Влияние низкоэнергетической наносекундной лазерной терапии на репаративный остеогенез in vivo

Э.А. Базикян, А.А. Чунихин, А.Г. Чобанян, Е.В. Ахмазов, Г.Н. Журули, М.Ю. Саакян, О.В. Зайратьянц

Ключевые слова: низкоэнергетическое лазерное излучение; фотодинамический эффект; наносекундный импульсный лазер; ремоделирование костной ткани; остеокластогенез; остеобластогенез.

Цель исследования — оценить влияние низкоинтенсивного импульсного лазерного излучения на репаративный остеогенез челюстных костей в эксперименте.

Материалы и методы. Исследование проводили на 70 половозрелых самцах крыс линии Wistar, которым в течение 21 дня с помощью ортодонтической пружины осуществляли перемещение нижнего моляра. Для лечения использовали лазерное устройство с уникальными параметрами излучения в наносекундном импульсном режиме, с длиной волны, соответствующей пику поглощения кислорода в тканях. В контрольной группе лазерное лечение не применялось. Для определения воздействия лазерного излучения с выбранными параметрами на стимуляцию процесса ремоделирования костной ткани выполняли морфологическое исследование, а также морфометрическое исследование с количественной оценкой остеокластов в периодонтальной связке на границе с альвеолярной костью и в лакунах резорбции.

Результаты. Уже на 3-и сутки эксперимента в 1-й группе со стороны давления отмечалось расширение и выраженное полнокровие сосудов периодонтальной связки, появление большего количества остеокластов на границе с альвеолярной костью по сравнению с группой контроля. На 7-е сутки со стороны давления отмечалась активация фибробластов, остеобластов и цементобластов, а также формирование нового цемента корня зуба, которое в группе контроля наблюдалось только на 14-е сутки эксперимента. На 21-е сутки в группе эксперимента отмечалась практически регенерировавшая костная ткань альвеолы, в группе контроля — выраженная диффузная воспалительная инфильтрация лейкоцитами с примесью лимфоцитов и макрофагов, окружающая фрагменты частично резорбированной альвеолярной кости.

Заключение. Использование низкоинтенсивного импульсного лазерного излучения вызывает ускорение процессов ремоделирования костной ткани, а также способствует неоваскуляризации и полнокровию периодонтальной связки и прилежащей ткани альвеолярной кости.

Введение

Возможности влияния лазерного излучения на биологические ткани за счет фотохимических, фототермических, фотодинамических эффектов очень велики. Лазерный луч способен проникать глубоко в ткани и при наличии определенных параметров излучения оказывать терапевтическое и хирургическое воздействие без повреждений рядом расположенных структур. Лазерные технологии широко используются в различных областях медицины: офтальмологии, оториноларингологии, травматологии, гинекологии, урологии, а также в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии [1–3]. Однако, несмотря на большое количество лазерных приборов и многочисленные научные исследования в области лазерной медицины, остается множество диапазонов длин волн и частот излучения, влияние которых на живую клетку и организм в целом еще недостаточно изучено. Особый интерес представляет инфракрасный спектр в ультракоротком импульсном диапазоне частот излучения [4].

Уникальные свойства лазерного излучения определяются воздействием его на кислород и воду в тканях. Присутствие кислорода во всех биологических средах в небольших концентрациях обусловливает возможность поглощения им фотонов лазерного излучения как фотоакцептора. Небольшие концентрации кислорода в тканях и, соответственно, генерация активных форм в небольшом количестве обусловливают направленность стимулирующего действия на биологические объекты фотореакций без сенсибилизаторов [5, 6].

Поскольку вопросы регуляции процессов костеобразования представляют интерес для разных областей клинической медицины: травматологии, ревматологии, онкологии, реконструктивной хирургии, стоматологии и челюстно-лицевой хирургии, возможности воздействия лазерного излучения на процесс ремоделирования костной ткани и стимуляции репаративного остеогенеза продолжают оставаться предметом научного поиска [7, 8].

Для оптимизации процесса ремоделирования костной ткани с использованием лазерного излучения исследований по влиянию такого воздействия на клеточные элементы кости и процессы минерального обмена в костной ткани недостаточно [9]. Разработка новых лазерных устройств для применения в медицине с уникальными параметрами лазерного излучения обусловливает изучение механизмов и методов его воздействия на ремоделирование костной ткани. Исследовательской группой кафедры хирургии полости рта Московского государственного медико-стоматологического университета им. А.И. Евдокимова разработано новое лазерное устройство с возможностью генерации импульсного излучения с наносекундной частотой и длиной волны, соответствующей максимуму поглощения кислорода [10, 11].

Изучение возможностей стимулирования процессов ремоделирования костной ткани с помощью данного устройства представляется оптимальным.

