Тест-система «Биочип-SER» для флюоресцентного иммуноцитохимического исследования экспрессии антигена Ep-CAM на материале выпотных жидкостей и смывов

Введение

Обнаружение раковых клеток в экссудатах на ранних этапах метастазирования опухоли является очень важной задачей, поскольку установление факта диссеминации опухолевого процесса до проявления клинических признаков заболевания позволяет выбрать оптимальную тактику лечения. Как известно, серозные полости покрыты слоем эпителиальных клеток мезенхимального происхождения (мезотелием). При различных патологических процессах (неоплазии, инфекционных и системных заболеваниях) мезотелий становится полиморфным и даже атипичным, что связано с его реактивной пролиферацией [1]. Вариабельность морфологии клеток реактивного мезотелия вызывает значительные затруднения при дифференциальной диагностике со злокачественной мезотелиомой и метастазами карцином, что требует привлечения дополнительных аналитических методов.

У здорового человека в плевральной полости содержится около 10 мл, в перикардиальной — приблизительно 1–2 мл и в брюшной — до 50 мл серозной жидкости [2]. Считается, что объем, превышающий указанное количество жидкости в полостях, свидетельствует о наличии патологического процесса и является достаточным основанием для диагностической пункции.

Злокачественные заболевания довольно часто сопровождаются выпотом в плевральную и брюшную полости. У мужчин по частоте обнаружения опухолевых клеток в экссудатах первое место занимает рак легкого (49%), затем лейкозы и злокачественные лимфомы (21%), карциномы органов пищеварения (7%) и мочеполовой системы (6%). У женщин плевральные и перитонеальные экссудаты встречаются в 2 раза чаще, особенно при прогрессировании рака молочной железы (37–50%) и яичников (20%), реже — при злокачественных лимфомах (8%) и карциномах органов пищеварения (4%) [3].

Цитологическое исследование — единственный метод диагностики злокачественной природы экссудата, однако достоверность его вариабельна и составляет от 60 до 96% [2, 4, 5].

При оценке морфологии серозных выпотов наличие в препаратах полиморфных клеток с выраженной атипией ядер и клеточных скоплений в виде характерных структур (ацинарных, микрососочковых, шаровидных и т.д.) позволяет установить диагноз злокачественной опухоли без затруднений. Однако разнообразный клеточный состав экссудата — наличие клеток пролиферирующего мезотелия, лимфоидных и гистиоцитарно-макрофагальных элементов, лейкоцитов, а также опухолевых клеток, морфологически сходных с клетками мезотелия, — может являться причиной неуверенных заключений о характере выпота.

Затруднения в дифференциальной диагностике реактивно измененного мезотелия, мезотелиомы и метастатического рака в большинстве случаев можно преодолеть, используя дополнительные методы: иммуноцитохимическое исследование, цитогенетический метод, проточную цитофлюориметрию, электронную микроскопию и др. [6–8].

При проведении иммуноцитохимии для разрешения спорных диагностических ситуаций чаще всего используются моноклональные антитела (МКАТ) к поверхностному эпителиальному антигену Ер-САМ (клон Ber-EP4). Ep-CAM — трансмембранный белок, состоящий из двух молекул гликопротеинов с молекулярной массой 34 и 39 кДа, локализуется на мембране и в цитоплазме нормальных эпителиальных клеток, клеток карциноидов и карцином различного генеза [9, 10]. Ep-CAM не экспрессируется в большинстве неэпителиальных опухолей, на мезотелиальных клетках, гепатоцитах и лимфоцитах. В сочетании с другими маркерами Ep-CAM может использоваться для подтверждения эпителиального происхождения опухоли в дифференциальной диагностике между аденокарциномой (АК) и мезотелиомой [11, 12].

Данные зарубежных коллег показывают высокую чувствительность, специфичность и положительную предсказательную ценность иммуноцитохимических исследований с использованием МКАТ к Ep-CAM в выявлении АК — 80, 94 [13] и 96% соответственно [14].

По данным отечественной литературы, применение Ep-CAM при исследовании материала выпотных жидкостей позволяет повысить чувствительность и специфичность цитологической диагностики АК до 96 и 99% соответственно [15].

