Оценка влияния механического растяжения правого предсердия на работу изолированного сердца крысы методом мультиэлектродного картирования

Введение

Реакция сердца на механические раздражения осуществляется под контролем вегетативной нервной системы организма. Электрические сигналы от механорецепторов предсердий, желудочков и сосудов по нервным волокнам в составе блуждающего нерва передаются в продолговатый мозг, отвечающий за ритмогенез сердца. Например, при растяжении устья полых вен и правого предсердия (ПП) срабатывает адаптационный физиологический механизм, направленный на увеличение частоты сердечных сокращений (ЧСС). Он способствует выведению избыточного объема крови из сердца — рефлекс Бейнбриджа, который устраняется при денервации сердца [1]. Ответная реакция сердца на механическое воздействие может осуществляться под контролем собственной внутрисердечной нервной системы. В 70-х годах ХХ в. в опытах Г.И. Косицкого на изолированных сердцах теплокровных животных показано, что возбуждение механочувствительных рецепторов при растяжении предсердий приводит к изменению силы сокращений в желудочках [2].

Оптимизация сердечной деятельности в условиях механической нагрузки может также осуществляться на уровне мышечных волокон миокарда по закону Франка–Старлинга [3, 4]. Установлено, что кроме электромеханического сопряжения, за счет которого электрический сигнал вызывает сокращение мышечных волокон, в сердце существует обратная механоэлектрическая связь. В результате этой обратной связи механические воздействия на миокард приводят к изменению в нем электрических процессов [5]. Механическое воздействие может регулировать метаболизм миокарда за счет влияния на состояние механочувствительных каналов клеток [6, 7], белков цитоскелета и внеклеточного матрикса [8, 9].

Влияние механических воздействий на работу сердца подтверждается наблюдениями из медицинской практики — описаны случаи внезапной смерти от удара в грудную клетку в области сердца или возникновения аритмий при коронарной катетеризации [10, 11]. Механическая чувствительность в сердце активно исследуется на разных организационных уровнях — от клетки до целого органа [12–16], а также в разных отделах сердца — предсердиях и желудочках [17–19]. Тем не менее до сих пор механизмы, лежащие в основе отклика сердца на механические вмешательства, остаются не до конца ясными. Исследование их природы может открыть большие возможности для лечения и профилактики сердечных заболеваний и послужить основой для разработки новых способов искусственной регуляции работы сердца.

Благодаря развитию экспериментальных технологий в настоящее время стало возможным более детальное изучение свойств миокарда непосредственно во время его активной работы. Например, c помощью мульти­электродной техники измерения электрических потенциалов, которая на сегодняшний день в той или иной модификации успешно применяется для разных целей в научных лабораториях и лечебных учреждениях по всему миру [20–22], можно оценивать влияние растяжения ПП на скорость проведения возбуждения в желудочках.

Цель исследования — оценить влияние растяжения правого предсердия на скорость распространения возбуждения в левом желудочке методом мультиэлектродного картирования гибкими матрицами для регистрации сигналов, что позволит понять интракардиальные механизмы регуляции изолированного сердца: электрические волновые процессы в сердце, частоту и вариабельность сердечного ритма в норме и при патологии.

Материалы и методы

Перфузия по методу Лангендорфа. Экспери­мен­тальные работы выполнялись в соответствии с законодательством РФ (приказы №1179 МЗ СССР от 11.10.1983 и №267 МЗ РФ от 19.06.2003), международными правилами «Guide for The Care and Use of Laboratory Animals» (National Research Council, 2011), отвечали требованиям Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (Страсбург, 2006).

Белым аутбредным крысам массой 200–250 г внутрибрюшинно вводили гепарин (500 МЕ) и наркоз (Золетил 100, 35 мг/кг). Торакотомически извлеченные сердца подвергали гравитационной ретроградной перфузии по методу Лангендорфа. Для перфузии был использован раствор Кребса–Хензелейта (в ммоль/л): NaCl — 118; KCl — 4,7; CaCl₂ — 2; MgSO₄ — 1,2; KH₂PO₄ — 1,2; NaHCO₃ — 20; глюкоза — 10; pH=7,3–7,4; при температуре 37°С под давлением 80 мм вод. ст. и при насыщении газовой смесью из 95% О₂ и 5% СО₂ (рис. 1, а). Механическое растяжение ПП осуществляли путем заполнения его камеры имплантатом из высокомолекулярного полиэтилена (рис. 1, б).

