Модель ишемизированной длительно незаживающей кожной раны: клеточная гибель и механизмы ранозаживления

Введение

Длительно незаживающая рана является распространенной гетерогенной патологией, зависит от этиологии, возраста раны и других факторов, влияющих на раневое заживление [1]. К факторам, благодаря которым рана приобретает статус длительно незаживаю­щей, относятся плохое кровоснабжение, стабильно повышающееся артериальное давление, системные заболевания, возраст больного и повторившаяся травма [2]. Такие раны трудно поддаются консервативной терапии [3]. Отсутствие единого терапевтического подхода к их лечению является результатом недостаточного исследования механизмов регенерации в таких ранах [2, 4].

На данный момент не существует описания единой стандартизированной модели длительно незаживающей раны на лабораторном животном, адекватной человеческой ране, а модель in vitro не воспроизводит сложной структуры раневого ложа, в том числе ишемического [5]. Одним из известных способов моделирования патогенеза, характерного для длительно незаживающей раны, является нанесение полнослойного дефекта на ишемизированный кожный лоскут. Данный способ прост в исполнении, стандартизируем и позволяет смоделировать рану, адекватную патологии у человека. Вследствие этого целью работы явилось создание такого ишемизированного кожного лоскута на животных, на котором можно достоверно показать наличие признаков ишемии, при этом развитие некроза не будет стремительным и не приведет к полной гибели лоскута в течение нескольких суток [6]. Эта модель позволит изучать различные патологические процессы, протекающие в коже в условиях ишемии, в частности клеточную гибель, а также создать такую кожную рану, которую можно считать длительно незаживающей, т.е. процессы регенерации в ней будут протекать достоверно медленнее, чем в острой резаной ране такого же размера.

Известно, что в патогенезе длительно незаживающей раны большую роль играют процессы некроза и апоптоза [1, 6–8]. Коагуляционный некроз является одним из основных гистологических признаков ишемии в коже [9, 10] и, несмотря на все успехи современной медицины, остается одной из основных проблем в хирургии [6]. Апоптоз также является важным первичным механизмом клеточной гибели при повреждении (ишемия/реперфузия), его каскады индуцируются активными формами кислорода. В частности, установлена возможность влияния на факторы ASK-1 и NF-κB в качестве мишени при терапевтическом воздействии на процесс апоптоза, что приводит к выживаемости клеток кожного лоскута [11].

Изучение процессов клеточной гибели может стать основой для новых подходов в области регенеративной медицины, в частности при поиске мишени для воздействия на процессы регенерации в длительно незаживающих ишемизированных кожных ранах.

Цель исследования — разработать модель ишемизированного кожного лоскута у лабораторных мышей с описанием процессов некроза и апоптоза в динамике и показать особенности регенерации длительно незаживающей кожной раны в условиях сформированного лоскута.

Материалы и методы

Эксперименты проводили на 20 мышах линии BALB/c — самцах массой 18–20 г. Все манипуляции с животными выполняли под общим наркозом в соответствии с «Правилами для проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Россия, 2010) и «Международными рекомендациями (этический кодекс) по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (CIOMS и ICLAS, 2012), при этом неукоснительно соблюдались этические принципы, установленные Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (Страсбург, 2006). Работа одобрена Этическим комитетом Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.

Для удаления шерсти в области операционного поля использовали крем для депиляции Veet (Франция).

Ишемизированный кожный лоскут моделировали следующим образом: мышам наносили полнослойные параллельные разрезы кожи, симметричные позвоночнику, длиной 30 мм, на расстоянии 10 мм друг от друга, причем необходимым условием являлось отсечение от полученного лоскута всех крупных сосудов. Таким образом получали частично изолированный лоскут кожи с нарушением кровоснабжения, на края которого в дальнейшем накладывали хирургические швы (рис. 1, а).

---

Рис. 1. Схематичное изображение разрезов и циркулярной раны на спине мыши: а — в группе «ишемизированный лоскут»; б — в группе «длительно незаживающая рана; в — в группе «острая рана»

---

Полнослойную циркулярную рану диаметром 5–7 мм наносили по центру ишемизированного лоскута (рис. 1, б).

Острую рану без ишемии моделировали путем нанесения полнослойного циркулярного отверстия диаметром 5–7 мм на спине интактного животного в той же позиции, которая соответствовала середине ишемизированного лоскута (рис. 1, в).

В эксперименте по моделированию ишемизированного лоскута забор биоматериала у животных осуществляли на 1, 2, 3 и 5-е сутки, а в эксперименте по изучению раневого заживления – на 14-е сутки после оперативного вмешательства.