Отмечены хорошие результаты использования Ep-CAM при дифференциальной диагностике АК и мезотелиомы: позитивная реакция отмечается в 100% аденогенных карцином легкого, в 100% плоскоклеточных раков, в 93% нелегочных карцином, в 67% уротелиальных карцином и в 84% АК без первично выявленного очага, метастазировавших в плевру. В то же время в клетках мезотелиомы Ep-CAM экспрессируется в 18–26% наблюдений [16, 17]. При этом следует отметить, что в мезотелиомах экспрессия Ep-CAM наблюдается фокусно, в части опухолевых клеток.

Одним из вариантов иммуноцитохимических исследований является флюоресцентная иммуноцитохимия (ФИЦХ), которая позволяет проводить интраоперационные исследования экссудатов, поскольку не требует больших временных затрат и обладает доказанной эффективностью. Так, в работе японских коллег [18] были сопоставлены результаты разных вариантов иммуноцитохимических исследований: стандартной (СИЦХ), стандартной и срочной интраоперационной ФИЦХ с использованием жидкостных технологий — на 64 образцах (35 смывов с органов брюшной полости и 29 асцитических выпотов), полученных от пациентов с различной неопухолевой патологией и злокачественными процессами. При СИЦХ и ФИЦХ из использованных в работе маркеров (Ber-EP4, CEA, EMA и MOC-31) клоны Ber-EP4 и MOC-31 показали наибольшую значимость в оценке характера выпота, поскольку демонстрировали выраженную экспрессию в клетках АК и полное ее отсутствие в клетках реактивного мезотелия: в 92% случаев АК (12 из 13) клетки были Ber-EP4/MOC-31-позитивны.

По нашим собственным данным, применение СИЦХ и ФИЦХ с Ep-CAM (Ber-EP4) повышает чувствительность и специфичность цитологического метода при исследовании выпотов и смывов до 100% [5].

С учетом высокой чувствительности и специфичности МКАТ к Ep-CAM (клон Ber-Ep4) этот маркер был выбран для идентификации клеток АК при СИЦХ и ФИЦХ.

С целью усовершенствования цитологического и иммуноцитохимических методов была разработана тест-система «Биочип-SER». Эта система является высокотехнологичным изделием медицинского назначения для проведения ФИЦХ [19]. Она состоит из двух основных частей: рабочей и функциональной (рис. 1). Рабочая часть представляет собой прозрачную подложку из стекла размерами 25,4×76,2 мм, толщиной 1 мм. Подложка с положительно заряженным покрытием разделена на 15 равных ячеек посредством решетки из пластика. В каждой ячейке содержится МКАТ к Ep-CAM (клон Ber-EP4), конъюгированному с флюорохромом Alexa Flour 488, который возбуждается светом с длиной волны 468–509 нм и излучает свет с длиной волны 504–541 нм. Для сохранения антител во влажной среде в каждую ячейку добавлен реагент PBS (фосфатный буфер) в количестве 0,1 мкл, сверху на рабочую поверхность нанесена гидрофобная пленка, препятствующая их высыханию. В зависимости от плотности клеток опухоли в материале исследователь имеет возможность индивидуально подходить к выбору необходимого количества ячеек для изучения одного образца. При обнаружении единичных клеток опухоли или немногочисленных их скоплений могут быть задействованы все 15 ячеек биочипа.

Рис. 1. Внешний вид тест-системы «Биочип-SER»

Часть тест-системы не имеет специфического покрытия и предназначена для маркировки изделия (QR-код) и фиксации в руках исследователя.

Цель исследования — оценить возможности тест-системы «Биочип-SER» для анализа экспрессии антигена Ep-CAM методом флюоресцентной иммуноцитохимии.

Материалы и методы

Проведено 64 цитологических, 64 СИЦХ- и 64 ФИЦХ-исследования на тест-системе «Биочип-SER» 59 пациентам с опухолевой и неопухолевой патологией. В исследование включены 8 мужчин (возраст 33–67 лет) и 51 женщина (возраст 29–88 лет). Работа выполнена в соответствии с Хельсинкской декларацией (2013) и одобрена Этическим комитетом Национального медицинского исследовательского центра онкологии им. Н.Н. Блохина. От каждого пациента получено информированное согласие. Изучены клеточные осадки 45 выпотов (26 асцитов, 17 плевритов, 2 перикардиальных выпота) и 19 смывов с органов брюшной полости. У двух пациенток дважды проводился забор материала, у троих были исследованы плевральный и перитонеальный выпоты (табл. 1). Из 59 больных 57 человек (96,6%) имели онкологический анамнез (серозный папиллярный рак яичников, пограничная опухоль яичника, АК эндометрия, рак молочной железы, рак толстой кишки, рак желудка, АК легкого, мезотелиома, мелкоклеточный рак легкого), у 2 пациентов (3,4%) опухолевой патологии не выявлено (1 наблюдение — эхинококкоз печени и 1 — эндометриоз маточной трубы). Среди пациентов с опухолевой патологией у 7 (12,3%) были диагностированы первично-множественные злокачественные новообразования. Только у 42 из 59 пациентов гистологически было верифицировано наличие/отсутствие распространения опухолевого процесса по брюшине/плевре, у двух пациенток с неопухолевой патологией (эндометриоз, эхинококкоз) диагнозы также подтвердились.

