Лекарственный патоморфоз глиобластомы 101.8 у крыс линии Wistar при лечении наноразмерной формой доксорубицина на основе полилактидных наночастиц

Введение

Глиобластома — быстрорастущая низкодифференцированная опухоль головного мозга, плохо поддающаяся лечению. Продолжительность жизни больных с глиобластомой после установления диагноза редко превышает 12 мес [1]. Основной метод лечения — хирургическое удаление опухоли с последующей радио­лучевой терапией, в то время как химиотерапии отводится в основном лишь вспомогательная роль [2]. Одной из причин низкой эффективности химиотерапии при опухолях ЦНС является гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), ограничивающий доступ большинства лекарственных веществ в мозг. В центральных зонах опухоли функции ГЭБ нарушаются, поскольку новообразованные сосуды, несовершенные в анатомическом, функциональном и гистологическом отношении, отличаются повышенной проницаемостью. Однако в зонах инфильтративного роста опухоли ГЭБ сохраняет функциональность, препятствуя созданию в этих зонах терапевтически эффективных концентраций лекарственных веществ [3]. Данный факт обусловливает актуальность поиска путей повышения эффективности химиотерапии опухолей мозга и, в частности, глиобластом.

Одним из перспективных направлений в этой области является применение систем доставки лекарственных веществ. Наночастицы на основе биополимеров способны доставить противоопухолевые вещества, которые без этих наночастиц лишь ограниченно проникают через ГЭБ. В опухоли наночастицы накапливаются и постепенно выделяют инкапсулированное лекарственное вещество, поддерживая его терапевтически эффективную концентрацию [3, 4].

В онкотерапии широко применяется антрациклиновый антибиотик доксорубицин (ДОКС). Его молекулы встраиваются в ДНК и повреждают ее, вызывают остановку пролиферации или гибель опухолевых клеток. Цитотоксическое действие доксорубицина обусловлено генерацией свободных форм кислорода и способностью ингибировать рост кровеносных сосудов в опухоли [5, 6]. Считается, однако, что, будучи субстратом Р-гликопротеина, доксорубицин не проникает через ГЭБ и потому не может использоваться для химиотерапии опухолей мозга. В то же время показано, что лечение глиобластомы 101.8 наноразмерными формами доксорубицина на основе полибутилцианоакрилатных (PBCA) и полилактидных (PLGA) наночастиц увеличивает выживаемость, продолжительность жизни животных, приводит к уменьшению объема опухоли и торможению ее роста [7–9].

Противоопухолевый эффект ДОКС-наночастиц усиливается, если поверхность наночастиц модифицирована полоксамером 188 (плюроник F68, Р188 и др.) [8]. Полоксамеры — полимерные соединения, блок-сополимеры полиоксиэтилена (гидрофобная часть мо­лекулы) и полиоксипропилена (гидрофильная часть молекулы), их разное сродство к воде придает полоксамерам в водном растворе свойства поверхностно-активных веществ. Они используются как транспортные системы для доставки лекарственных веществ к пораженным органам и тканям [10]. Полоксамер 188 увеличивает растворимость и всасываемость различных гидрофобных соединений, обладает тромболитическим действием, улучшает реологию крови, встраивается в клеточные мембраны, способствуя устранению их дефектов, активирует фагоцитоз [11]. После введения наночастиц PLGA в кровь полоксамер 188, адсорбированный на их поверхности, способствует адсорбции аполипопротеинов Е и А, которые взаимодействуют с рецепторами LDL, экспрессированными на мембранах эндотелиальных клеток, образующих ГЭБ, и таким образом опосредуют эндоцитоз наночастиц в эти клетки. Наночастицы затем проникают в мозг посредством трансцитоза [10].

Для оценки противоопухолевой эффективности химио- и радиотерапии используют «золотой стандарт» — морфологическое исследование, которое в сочетании с морфометрическим и молекулярно-биологическим методами позволяет прогнозировать рецидивирование и выживаемость у онкологических больных [12].

С целью определения эффективности лечения с использованием различных форм доксорубицина — его субстанции или наноразмерной формы на основе полилактидных частиц — у крыс линии Wistar выполнена сравнительная оценка лекарственного патоморфоза глиобластомы 101.8 после противоопухолевой терапии.

Материалы и методы

Наночастицы получали из субстанции ДОКС (Sicor S.p.A, Италия) и сополимера молочной и гликолевой кислот PLGA (Resomer RG 502H; Evonik Röhm, Германия) методом двойных эмульсий при соотношении ДОКС:PLGA как 1:10 [4]. После удаления органических растворителей полученную наносус­пензию лиофилизировали с добавлением криопротектора (1% маннита). Средний диаметр полученных частиц, определенный методом фотонной корреляционной спектроскопии (Zetasizer Nano ZS; Malvern, Великобритания), составлял ~100 нм, степень включения доксорубицина ~90%. Перед введением животным лиофилизированные наночастицы ресуспендировали в воде (ДОКС-PLGA) или в 1% водном растворе полоксамера 188 (ДОКС-PLGA/Р188).