Изучение патологических процессов, протекающих в ишемизированном лоскуте и в области кожной раны, выполняли на гистологических препаратах. Некропсию фрагментов ишемизированного лоскута проводили из его центра, область раны извлекали целиком, после чего фиксировали биоматериал в 10% формалине (Biovitrum, Россия).

Гистологические препараты тощиной 6 мкм получали на микротоме Microm HM 430 (Thermo Scientific, Германия) и окрашивали их гематоксилином и эозином. Анализ и фотографирование препаратов выполняли при помощи микроскопа BZ-9000 (Keyence, Япония).

Криосрезы толщиной 10 мкм подготавливали по стандартной методике на криостате SM1900 (Leica Microsystems, Германия).

Апоптотические ядра выявляли путем детекции двунитевых разрывов ДНК методом TUNEL (Biotium, США).

Визуализацию сосудов проводили путем иммуно­флюоресцентного окрашивания антителами к маркеру CD31 (ab28364).

Препараты анализировали на флюоресцентном микроскопе BZ-9000.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программ ImageJ и Origin. Количество нормальных и кровенаполненных сосудов в ишемизированном лоскуте подсчитывали в десяти полях зрения для каждого животного. Измерения толщины дермы и подсчет количества слоев эпителия в ишемизированном лоскуте выполняли в двух позициях — по центру лоскута и в краевой зоне на двух срезах образцов кожи. Поля зрения и срезы для морфометрического анализа выбирали случайно.

Результаты и обсуждение

На первом этапе работы была разработана модель Н-образного ишемизированного кожного лоскута на мышах лини BALB/c. Всех животных разделили на две группы: экспериментальная с лоскутом — «ишемизированный лоскут» и контрольная — животные того же пола и возраста без оперативного вмешательства, но депиляцию им проводили так же, как и животным из экспериментальной группы.

На втором этапе выполняли сравнительный анализ раневого процесса острой и ишемизированной раны (группы «острая рана» и «длительно незаживающая рана» соответственно).

За состоянием животных из группы «ишемизированный лоскут» проводили визуальный контроль в течение 5 сут после операции. Выявлено изменение цвета ишемизированного лоскута, появление бурых постепенно увеличивающихся очагов некроза уже на 1-е сутки после операции.

Все дальнейшие исследования осуществляли на гистологических препаратах.

Через сутки после формирования ишемизированного лоскута наблюдали признаки ишемии, в частности микротромбы в просвете сосудов дермы (рис. 2, а, б).

---

Рис. 2. Участок ишемизированного кожного лоскута мыши на 1-е сутки после формирования: а — кровенаполненный сосуд в продольном сечении: кровенаполненный сосуд (1), микротромбы в сосуде (2); парафиновый срез; окраска гематоксилином и эозином; х40; б — кровенаполненный сосуд в поперечном сечении: кровенаполненный сосуд (1), микротромбы в сосуде (2); парафиновый срез; окраска гематоксилином и эозином; х40; в — патологические изменения в дерме и эпидермисе: отек, микротромбы в сосудах, гибель клеток эпидермиса; микротромбы в сосудах (2), гибель клеток эпидермиса (3); парафиновые срезы; окраска гематоксилином и эозином; х20

---

Также были заметны деградация клеток эпидермиса и дермы, отек (рис. 2, в), кровенаполненность и экстравазация сосудов (см. рис. 2, а, б), участки инфильтрации воспалительными клетками.

В некоторых зонах лоскута были отмечены патологические изменения и лизис клеточных ядер, что говорит о начальных стадиях коагуляционного некроза.

На 2-е сутки после формирования лоскута наблюдали участки гиперпролиферации эпителия (рис. 3, а), а коагуляционный некроз и миграция воспалительных клеток приобрели более выраженный характер (рис. 3, в).

---

Рис. 3. Участок кожного лоскута мыши при ишемии и в норме: а — гиперпролиферация клеток эпидермиса на 2-е сутки после формирования ишемизированного лоскута, стрелкой указан участок гиперпролиферации кератиноцитов; парафиновый срез, окраска гематоксилином и эозином; х20; б — гиперпролиферация клеток эпидермиса на 5-е сутки после формирования ишемизированного лоскута; стрелкой указан участок гиперпролиферации кератиноцитов; парафиновый срез; окраска гематоксилином и эозином; х20; в — коагуляционный некроз на 2-е сутки после формирования ишемизированного лоскута; стрелками указаны участки коагуляционного некроза; парафиновый срез; окраска гематоксилином и эозином; х40; г — коагуляционный некроз на 5-е сутки после формирования ишемизированного лоскута, стрелками указаны участки коагуляционного некроза; парафиновый срез, окраска гема­-­то­ксилином и эозином; х20; д — участок кожного лоскута мыши из группы «контроль»; парафиновый срез; окраска гема­то­ксилином и эозином; х20