Таблица 1. Клинико-морфологическая характеристика исследованного материала

Хотя наибольшей чувствительностью Ep-CAM обла­дает именно в отношении клеток АК, интерес для исследования представляла также экспрессия антигена в клетках опухолей другого генеза и клетках реактивного мезотелия.

В нашей работе весь исследованный материал был оценен как информативный, поскольку для проведения СИЦХ и ФИЦХ отбирался осадок с высокой клеточностью.

Работу проводили в четыре этапа: 1-й этап — цитологическое исследование; 2-й этап — СИЦХ; 3-й этап — ФИЦХ на тест-системе «Биочип-SER»; 4-й этап — контрольное цитологическое исследование на системе «Биочип-SER».

Для цитологического, СИЦХ- и ФИЦХ-иссле­до­ва­ний использовали концентрированную клеточную взвесь, полученную путем центрифугирования осадка отстоявшейся биологической жидкости. Осадок помещали в центрифужные пробирки объемом 10 мл и центрифугировали в режиме 2000 об./мин в течение 10 мин на центрифуге ОПН-3М (ELMI Ltd., Латвия). Надосадочную жидкость сливали, оставляя до 1 мл клеточной взвеси. Содержимое пробирки ресуспензировали или встряхивали на вортексе для получения однородной клеточной взвеси, которую затем распределяли (в объеме 50–80 мкл в зависимости от клеточной плотности) по кюветам цитоцентрифуги Cytospin-3 (Thermo Scientific Shandon, Великобритания) и центрифугировали в режиме 1500 об./мин в течение 10 мин.

Готовили серию монослойных препаратов: для цитологического исследования 2 мазка окрашивали по методу Романовского в модификации Лейшмана, на двух проводили СИЦХ-исследование с МКАТ к эпителиальному антигену Ep-CAM, клон Ber-EP4 (Dako, США). Наличие мембранного окрашивания клеток опухоли свидетельствовало о положительной экспрессии Ep-CAM.

В нескольких случаях (n=9) для подтверждения диагноза и дифференциальной диагностики были также проведены СИЦХ-исследования с МКАТ к антигену WT-1, клон 6F-H2, титр 0,7:100 (Cell Marque Corp., США); калретинину, клон Calret, титр 1:100 (Dako, США); мезотелину, клон NCL-L-MESO, титр 1:40 (Novocastra Laboratоries, Великобритания); мезотелиальному антигену HBME-1, клон HBME-1, титр 1:40 (Cell Marque Corp., США); десмину, клон D33, титр 1:100 (Cell Marque Corp., США); TTF-1, клон G7G3/1, титр 0,7:100 (Cell Marque Corp., США); CK7, клон OV-TL12/30, титр 0,7:100 (Cell Marque Corp., США); синаптофизину, клон MRQ-40, титр 0,7:100 (Cell Marque Corp., США); Epithelial-Related Antigen, клон MOC-31, титр 1:60 (Dako, США). Все СИЦХ были проведены на иммуногистостейнере BenchMark ULTRA (Ventana, США).

Для выполнения ФИЦХ на изделии «Биочип-SER» в оставшуюся клеточную взвесь добавляли 10% раствор реополиглюкина (в соотношении 1:9) с целью уменьшения фонового окрашивания и нивелирования эффекта автофлюоресценции, повторно центрифугировали в течение 10 мин. Надосадочную жидкость удаляли до остаточного объема 0,6–0,8 мл. Клеточную взвесь после снятия защитной пленки на биочипе распределяли в объеме 30 мкл в каждую ячейку. При внесении исследуемого материала в ячей­ки происходит прямая иммуноцитохимическая реакция «антиген–антитело», определяемая с помощью эффекта флюоресценции. Для более равномерного распределения материала и ускорения реакции «антиген–антитело» содержимое ячеек тщательно перемешивали, биочип инкубировали в течение 30 мин в гибридайзере (возможно применение термостата либо термошейкера). Затем оценивали полученные реакции с помощью флюоресцентного микроскопа Axio Imager Z2 (Carl Zeiss, Германия), используя фильтры FITC, DAPI.