Исследование выполнено на 33 самцах крыс линии Wistar массой тела 150–200 г. При работе с животными руководствовались Приказом №199н «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики» (Россия, 2016) и «Международными рекомендациями (этический кодекс) по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (CIOMS и ICLAS, 2012), а также «Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств» (Миронов А.Н. и др., 2012). При этом неукоснительно соблюдались этические принципы, установленные Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (Страсбург, 2006). Исследование было одобрено биоэтической комиссией НИИ морфологии человека.

Глиобластома 101.8 крысы была впервые получена и поддерживается в коллекции НИИ морфологии человека [13]. Ткань опухоли трансплантировали в головной мозг крыс под наркозом (Золетил 100 в дозе 6 мг/100 г массы тела животного). Методика трансплантации опухоли детально описана в предыдущей работе [7].

Животные с имплантированными опухолями были разделены на 4 группы в зависимости от получаемых препаратов: субстанции доксорубицина (ДОКС; n=6); наноразмерной формы доксорубицина на основе наночастиц PLGA, модифицированных полоксамером 188 (ДОКС-PLGA/Р188; n=9) или немодифицированных (ДОКС-PLGA; n=11). В качестве контроля использовали нелеченых животных (n=7). Препараты вводили внутривенно на 2, 5 и 8-е сутки после трансплантации опухоли в дозе 1,5 мг/кг.

С целью гистологического исследования глиобластомы 101.8 животных выводили из эксперимента на 14-е сутки после имплантации опухоли (6-е сутки после лечения). Головной мозг фиксировали в 10% забуференном растворе формалина, изготавливали гистологические срезы и окрашивали их гематоксилином и эозином.

Для оценки пролиферативного потенциала, гибели клеток и вычисления коэффициента клеточного обновления глиобластомы 101.8 подсчитывали количество митозов и гибнущих клеток на стандартной площади гистологического среза (65 025 мкм²; х400). В каждом наблюдении в зависимости от размера опухоли подсчет проводили в 5–10 полях зрения. Коэффициент клеточного обновления (ККО) опухоли вычисляли по формуле: ККО = число митозов / число гибнущих клеток.

Кровеносные сосуды в глиобластоме 101.8 выявляли с помощью гистохимической реакции с изолектином В4 (Vector Lab, США), при которой маркируются эндотелиальные клетки. Оценивали количество сосудов в поле зрения при увеличении 200. Методом точечного счета с помощью сетки Г.Г. Автандилова [14] определяли объемную долю кровеносных сосудов.

Статистическая обработка данных проведена с применением пакета программ Statistica 6.1, использован непараметрический метод. Характеристикой экспериментальных групп служила медиана (Me) и квартильный размах (25; 75%). Для сравнения экспериментальных групп был применен однофакторный дисперсионный анализ ANOVA, для множественного сравнения — метод Данна и метод Коновера.

Результаты

При морфологическом исследовании глиобластомы 101.8 у крыс разных экспериментальных групп все опухоли характеризовались высокой клеточностью, выраженной атипией опухолевых клеток с гиперхромией ядер, полиморфизмом по форме и размерам. Среди опухолевых клеток было много митотически делящихся (рис. 1, а, б). Встречались патологические митозы: концентрические митозы, полая метафаза, асимметричные митозы, колхициновые митозы. Отмечалось много гибнущих клеток с гомогенным базофильным ядром или фрагментацией ядер, гомогенной эозинофильной цитоплазмой, клеток-теней с плохо определяемыми контурами, слабобазофильными ядрами и вакуолизированной цитоплазмой (рис. 1, в, г). Наблюдался инфильтративный периваскулярный и перинейрональный рост опухоли в окружающую ткань головного мозга: опухолевые клетки в пограничной зоне образовывали скопления вокруг сосудов и гибнущих нейронов. Вокруг нейронов они нередко формировали железистоподобные структуры.

---

Рис. 1. Морфологическая характеристика глиобластомы 101.8: группа без лечения: а — фигуры митоза; б — многополюсный митоз; гибнущие клетки: в — группа ДОКС; г — группа ДОКС-PLGA/P188; картина «звездного неба»; окраска гематоксилином и эозином; увеличение: а — 400; в — 640; б, г — 1000

---

Во всех опухолях выявлялось большое количество кровеносных сосудов, которые формировали скопления в виде сосудистых «розеток» (рис. 2). Сосуды были с деформированными просветами, округлой или овальной формы и тонкой стенкой, представленной эндотелием и небольшим количеством тонких волокон, также определялись сосуды щелевидной формы с пролиферацией эндотелия и с частично сформированной стенкой (рис. 3).