Цель исследования — изучить влияние низкоинтенсивного импульсного лазерного излучения на репаративный остеогенез челюстных костей в эксперименте.

Материалы и методы

В работе использовали новый лазерный аппарат на полупроводниковых кристаллах с длиной волны 1265–1275 нм, соответствующей максимуму поглощения кислорода, и возможностью генерации импульсного излучения в квазинепрерывном режиме с частотой 400–2000 нс. Излучение фокусировалось в оптическом световоде диаметром 400 мкм. Мощность излучения устанавливалась в пределах 2,0±0,06 Вт.

Эксперимент проводили на 70 половозрелых самцах крыс линии Wistar 10-недельного возраста с массой тела 180–200 г. Под наркозом с применением Калипсола 40 мг/кг в виде 5% раствора внутримышечно у животных моделировали экспериментальную модель медиального перемещения первого моляра нижней челюсти с помощью пружины в соответствии с методом Кawasaki и Shimizu [12]. Один конец пружины с силой сжатия 40 Н/см² фиксировали к первому моляру лигатурной проволокой, другой конец был прикреплен к центральному резцу с использованием светоотверждаемого композита (рис. 1).

Рис. 1. Пружина из NiTi, установленная между моляром и центральным резцом для создания модели перемещения зуба

Все животные были разделены на две группы: 1-я — экспериментальная (n=35) и 2-я — контрольная (n=35). В 1-й группе в течение 7 дней после начала перемещения проводили облучение лазером бесконтактным способом в области первого моляра нижней челюсти с мезиальной и дистальной сторон с сохранением фокусного расстояния от места облучения 3–5 мм, с экспозицией 5 мин, суммарной мощностью 200 мДж/см². Затем после 7-дневнего перерыва повторяли воздействие лазерным излучением в течение 7 сут. Во 2-й группе животным лазерную терапию не проводили.

На 3, 5, 7, 14, и 21-е сутки с целью выполнения дальнейшего гистоморфологического исследования для изучения влияния лазерного излучения на репаративный остеогенез из эксперимента выводили по 7 животных из каждой группы.

Содержание животных и проведение экспериментов осуществляли в соответствии с международными правилами «Guide for the Care and Use of Laboratory Animals» (National Research Council, 2011), а также с этическими принципами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (Страсбург, 2006). Работа одобрена Этическим комитетом Московского государственного медико-стоматологического университета им. А.И. Евдокимова.

Для проведения гистоморфологического исследования выделяли и отсепаровывали от мягких тканей нижнюю челюсть крыс, которую фиксировали в 10% нейтральном формалине в течение двух суток при температуре 4ºС и затем подвергали декальцинации с использованием реагента Biodec R (Bio Optica, Италия) в соответствии с протоколом фирмы-производителя. После декальцинации вырезали фрагмент челюсти, включавший первые два моляра, который по общепринятой методике заливали в парафин. Гистологические срезы толщиной 3 мкм изготавливали из специально ориентированных парафиновых блоков (для получения продольных по отношению к челюстной кости срезов, проходящих через оба моляра) на роторном микротоме НМ355S (Thermo Scientific, Германия), расправляли на предметных стеклах и окрашивали гематоксилином и эозином. Гистологические препараты исследовали и фотографировали на микроскопе Axio Lab.A1 (Carl Zeiss Microscopy, Германия).

В процессах ремоделирования костной ткани участвуют остеокласты и остеобласты. С медиальной стороны в направлении перемещения зуба большее значение имеет ускорение резорбции костной ткани, а с дистальной стороны — процессы регенерации. В морфометрическом исследовании проводили подсчет остеокластов в поле зрения микроскопа с медиальной стороны зуба. Количественную оценку выполняли в периодонтальной связке моляра на границе с альвеолярной костью, в поле зрения микроскопа. Морфологические наблюдения альвеолярной кости и периодонтальной связки проводили как со стороны давления, так и со стороны растяжения. На каждом этапе наблюдения с каждой стороны было изучено по 70 морфологических препаратов, в каждом из которых рассматривали 10 полей. Таким образом, для статистической обработки использовали по 700 полей микроскопических срезов, изученных под микроскопом для каждой группы на каждом этапе эксперимента.

Результаты обрабатывали с использованием компьютерного программного обеспечения, представляли в виде среднего значения и стандартного квадратического отклонения (М±σ) и для оценки применяли метод непараметрического анализа по Манну–Уитни. Величину критического уровня значимости принимали равной 0,05.

Результаты и обсуждение

По результатам морфологического исследования уже на 3-и сутки наблюдения в 1-й группе выявлялись значительные отличия в состоянии периодонтальной связки нижних резцов на границе с альвеолярной костью по сравнению со 2-й группой как со стороны давления, так и со стороны растяжения. Со стороны давления в 1-й группе отмечались расширение и выраженное полнокровие сосудов периодонтальной связки (что свидетельствует о развитии реактивного воспаления), появление большего количества остеокластов на границе с альвеолярной костью. В группе контроля отмечалось умеренное расширение сосудов, появление единичных остеокластов на границе с альвеолярной костью.