Анализ экспрессии антигена Ep-CAM проводили в каждой из ячеек тест-системы по следующим параметрам:

наличие либо отсутствие специфического мембранного свечения в клетках опухолей;

количество прореагировавших клеток;

интенсивность флюоресценции.

Впоследствии (4-й этап) биочип окрашивали традиционным способом (по Лейшману) и проводили контрольное цитологическое исследование. Во всех цитологических препаратах оценивали разнообразие клеточного состава, плотность клеток опухоли в материале, сохранность характерных морфологических признаков опухоли и ее архитектоники. Микроскопию выполняли на световом микроскопе Eclipse Ci (Nikon, Япония) при увеличении 100, 200, 400 и 1000.

Результаты и обсуждение

Результаты цитологического исследования (1-й этап). Все полученные заключения были распределены на три группы.

1. Уверенное заключение о наличии клеток опухоли (n=51). Материал отличался высокой клеточностью. В соответствии с нозологией отмечались характерные морфологические особенности опухолевых клеток и их скоплений.

2. Подозрение на наличие клеток опухоли (n=7). Причинами неуверенных цитологических заключений служили следующие факты:

наличие единичных клеток, морфологически сходных с опухолевыми (n=2);

«пестрый» клеточный состав с наличием выраженной лимфоцитарно-гистиоцитарной реакции (n=2);

клетки реактивно пролиферирующего мезотелия, подозрительные на мезотелиому (n=2), либо скопления опухолевых клеток, которые трудно дифференцировать между АК и мезотелиомой (n=1).

3. Уверенное заключение об отсутствии клеток опухоли (n=6).

Во всех наблюдениях данной группы цитограммы были представлены бесструктурными скоплениями и пластами клеток мезотелия.

Результаты СИЦХ-исследования (2-й этап). Применение СИЦХ позволило подтвердить цитологический диагноз в 56 наблюдениях, уточнить в 6 и избежать гипердиагностики — в двух случаях (см. табл. 1).

Для оценки чувствительности и специфичности цитологического метода в выявлении АК из 64 наблюдений соответственно исключили те случаи, где были уверенно или предположительно диагностированы мезотелиома (n=4), опухоли с пограничной степенью злокачественности (n=2) и мелкоклеточный рак (n=1). Проведение СИЦХ-исследования с МКАТ к Ep-CAM (n=57) позволило подтвердить цитологическое заключение «аденокарцинома» в 46 случаях, а также перевести в категорию уверенных заключений 2 наблюдения с подозрением на АК (табл. 2).

Таблица 2. Экспрессия Ep-CAM при стандартном иммуноцитохимическом исследовании

Поскольку ложноотрицательных цитологических заключений отмечено не было, чувствительность цитологической диагностики составила 100%. Группу ложноположительных цитологических заключений в итоге составили 2 наблюдения с подозрением на АК, не подтвердившуюся при СИЦХ, а также один случай с уверенным заключением о метастазе аденогенного рака. Таким образом, специфичность цитологического метода составила всего 67%. Однако стоит отметить, что данные показатели можно рассматривать лишь в качестве условного ориентира ввиду малой выборки пациентов.

При пограничной опухоли яичников (n=2) положительная экспрессия Ep-CAM отмечена в обоих случаях. Во всех наблюдениях с утвердительным и предположительными заключениями о мезотелиоме (n=4), а также при диссеминации мелкоклеточного рака легкого по плевре реакция с Ep-CAM была отрицательной. Диагноз эпителиоидно-клеточной мезотелиомы был подтвержден СИЦХ-реакциями с позитивной экспрессией калретинина, мезотелина, WT-1, HBME и негативной экспрессией МОС-31, десмина. Мелкоклеточный рак при СИЦХ характеризовался позитивной экспрессией TTF-1 и синаптофизина (ранее гистогенез опухоли был подтвержден иммуногистохимически).