---

Рис. 2. Морфологическая характеристика кровеносных сосудов в глиобластоме 101.8: а — ДОКС P188; кровеносные сосуды с тонкими стенками; б — ДОКС-PLGA; сосудистая розетка — скопление сгруппированных кровеносных сосудов овальной формы с тонкими стенками; окраска гематоксилином и эозином; увеличение: а — 400, б — 640

---

В опухолях часто выявлялись мелкие и обширные кровоизлияния — от единичных до множественных. Во многих опухолях, особенно с относительно большими размерами, определялись очаговые некрозы, среди них встречались некрозы с палисадообразным расположением опухолевых клеток. В перитуморальной зоне выявлялись сетчатый, периваскулярный и перицеллюлярный отек, гибель нейронов, которые были гиперхромными по типу гипоксических нейронов, а также с явлением цитолиза.

---

Рис. 3. Гистохимическая реакция с изо­лектином В4 — маркером эндотелиальных клеток: а — группа без лечения, сосуды с широкими деформированными про­светами и тонкими стенками; б, в, г — сосуды с частично сформированными стенками и щелевидным просветом: б — ДОКС; в — ДОКС-PLGA; г — ДОКС-PLGA/P188; увеличение: а, г — 100; б, в — 200

---

Выявленные морфологические особенности экспериментальной глиобластомы 101.8 соответствуют основным характеристикам глиобластомы человека (высокая атипия опухолевых клеток, наличие большого количества кровеносных сосудов, некрозов и кровоизлияний), что позволяет предполагать одинаковые реакции на лечение.

По сравнению с крысами, не получавшими лечения, у животных экспериментальных групп, леченных ДОКС, ДОКС-PLGA и ДОКС-PLGA/Р188, выявлены признаки лекарственного патоморфоза: размеры опухолей были значительно меньше; у большинства животных некрозы отсутствовали; у половины крыс обнаружены клетки-«монстры» — от единичных в препарате и поле зрения до 5–7 клеток в поле зрения (рис. 4). Кровеносные сосуды были в основном щелевидными с частично сформированными тонкими стенками и деформированными просветами. Следует отметить, что в пределах каждой из исследованных групп животных выраженность лекарственного патоморфоза варьировала.

---

Рис. 4. Морфологическая характеристика клеток глиобластомы 101.8: а — ДОКС-PLGA/P188; б — ДОКС-PLGA; опухоли с высокой клеточностью из полиморфных атипичных клеток с гиперхромными ядрами и узким ободком цитоплазмы; среди атипичных клеток — многоядерные клетки-«монстры»; окраска гематоксилином и эозином; увеличение: а — 640; б — 400

---

По сравнению с нелечеными во всех группах животных, получавших лечение, число гибнущих клеток в опухоли было увеличено, а показатели митозов — снижены. Минимальное количество митозов отмечалось у крыс с глио­бластомой после лечения ДОКС-PLGA/Р188 (табл. 1).

---

Таблица 1. Количество митотически делящихся, гибнущих клеток опухоли и коэффициент клеточного обновления у крыс с глиобластомой, % (Me [25; 75])

---

По сравнению с нелечеными животными в опухолях после лечения практически во всех группах крыс было снижено абсолютное количество кровеносных сосудов. В группе ДОКС-PLGA/Р188 этот показатель был самым низким, в группе ДОКС-PLGA он не отличался от группы без лечения.

При морфометрическом исследовании глиобластомы 101.8 показатель медианы объемной доли сосудов уменьшался во всех группах леченых животных. В группах ДОКС и ДОКС-PLGA/Р188 этот показатель был низким (табл. 2).

---

Таблица 2. Объемная доля и количество кровеносных сосудов в глиобластоме 101.8 у крыс при введении разных форм доксорубицина, % (Ме [25; 75])

---

Таким образом, по сравнению со всеми экспериментальными группами количество и объемная доля кровеносных сосудов в опухоли были статистически значимо ниже в группе животных, получавших ДОКС-PLGA/Р188.

Обсуждение

Выявленные морфологические изменения в глио­бластоме 101.8 при воздействии химиопрепарата ДОКС и его наносомальной формы следует расценивать как проявления лекарственного патоморфоза. Проблема лекарственного патоморфоза детально охарактеризована Е.Ф. Лушниковым [15]: патоморфоз — это как общие, так и местные проявления опухолевого роста под влиянием какого-либо воздействия. В современном понимании патоморфоз (от греч. pathos — болезнь и morphosis — формирование) — стойкое изменение клинической и морфологической картины болезни под влиянием факторов окружающей среды. Вопрос о морфологических критериях лекарственного («индуцированного», «лечебного», «терапевтического») патоморфоза опухолей продолжает оставаться дискуссионным и во многом зависит от природы опухоли, вида воздействия, механизма действия, режима введения препаратов и т.п. Наиболее значимыми параметрами патоморфоза являются: активность и характер роста опухоли, наличие и выраженность атипии клеток, соотношение объемных долей стромы и паренхимы, полиморфизм либо единообразие формы и размера клеток, ядерно-цитоплазматическое соотношение, наличие и количество митозов, гибнущих клеток, дистрофические изменения в опухолевых клетках. При этом важно учитывать характер ангиогенеза, оцениваемый по микрососудистой плотности, суммарному периметру сосудов и суммарной их площади, наличию очагов некроза и геморрагий и т.д. [16–20].

