66–76.
Конторщикова К.Н., Ведунова М.В., Макарова Е.С., Орлов Б.Ю. Влияние доксорубицина, озона и кислорода на жизнеспособность нормальных и злокачественных клеток печени в культуре. Вестник физиотерапии и курортологии 2016; 22(2): 10–11.
Аlyasova А.V., Terentiev I.G., Tsybusov S.N., Vedunova М.V., Мishchenko Т.А., Shakhova K.А., Kontorshchikova K.N. Novel notions of the mechanisms of action of doxorubicin and ozone on malignant hepatic cells. Sovremennye tehnologii v medicine 2017; 9(2): 145, https://doi.org/10.17691/stm2017.9.2.18.
Срубилин Д.В., Еникеева Д.А., Исаков И.Д. Структурно-функциональные нарушения эритроцитов и их коррекция низкоинтенсивным лазерным излучением при субхронической интоксикации дихлоэтаном. Вестник новых медицинских технологий 2012; 19(4): 105–108.