Результаты ФИЦХ-исследования на тест-системе «Биочип-SER» (3-й этап). ФИЦХ, проведенная на системе «Биочип-SER», также показала 100% диагностическую чувствительность: во всех случаях АК, подтвержденных СИЦХ, выявлена положительная экспрессия антигена Ep-CAM, конъюгированного с Alexa Flour 488. Специфичность теста составила 89%, лишь в одном наблюдении результаты СИЦХ и ФИЦХ не совпали (положительная реакция была отмечена только на биочипе), причем в дальнейшем гистологически была подтверждена диссеминация опухолевого процесса, что говорит об истинности результата ФИЦХ.

Необходимо отметить ряд нюансов, с которыми сталкивается исследователь при работе с тест-системой «Биочип-SER». Так, под воздействием лучевого или химиотерапевтического лечения в клетках опухоли проявляются признаки дистрофии и дегенерации, в связи с чем мембранная экспрессия Ep-CAM может наблюдаться в виде флюоресцентного свечения разной интенсивности (от слабой до умеренной), иногда прерывистого. Эта особенность может затруднять обнаружение опухолевых клеток.

Результаты контрольного цитологического исследования на тест-системе «Биочип-SER». Отмечалась сохранность характерных морфологических признаков клеток опухоли и архитектоники скоплений. Распределение клеточных элементов в ячейках оказалось не совсем равномерным — наибольшее количество материала скапливалось в углах ячеек. Это хорошо иллюстрируют приведенные примеры результатов исследований (рис. 2, 3).

Рис. 2. Больная И., 50 лет, клинический диагноз: «рак желудка, асцит»: а — цитологическое исследование: метастаз перстне­видно­клеточного рака, х200; б — СИЦХ: положительная экспрессия Ep-CAM, x200; в — ФИЦХ на тест-системе «Биочип-SER»: положительная экспрессия Ep-CAM, x200; г — контрольное цитологическое исследование на биочипе: метастаз перстне­вид­ноклеточного рака, х200

Рис. 3. Больная К., 59 лет, клинический диагноз: «рак яичников, асцит»: а — цитологическое исследование: метастаз серозной папил­ляр­ной цистаденокарциномы яичника, х200; б — СИЦХ: положительная экспрессия Ep-CAM, x200; в — ФИЦХ на тест-системе «Биочип-SER»: положительная экс­прессия Ep-CAM, x200; г — контрольное цитологическое исследование: метастаз серозной папиллярной цистаденокарциномы яичника, х200

Таким образом, проведенное исследование показывает высокую сопоставимость результатов ФИЦХ- и СИЦХ-исследований экспрессии Ep-CAM. При этом использование тест-системы «Биочип-SER» дает ФИЦХ-исследованию дополнительные преимущества:

а) экономия времени — исследование занимает около 60 мин с учетом пробоподготовки против 180 мин при СИЦХ;

б) возможность выполнения контрольного исследования: после ФИЦХ препарат окрашивается традиционным способом;

в) используемые флюорохромы имеют длительный срок флюоресценции;

г) низкая себестоимость, экономия реагентов и расходных материалов;

д) не требуется применения системы визуализации и канцерогенного хромогена — диаминобензидина;

е) использование телемедицины — возможность проведения в условиях поликлиники преаналитического этапа обученным средним медицинским персоналом с дальнейшей передачей данных сканированных изображений в специализированный референсный центр.

Заключение

Рациональное использование современных дополнительных методов исследования позволяет расширить возможности и повысить качество дифференциальной диагностики метастатических аденокарцином, мезотелиом и реактивно измененного мезотелия в выпотах и смывах с серозных полостей, что снижает частоту гипо- и гипердиагностики опухолевого процесса.

Предлагаемая тест-система «Биочип-SER» с МКАТ к Ep-CAM, конъюгированному с Alexa Fluor 488, обладает рядом преимуществ в сравнении с принятым в мировой практике вариантом ФИЦХ-исследования, который является современным надежным методом диагностики опухолевого процесса в выпотных жидкостях. Это позволяет рекомендовать «Биочип-SER» для широкого применения как в специализированных учреждениях, так и на этапе первичного звена.

Финансирование исследования. Работа выполнена при поддержке ООО НПП «Биочип».

Конфликт интересов. ООО НПП «Биочип» не влияло на ход исследования и его результаты.