---

К 3-м суткам выраженность коагуляционного некроза была максимальной. Отмечено уменьшение количества слоев эпителия ишемизированного лоскута с 1-х по 3-и и увеличение — на 5-е сутки по сравнению с конт­ролем (см. рис. 3, а, б, рис. 4, а, б). На 5-е сутки состояние кожного лоскута на гистологических препаратах было близко к нормальной коже, однако у некоторых животных наблюдали участки экстравазации сосудов, инфильтрации воспалительных клеток (рис. 5), гиперпролиферации эпителия, отека (см. рис. 3, б, рис. 4, в, г) и некроза (рис. 3, г).

---

Рис. 4. Морфометический анализ ишемизированного кожного лоскута на разных сроках после его формирования: количество слоев эпителия на краевом участке (а) и в центре (б); толщина дермы на краевом участке (в) и в центре (г)

---

Рис. 5. Участок кожного лоскута мыши на 5-е сутки после формирования ишемизированного лоскута: а — инфильтрация воспалительных клеток; парафиновый срез; окраска гематоксилином и эозином; х40; б — патологические изменения в кожном лоскуте: экстравазация сосудов (1), инфильтрация воспалительных клеток (2); парафиновый срез; окраска гематоксилином и эозином; х20

---

Морфометрический анализ показал тенденцию к увеличению толщины кожного лоскута мышей как в его центре, так и по краям к 5-м суткам, что может быть связано с отечностью дермы (см. рис. 4, в, г). Увеличение количества слоев эпителия на 5-е сутки после операции связано с гиперпролиферацией клеток, что характерно для заживления ран в норме (см.рис. 3, б, рис. 4, а, б). Однако с учетом длительности данного процесса можно сделать вывод о патологическом характере регенерации.

На гистологических срезах кожи животных из группы «контроль» признаков деградации не обнаружено (рис. 3, д).

Доля кровенаполненных сосудов на гистологических срезах кожи животных экспериментальной группы, как вероятное следствие ишемии, значительно отличалась от контроля, причем в 1-е сутки после операции их было значительно больше, чем в последующие (рис. 6, а). Среднее количество сосудов в поле зрения у животных экспериментальных и контрольной групп не отличалось (рис. 6, б).

---

Рис. 6. Количество кровенаполненных сосудов в ишемизированном кожном лоскуте: а — доля от общего количества в поле зрения; б — среднее количество сосудов в поле зрения в ишемизированном кожном лоскуте; в — участок кожного лоскута мыши на 5-е сутки после операции; иммунофлюоресцентное выявление маркера эпителия сосудов CD31 (зеленое окрашивание), ядра окрашены DAPI (синий цвет); х40

---

При исследовании на наличие апоптотических ядер в ишемизированном лоскуте выявлено, что клетки в состоянии апоптоза в эпидермисе и дерме у животных присутствуют на 1, 2, 3 и 5-е сутки существования лоскута. В некоторых участках наблюдали скопления таких клеток вокруг волосяных фолликулов. На микропрепаратах кожи мышей из группы «контроль» апоптотических клеток не обнаружено.

К патоморфологическим признакам ишемии в кожном лоскуте относят коагуляционный некроз, инфильтрацию воспалительных клеток, микротромбы в сосудах и их кровенаполненность [9–11]. Все эти патологические изменения мы наблюдали на гистологических срезах образцов кожи мышей из группы «ишемизированный лоскут», что свидетельствует о развитии ишемии в течение 1-х суток после проведения операции. Далее в течение кратких сроков в связи с достаточно быстрыми темпами регенерации у грызунов может происходить частичное восстановление лоскута за счет прорастания сосудов со стороны мышечной фасции. Однако значительность всех патоморфологических изменений в течение 1-х суток после формирования лоскута дает нам основания предполагать, что протекание раневых процессов в резаной ране, нанесенной на кожу ишемизированного лоскута, в том числе скорость регенерации, будет значительно отличаться от таковых в острой кожной ране у мышей.