Рис. 1. Перфузия изолированного сердца крысы методом Лангендорфа: а — схема перфузионной установки: АЦП — аналого-цифровой преобразователь; ПК — персональный компьютер; б — сердце крысы с помещенным в правое предсердие (ПП) имплантатом синего цвета; А — аорта, закрепленная на канюле с помощью зажима; ЛЖ — левый желудочек; ПЖ — правый желудочек

Метод регистрации электрической активности сердца. Электрическую активность сердца регистрировали с использованием системы гибких мультиэлектродных матриц (MEAFlex72; Multi Channel Systems MCS GmbH, Германия). Корпус матрицы (рис. 2, а) выполнен из гибкого полиимида и объединяет 72 электрода: 64 регистрирующих, 4 рефрактерных и 4 заземляющих, собранных в структурированную матрицу в области контактной площадки (рис. 2, б). Электрические сигналы с поверхности левого желудочка (ЛЖ) (рис. 2, в) по электродам в составе матрицы поступали в систему из усилителей, фильтров и аналого-цифрового преобразователя (Multi Channel Systems MCS GmbH, Германия) с целью регистрации с возможностью визуализации и сохранения цифровых файлов для дальнейшей обработки (рис. 2, г).

Рис. 2. Мультиэлектродная регистрация электрической активности сердца: а — гибкая мультиэлектродная матрица; б — матрица электродов на регистрирующей пластинке: синим цветом обозначены регистрирующие электроды, желтым — референтные (R), голубым — заземляющие (G); в — гибкая матрица, расположенная на поверхности левого желудочка (ЛЖ) на границе с правым желудочком (ПЖ) ниже ушка (У) изолированного сердца крысы; г — визуализация регистрируемых электрограмм

Протокол эксперимента. Исследование включало два этапа: 1-й — при сокращении сердца в нормальных условиях; 2-й — при механическом растяжении ПП. Полученные параметры работы сердца за первые 5 мин 2-го этапа сравнивали с последней минутой 1-го этапа. Результаты исследований в экспериментальной группе (механическое растяжение ПП) сравнивали с контролем (перфузия в нормальных условиях). В опытной и контрольной группах проведено по 10 экспериментов.

Анализ параметров работы сердца. Ис­поль­зо­вание электродной техники позволяет анализировать ритм работы сердца для оценки таких характеристик, как ЧСС, вариабельность интервалов R–R, которую отражает коэффициент вариабельности CV, определяемый как CV (%) = 100 СКО/М, где СКО — среднее квадратическое отклонение и М — среднее значение интервалов R–R [23].

Поскольку в данном эксперименте не использовалась электрокардиография, то понятия «R-зубец» и «интервал R–R» применяются условно. Положения R-зубцов соответствуют моментам поступления сигнала на электроды матрицы. Эти положения определяли на основе полуинтерактивного анализа снятых временных зависимостей напряжения. Основу анализа составлял пороговый фильтр с параметрами, устанавливаемыми в ручном режиме для конкретного экспериментального сердца и электрода матрицы. Этот фильтр применялся к временной производной потенциала на одном из электродов матрицы и в получившейся зависимости определялись моменты наступления максимумов или минимумов, которые условно помечались как R-зубцы. Временные промежутки между соседними R-зубцами, определенными таким образом, принимались за интервалы R–R, последовательность которых затем использовалась для анализа ЧСС и вариабельности сердечного ритма.

Большое количество регистрирующих электродов в составе матрицы дает возможность проанализировать скорость распространения волны возбуждения в миокарде ЛЖ с помощью программного приложения Cardio2D (Multi Channel Systems MCS GmbH, Германия). Архитектоника миокарда не позволяет регистрировать широкий фронт волны возбуждения на поверхности сердца [24]. Поэтому представление о скорости распространения возбуждения в миокарде дает значение временной задержки возбуждения между электродами в выборочной группе (минимум из 9 электродов).