На 5-е сутки эксперимента в 1-й группе со стороны давления отмечались пролиферация мелких сосудов периодонтальной связки, нарушение параллельности пучков коллагена и отек периодонтальной связки, увеличение числа остеокластов в участках лакунарной резорбции альвеолярной кости, очаговая воспалительная инфильтрация лейкоцитами с примесью лимфоцитов и макрофагов (рис. 2, а). В группе контроля наблюдались пролиферация и расширение просвета сосудов периодонтальной связки, очаговый отек периодонтальной связки, единичные остеокласты в участках лакунарной резорбции альвеолярной кости, выраженная очагово-диффузная воспалительная инфильтрация лейкоцитами с примесью лимфоцитов и макрофагов (рис. 2, б).

Рис. 2. Морфологическая картина области исследования после перемещения зуба со стороны давления на 5-е сутки эксперимента:

а — в 1-й группе; б — во 2-й группе; 1 — корень моляра; 2 — периодонтальная связка; 3 — альвеолярная кость; стрелками обозначено увеличение количества остеокластов в участках лакунарной резорбции альвеолярной кости; окраска гематоксилином и эозином; ×400

На 7-е сутки в 1-й группе со стороны давления выявлялась активация фибробластов, остеобластов и цементобластов с формированием нового цемента корня зуба. В контрольной группе существенных изменений по сравнению с 5-ми сутками не наблюдалось.

На 14-е сутки со стороны давления в группе эксперимента отмечали значительное увеличение числа остеокластов в обширных участках лакунарной резорбции альвеолярной кости, а в в группе контроля на этом этапе наблюдали активацию фибробластов, остеобластов и цементобластов и впервые с начала эксперимента — формирование нового цемента корня зуба.

На этом этапе наблюдения со стороны растяжения в группе эксперимента определялись пролиферация мелких сосудов и расширение их просвета в периодонтальной связке, активация фибробластов, остеобластов и цементобластов с формированием нового цемента корня зуба, увеличение числа остеобластов и остеокластов на границе с альвеолярной костью. В группе контроля отмечали умеренную активацию фибробластов, остеобластов и цементобластов с очаговым формированием нового цемента корня зуба, а также небольшое увеличение числа остеобластов и остеокластов на границе с альвеолярной костью.

На 21-е сутки наблюдения в группе эксперимента со стороны давления фиксировали значительное увеличение числа остеокластов в обширных участках лакунарной резорбции альвеолярной кости по сравнению с группой контроля, активацию фибробластов и цементобластов с формированием и ремоделированием нового цемента корня зуба, в то время как во 2-й группе отмечалась выраженная диффузная воспалительная инфильтрация лейкоцитами с примесью лимфоцитов и макрофагов, окружающая фрагменты частично резорбированной альвеолярной кости (рис. 3).

Рис. 3. Морфологическая картина области исследования после перемещения зуба со стороны давления на 21-е сутки эксперимента:

а — в 1-й группе; б — во 2-й группе; 1 — корень моляра; 2 — периодонтальная связка; 3 — альвеолярная кость; 4 — пролиферация мелких сосудов и расширение их просвета; стрелками обозначены остеокласты в участках лакунарной резорбции альвеолярной кости; окраска гематоксилином и эозином; ×400

Со стороны растяжения на этом этапе наблюдения в 1-й группе отмечали формирование новых структур альвеолярной кости, пролиферацию мелких сосудов в периодонтальной связке, активацию фибробластов, остеобластов и цементобластов с формированием нового цемента корня зуба, увеличение числа остеобластов и остеокластов на границе с альвеолярной костью. Во 2-й группе со стороны растяжения на завершающем этапе эксперимента отмечали умеренную активацию фибробластов, остеобластов и цементобластов с очаговым формированием нового цемента корня зуба, нарушение параллельности пучков коллагена и отек периодонтальной связки, небольшое увеличение числа остеобластов и остеокластов на границе с альвеолярной костью, мелкие очаги формирования новых структур альвеолярной кости.

Количественная оценка остеокластов в периодонтальной связке со стороны давления (с медиальной стороны в направлении движения зуба) на границе с альвеолярной костью, в том числе в лакунах ее резорбции, проведенная с использованием морфометрического метода, подтверждает качественный морфологический анализ (см. таблицу).