На втором этапе проводили сравнительный анализ процессов регенерации в модели острой и ишемизированной раны. Наблюдение за состоянием ран мы осуществляли до 14-х суток после начала эксперимента, что можно считать отдаленными сроками существования данного дефекта для животных этого вида. При визуальном осмотре мышей из группы «острая рана» наблюдали нормальный процесс раневого заживления, проявляющийся в сокращении площади раны и ее эпителизации к 14-м суткам после операции (рис. 7, а). У животных из группы «длительно незаживающая рана» раны к этому сроку были покрыты крупным струпом (рис. 7, б).

---

Рис. 7. Состояние раны мыши на 14-е сутки после хирургического вмешательства:а — из группы «острая рана»; б — из группы «длительно незаживающая рана»

---

Гистологическое исследование препаратов ран мышей из группы «острая рана» показало полное закрытие раны нормальным многослойным плоским ороговевающим эпителием, а также наличие в дерме сформировавшегося зрелого рубца, характеризующегося хорошо организованными коллагеновыми фибриллами и невысоким содержанием клеток и кровеносных сосудов в зоне раневого ложа у мышей (рис. 8, а). На некоторых препаратах отмечено наличие волосяных фолликулов в дерме, что свидетельствует о полном восстановлении структуры кожи (рис. 8, б, в).

---

Рис. 8. Рана мыши из группы «острая рана» на 14-е сутки после хирургического вмешательства: а, б — середина раны; в — край раны; 1 — нормальная эпителизация; 2 — зрелый рубец; 3 — волосяные фолликулы в дерме; парафиновый срез; окраска гематоксилином и эозином; х20

---

У животных из группы «длительно незаживающая рана» в центре раны наблюдали обилие фибробластов в раневом ложе и отсутствие элементов межклеточного матрикса. Эпителий также отсутствовал (рис. 9, а). По краям раны наблюдали эпителизацию и формирование рубца (рис. 9, б).

---

Рис. 9. Рана мыши из группы «длительно незаживающая рана» на 14-е сутки после хирургического вмешательства:а — середина раны; б — край раны; стрелкой показано скопление фибробластов; парафиновый срез; окраска гематоксилином и эозином; х20

---

Таким образом, раны у мышей из групп «длительно незаживающая рана» и «острая рана» находились на разных стадиях раневого заживления: II стадия — фаза реорганизации, образования и созревания грануляционной ткани и III стадия — фаза реорганизации рубца и эпителизации [12]. Если считать нормой для организма мыши полную регенерацию раны диаметром 5–7 мм на 14-е сутки, то раны мышей из группы «длительно незаживающая рана» на основании отсутствия эпителизации в качестве критерия заживления раны следует охарактеризовать как длительно незаживающие [13].

Заключение

Предлагаемый способ нанесения ишемизированного лоскута заключается в полном отсечении от него всех крупных сосудов, что приближает разработанную модель к человеческой патологии. Сформированный лоскут имеет все гистологические маркеры ишемии, такие как некроз, микротромбы в сосудах, кровенаполненность сосудов и инфильтрация воспалительных клеток. Данные патологические изменения сохраняются до 5-х суток эксперимента, но при этом не происходит полного отмирания лоскута, что позволяет проводить наблюдения за раной на протяжении длительного времени. Такой способ получения ишемизированного лоскута легко воспроизводим, прост в исполнении. По совокупности признаков разработанную модель можно считать оптимальной моделью ишемизированного кожного лоскута.

Обнаружено, что к 14-м суткам после нанесения раны у мышей из групп «длительно незаживающая рана» и «острая рана» наблюдались разные стадии раневого заживления: длительно незаживающая рана характеризовалась отсутствием эпителизации и зрелого рубца, тогда как острая рана была полностью эпителизирована. Данная разница в сроках раневого заживления у мышей расценивается как существенная, следовательно, полученная длительно незаживающая рана может быть предложена в качестве модели для изучения механизмов ранозаживления длительно незаживающих ран и разработки способов возможного влияния на них.

Кроме того, в модели ишемизированного лоскута наблюдали клеточную гибель путем некроза и апоптоза. Коагуляционный некроз был максимально выражен на 3-и сутки, и его признаки сохранялись вплоть до 5-х суток после операции. Апоптотические клетки были выявлены на всех сроках эксперимента. Данные процессы могут стать важной мишенью для терапии биомедицинскими препаратами.

Финансирование исследования. Работа выполнена в рамках ПНИЭР по теме «Разработка технологии производства, хранения и применения биомедицинских клеточных продуктов для лечения ран» в соответствии с Соглашением о предоставлении субсидии с Минобрнауки России №14.610.21.0012. Уникальный идентификатор работ RFMEFI61017X0012.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.