Cтатистический анализ данных. Статисти­чес­кую обработку результатов исследования проводили методами вариационной статистики с использованием приложения Microsoft Office Excel 2003 в операционной системе Microsoft Windows 7 с соблюдением общих рекомендаций для медицинских и биологических исследований.

Проверку соответствия распределения эмпирических данных нормальному распределению осуществляли с использованием теста Шапиро–Уилка. Данные, подчиняющиеся нормальному закону распределения, представляли в виде среднего значения М и стандартной ошибки среднего m. Если по результатам теста выборки не соответствовали нормальному закону распределения, то данные представляли в виде диаграмм диапазонов, включающих центральные тенденции (медиана Me), 25-й и 75-й процентили, минимальное и максимальное значения.

Результаты

Вариабельность ритма сердечных сокращений. Ответная реакция сердца на механическое растяжение полости ПП выражалась в увеличении ЧСС и вариабельности ритма сердечных сокращений. На электрограммах (рис. 3) отражено увеличение вариабельности интервалов R–R с 1-й минуты после механического растяжения ПП, которое проявляется у разных сердец с различной интенсивностью и продолжительностью.

Рис. 3. Электрограммы пяти изолированных сердец: а — до механического растяжения правого предсердия; б–д — после механического растяжения правого предсердия для четырех различных изолированных сердец

Графики на рис. 4 показывают, что, в отличие от контрольных экспериментов, при нормальных условиях перфузии ЧСС (рис. 4, а) после механического растяжения ПП (рис. 4, б) возрастает. На 1-й минуте в опытной группе значение ЧСС регистрировалось в нормальных условиях и в среднем составляло 222,6±22,8 в минуту. После 1-й минуты у сердца растягивали полость ПП и со 2-й минуты наблюдали значительный разброс в значениях ЧСС. На рис. 4 приведены нормированные значения ЧСС, определенные для пяти последовательных минутных интервалов и отнесенные к значению во 2-ю минуту (1-ю минуту после растяжения) для конкретного сердца.

Рис. 4. Временная зависимость частоты сердечных сокращений с нормировкой на значение во 2-ю минуту эксперимента: а — в 10 сердцах крыс из контрольной группы; б — в 10 сердцах крыс из опытной группы, где механическое растяжение правого предсердия осуществлялось непосредственно перед началом 2-й минуты

Рис. 5 иллюстрирует изменение коэффициента вариабельности CV на фоне механического растяжения ПП.

Рис. 5. Временные зависимости коэффициента вариабельности CV изолированного сердца крысы для одного контрольного и двух сердец из опытной группы Каждый столбец гистограммы соответствует одному из последовательных минутных интервалов, на которых проводился статистический анализ

Разброс значений длительности интервалов R–R показан на рис. 6 для двух сердец: из контрольной и опытной групп. На 1-й минуте в опытной группе значения R–R-интервалов регистрировались в нормальных условиях, после 1-й минуты осуществляли растяжение полости ПП.

Рис. 6. Диаграмма размахаинтервалов R–R контрольного (а) и опытного (б) сердец Изображены средние и медианные значения, 25-й и 75-й процентили, максимальные и минимальные значения. Отображенные значения получены в результате статистического анализа 50 последовательных R–R-интервалов, взятых в начале 6 последовательных временных отрезков минутной длительности

Скорость распространения волны возбуждения в миокарде. После растяжения ПП (рис. 7, б–г) в миокарде ЛЖ временная задержка регистрации возбуждения между электродами матрицы в среднем уменьшилась в 1,9±0,3 раза по сравнению с периодом до растяжения (рис. 7, а), что соответствует увеличению скорости распространения возбуждения. В конт­рольной группе изменений продолжительности временной задержки в течение 5 мин не наблюдалось.