Среднее количество остеокластов в периодонтальной связке со стороны давления на границе с альвеолярной костью на этапах эксперимента (М±σ)

Данные таблицы наглядно демонстрируют, что среднее количество остеокластов в экспериментальной группе выше на всех этапах наблюдения, а на ранних этапах — значительно выше: на 3-и сутки — более чем в 2,5 раза, на 5-е сутки — практически в 2 раза. Это позволяет утверждать, что такой эффект обусловлен влиянием лазерного излучения на пролиферацию остеокластов и ускорение процессов ремоделирования костной ткани.

Заключение

В экспериментальном исследовании, проведенном на животных, с помощью гистоморфологического и гистоморфометрического исследований доказано, что применение лазерного излучения с длиной волны 1265–1275 нм в наносекундном импульсном режиме способствует более ранней и выраженной неоваскуляризации и полнокровию периодонтальной связки и прилежащей ткани альвеолярной кости, активации фибробластов, цементобластов, остеобластов, более раннему и выраженному формированию новых структур альвеолярной кости и нового цемента корня зуба. Эти данные являются свидетельством ускорения процессов регенерации костной ткани под действием лазерного излучения с уникальными параметрами, что обусловливает перспективность его применения как при проведении ортодонтического лечения, так и при выполнении костно-пластических операций в челюстно-лицевой области. Использование лазерной терапии позволит сократить сроки реабилитации пациентов с костной патологией, а также, что немаловажно, уменьшить финансовые затраты на лечение.

Финансирование исследования и конфликт интересов. Исследование не финансировалось какими-либо источниками, и конфликты интересов, связанные с данным исследованием, отсутствуют.

Литература

Шахно Е.А. Физические основы применения лазеров в медицине. СПб; 2012.
Базикян Э.А., Чунихин А.А. Малоинвазивные лазерные технологии на основе роботизированных мультифункциональных комплексов в челюстно-лицевой хирургии и стоматологии. Российский стоматологический журнал 2016; 20(5): 228–231.
Чунихин А.А., Митронин А.В. Эндодонтическое лечение пульпита: традиционные и современные подходы. Эндодонтия today 2009; 4: 3–10.
Воронова О.С., Генинг Т.П., Сысолятин А.А., Светухин В.В. Влияние фемтосекундного лазерного излучения на показатели оксидативного стресса в опухолевой ткани при экспериментальном раке шейки матки. Фундаментальные исследования 2012; 1: 24–27.
Zakharov S.D., Ivanov A.V. Light-oxygen effect as a physical mechanism for activation of biosystems by quasi-monochromatic light (a review). Biophysics 2005; 50(1): S64–S85.
Anquez F., El Yazidi-Belkoura I., Randoux S., Suret P., Courtade E. Cancerous cell death from sensitizer free photoactivation of singlet oxygen. Photochem Photobiol 2011; 88(1): 167–174, https://doi.org/10.1111/j.1751-1097.2011.01028.x.
Сирак С.В., Щетинин Е.В., Петросян Г.Г., Гатило Ю.Ю. Влияние импульсного излучения полупроводникового лазера инфракрасного диапазона на активность щелочной фосфатазы при экспериментальном неосложненном переломе нижней челюсти и травматическом остеомиелите. Кубанский научный медицинский вестник 2016; 4(159): 106–110.
Schwarz F., Sculean A., Berakdar M., Szathmari L., Georg T., Becker J. In vivo and in vitro effects of an Er:YAG laser, a GaAlAs diode laser, and scaling and root planing on periodontally diseased root surfaces: a comparative histologic study. Lasers Surg Med 2003; 32(5): 359–366, https://doi.org/10.1002/lsm.10179.
Marques L., Holgado L.A., Francischone L.A., Ximenez J.P.B., Okamoto R., Kinoshita A. New LLLT protocol to speed up the bone healing process — histometric and immunohistochemical analysis in rat calvarial bone defect. Lasers Med Sci 2014; 30(4): 1225–1230, https://doi.org/10.1007/s10103-014-1580-x.
Chunikhin A.A., Sahakyan M.Y., Gazhva S.I., Bazikyan E.A. Development of nanosecond laser module built in the robotic multifunctional surgical complex for minimally invasive therapy of maxillofacial area pathology and estimation of its effects on blood plasma. Sovremennye tehnologii v medicine 2016; 8(4): 30–35, https://doi.org/10.17691/stm2016.8.4.04.
Chunikhin A.A., Bazikyan E.A., Pikhtin N.A. A laser unit for photodynamic therapy and robot-assisted microsurgery in dentistry. Technical Physics Letters 2017; 43(6): 507–510, https://doi.org/10.1134/s1063785017060074.
Kawasaki K., Shimizu N. Effects of low-energy laser irradiation on bone remodeling during experimental tooth movement in rats. Lasers Surg Med 2000; 26(3): 282–291, https://doi.org/10.1002/(sici)1096-9101(2000)26:3282::aid-lsm63.3.co;2-o.