Стандарт оценки лекарственного патоморфоза злокачественных опухолей головного мозга человека до сих пор не разработан. Основой для оценки морфологических изменений при лечении экспериментальной глиобластомы 101.8 является классификация C. Daumas-Duport [21], которая используется для прогнозирования течения глиобластомы у человека. Классификация основана на четырех морфологических признаках: атипия ядер, митотическая активность, пролиферация эндотелиальных клеток, некрозы (0 — отсутствие признака или его сомнительное проявление; 1 — наличие). Прогностическая значимость митотического индекса и индекса гибели клеток при лечении опухоли подтверждена на достаточно большом числе злокачественных опухолей разных локализаций [18, 22].

При изучении гистологических препаратов глиобластомы 101.8 во всех опытных группах у большинства животных, получавших лечение, были выявлены описанные признаки лекарственного патоморфоза: уменьшение объемов опухолей, более редкое развитие некрозов. Во многих опухолях у леченых животных определялись клетки-«монстры», что расценивается как один из признаков регрессии опухоли после химиотерапии [23].

Патоморфоз глиобластомы 101.8 под действием всех исследованных препаратов включал также интенсификацию процессов гибели опухолевых клеток. Глиобластомы животных группы ДОКС-PLGA/Р188 характеризовались увеличенным процентом гибели опухолевых клеток по сравнению с группой крыс, леченных ДОКС.

Все лекарственные формы доксорубицина снижали пролиферативную активность опухолевых клеток и увеличивали их гибель. В связи с этим коэффициент клеточного обновления у леченых животных был ниже, чем у нелеченых.

Глиобластома 101.8 характеризуется высокой васкуляризацией, а ее снижение служит одним из показателей оценки эффективности лечения опухоли [15]. Абсолютное число кровеносных сосудов опухоли и их объемная доля снижались во всех группах животных, подвергавшихся лечению. Однако наилучший результат отмечен для группы животных, получавших ДОКС-PLGA/P188.

Полученные данные коррелируют с ранее описанными результатами исследования противоопухолевой активности наноразмерных форм доксорубицина в отношении глиобластомы 101.8. Так, в работах T. Hekmatara и соавт. [5], А.С. Халанского и соавт. [24], S.C. Steiniger и соавт. [9] показано, что лекарственный патоморфоз экспериментальной глиобластомы 101.8 у крыс линии Wistar при лечении наносомальной формой доксорубицина на основе наночастиц PBCA характеризуется уменьшением размеров опухоли и степени ее васкуляризации, распространенности некрозов, снижением пролиферативного индекса [25], а также уменьшением объемной плотности сосудов и некрозов в опухоли. Высокая эффективность лечения глиобластомы 101.8 наноразмерной формой доксорубицина на основе наночастиц PLGA была показана также S. Wohlfart и соавт. [26], которые использовали полуколичественную оценку степени выраженности некрозов и «сосудистых розеток».

Заключение

Все лекарственные формы доксорубицина снижают пролиферативную активность опухолевых клеток и увеличивают их гибель, тем самым уменьшая коэффициент клеточного обновления у леченых животных. Наиболее эффективными лекарственными формами, снижающими пролиферативную активность и увеличивающими гибель опухолевых клеток, являются ДОКС-PLGA и ДОКС-PLGA/P188. При введении разных лекарственных форм доксорубицина по сравнению с группой нелеченых животных объемная доля кровеносных сосудов в опухоли снижается только в группах крыс, леченных ДОКС и ДОКС-PLGA/P188.

На основе оценки патоморфоза глиобластомы 101.8 по принятым морфологическим признакам максимальная противоопухолевая активность принадлежит препарату ДОКС-PLGA/Р188. Полученные результаты экспериментального исследования позволяют рассматривать ДОКС в PLGA-наночастицах, ресуспендированных в 1% водном растворе полоксамера Р188, как наиболее эффективное противоопухолевое средство.

Финансирование исследования. Исследование выполнено при финансовой поддержке федеральной целевой программы «Развитие фармакологической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу» (государственный контракт №13411.1008799.13.144).

Конфликт интересов. Конфликты интересов, связанные с данным исследованием, отсутствуют.