Рис. 7. Фрагменты снятых с различных электродов электрограмм, иллюстрирующие изменение временной задержки между R-зубцами в различных точках миокарда левого желудочка Красными и фиолетовыми линиями показаны значения времени регистрации возбуждения на первом и последнем электродах соответственно из всех (A1–D1) выбранных электродов матрицы в норме (т.е. до растяжения) (а) и после механического растяжения вблизи выбранных моментов времени на 1-й (б), 2-й (в) и 5-й (г) минутах; на активационных картах справа от графиков тепловая карта показывает программно интерполированное пространственное распределение потенциала вблизи выбранных электродов и иллюстрирует форму фронта волны возбуждения и количество активных электродов в конкретный момент времени

Обсуждение

В результате данного исследования установлено, что растяжение ПП изолированного сердца крысы приводит к увеличению ЧСС. Ранее такие же результаты были получены в аналогичных исследованиях на изолированных сердцах теплокровных животных [25, 26] и на изолированном синусовом узле в условиях растяжения [27]. Положительная хронотропная реакция предполагает участие особого, независимого от активности блуждающего нерва, интракардиального рефлекса, подобного рефлексу Бейнбриджа.

Рост ЧСС происходит в течение 1-й минуты после растяжения и сопровождается наличием желудочковых аритмий, что, по-видимому, связано с адаптационными реакциями сердца. Модельные исследования, проведенные ранее на автоколебательных клетках сердца [17], показали их способность к увеличению частоты импульсации после растяжения, и объяснением такой реакции могут служить как активация неспецифических механочувствительных каналов, так и изменения мембранных токов каналов, генерирующих потенциал действия. Исходя из этого можно предположить, что рост ЧСС, наблюдаемый в нашей работе, связан с прямой активацией механическим воздействием клеток синоатриального узла. Однако в отличие от мгновенного увеличения частоты, наблюдаемого в препаратах кардиомиоцитов или срезах сердечной мышцы, в целостном органе мгновенного отклика не происходит.

Следует отметить, что отклик на растяжение ПП оценивался по электрофизиологическим параметрам рабочего миокарда. При этом в условиях ретроградной перфузии недостаток внутрижелудочкового давления и объема предполагает высокую скорость и низкую силу сокращения. В таком случае увеличение ЧСС не должно вызывать нарушений возбудимости и сократимости. Показано, что увеличение частоты возбуждения сопровождается ростом скорости распространения волны возбуждения в ЛЖ. Однако следует обратить внимание на подъем вариабельности сердечного ритма на фоне растяжения, которая особенно высока на начальных этапах растяжения. Если рассматривать появление положительной хронотропной реакции в ответ на растяжение в качестве проявления интракардиального рефлекса, ранее описанного в работах Г.И. Косицкого [2], то нельзя не учитывать присущего при этом положительного инотропного эффекта, который предполагает усиление входящего Ca²⁺-тока в фазе плато потенциала действия. Избыток ионов Ca²⁺ может привести к электрической нестабильности в желудочках сердца и развитию аритмии.

Заключение

Метод мультиэлектродного картирования гибкими матрицами позволяет выявить особенности изменения электрофизиологических параметров изолированного сердца в условиях растяжения ПП. При этом устройство гибкой мультиэлектродной матрицы дает возможность осуществить регистрацию электрических потенциалов с поверхности ЛЖ активно сокращающегося сердца крысы, перфузируемого методом Лангендорфа.

С помощью матрицы установлена взаимосвязь в работе двух разных отделов сердца: ПП, в котором локализован синусовый узел, регулирующий ритм сердечных сокращений, и ЛЖ. Использование множества электродов, определенным образом сгруппированных в матрице, дало возможность провести анализ пространственно-временных характеристик электрической активности на поверхности сердца и установить увеличение не только ЧСС, но и скорости распространения волны возбуждения в ЛЖ. Рост вариабельности сердечного ритма позволяет предположить существование дополнительных механоиндуцированных процессов формирования электрической нестабильности в растягиваемом предсердии. Обнаруженные в ЛЖ эффекты, по-видимому, обусловлены включением интракардиальных механизмов регуляции.

Финансирование исследования. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований в рамках проекта «Исследование коллективной динамики смешанных сред, состоящих из элементов, обладающих качественно различным поведением и имеющих сложную топологию связей», №17-02-00467.

Конфликт интересов. Конфликт интересов отсутствует.