Генетический полиморфизм у пациентов с впервые выявленным сахарным диабетом 2-го типа

Ю.А. Сорокина, Л.В. Ловцова, А.Л. Ураков, О.В. Занозина

Ключевые слова: генетический полиморфизм; сахарный диабет 2-го типа; персонализированная фармакотерапия; фармакологический ответ.

Цель исследования — изучить особенности фармакологического ответа на фармакотерапию сахарного диабета 2-го типа с учетом выявленных однонуклеотидных полиморфизмов генов эндотелиальной синтазы оксида азота, 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы и белка р53 и их сочетаний.

Материалы и методы. Обследовано 89 пациентов с впервые выявленным сахарным диабетом 2-го типа до начала фармакотерапии и 80 лиц без нарушений углеводного обмена. Определяли однонуклеотидные полиморфизмы генов эндотелиальной синтазы оксида азота, 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы и белка р53, а также сочетания полиморфных генов.

Результаты. Частота встречаемости изученных полиморфных генов у пациентов с впервые выявленным сахарным диабетом 2-го типа сопоставима с таковой в относительно здоровой популяции. Определены самые распространенные их сочетания среди пациентов с сахарным диабетом 2-го типа и лиц без нарушений углеводного обмена. Полигеномная природа сахарного диабета 2-го типа приводит к необходимости учитывания всевозможных сочетаний полиморфных генов.

Заключение. Результаты исследования обосновывают необходимость генотипирования для выявления сочетаний полиморфизмов у пациентов с впервые установленным сахарным диабетом 2-го типа с целью персонализации терапии и повышения ее эффективности.

Введение

Развитие современных технологий в исследовании генетического материала человека позволило по-новому взглянуть на эффективность и безопасность назначаемых препаратов. Одним из направлений персонализированной фармакотерапии стало изучение эффективности и безопасности сахароснижающих препаратов с позиции фармакогенетики [1]. Такой подход становится все более актуальным в связи с открытием многочисленных генов-кандидатов, ответственных как за лекарственные взаимодействия, нежелательные реакции, так и за эффективность реализации терапевтического действия препарата [2]. Потенциальными кандидатами могут выступать гены, непосредственно отвечающие за фармакокинетику и фармакодинамику препарата, а также гены различных белков и ферментов, ответственных за разнообразные процессы в организме. Так, например, образование оксида азота катализирует группа ферментов — синтазы оксида азота (NOS). Оксид азота играет фундаментальную роль в регуляции функционального состояния эндотелия и сосудистого тонуса, в том числе и у больных сахарным диабетом 2-го типа (СД 2) [3].

Доказано, что замена тимина (T) на цитозин (С) в позиции 786 гена эндотелиальной синтазы оксида азота может быть связана с определенными патологическими процессами. В частности, показано, что данная модификация ассоциирована с развитием оксидативного стресса [4], а также с повышенным риском гипертензии [5]. Установлено, что активность синтазы оксида азота существенно влияет на углеводный обмен — выключение гена этого фермента в эксперименте приводит к нарушению захвата глюкозы периферическими тканями, что свидетельствует о NO-зависимой утилизации глюкозы [6]. Регуляция утилизации глюкозы, в свою очередь, является одним из основных механизмов терапевтического действия сахароснижающих препаратов.

Одной из наиболее чувствительных и важных мишеней при повреждении активными формами кислорода является ДНК. Продуктом повреждения становится 8-оксогуанин, который в настоящее время считается одним из основных биомаркеров окислительного повреждения ДНК. Установлена связь между образованием 8-оксогуанина и такими процессами, как мутагенез, канцерогенез, старение, патогенез болезней пожилого возраста и сахарного диабета [7]. Удаление остатков 8-оксогуанина из ДНК человека осуществляет фермент 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаза (hOGG1). Доказано, что этот фермент играет ключевую роль в устранении повреждений ДНК вследствие окислительного стресса и улучшает утилизацию глюкозы клетками [8]. В исследованиях выявлена связь между типом сахарного диабета, его продолжительностью и степенью компенсации с полиморфизмом генов 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы (Ser326Cys rs1052133 C977G) [9, 10].

Ген ТР53 и кодируемый им белок р53 вовлечены в регуляцию клеточного ответа на стрессорные воздействия путем остановки клеточного цикла в контрольных точках для осуществления репарации ДНК либо индукции апоптоза в случае невозможности устранения ее повреждений [11].

Врожденный гиперинсулинизм, вызванный мутацией глюкокиназы, ассоциирован с апоптозом бета-клетки поджелудочной железы. Генетически измененная активность глюкокиназы повышает активность супрессорного белка р53. Повреждение ДНК и измененная активность белка р53 играют ключевую роль в развитии гиперинсулинемии и гипергликемии при СД 2 [12].

Изучая полиморфизм генов, необходимо помнить о высокой вероятности их различных сочетаний у одного пациента, что увеличивает шанс проявления того или иного признака, патологии или особенностей метаболизма [13]. Так, например, сочетание полиморфизма гена ТР53 с полиморфизмом ядерного фактора репарации 1 увеличивает риск развития СД 2 в три раза [14].

Материалы и методы

Исследование проведено на базе Нижегородской областной клинической больницы им. Н.А. Семашко, а также лабораторий Приволжского исследовательского медицинского университета (Н. Новгород). Обследовано 89 пациентов с впервые выявленным сахарным диабетом 2-го типа и 80 субъектов без нарушения углеводного обмена (группа сравнения).

Исследование проведено в соответствии с Хельсинкской декларацией (2013) и одобрено Этическим комитетом Приволжского исследовательского медицинского университета. От каждого пациента получено информированное согласие.

Критерии включения пациентов в исследование: установленный диагноз СД 2 не более 1 года; возраст — от 40 до 70 лет; гликированный гемоглобин — от 6,5 до 8,0%; индекс массы тела — до 40 кг/м²; добровольное информированное согласие на участие в исследовании.

Критерии исключения: СД 1; нарушенная толерантность к глюкозе и нарушение гликемии натощак; наличие тяжелых осложнений СД 2; нарушенная функция печени, почек и сердечно-сосудистой системы; хронические заболевания в стадии обострения; несоответствие критериям включения.

Все исследуемые были распределены на группы по генотипу однонуклеотидных полиморфизмов генов (ОНП). ОНП гена эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS3) C786T rs2070744 выявляли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с детекцией в реальном масштабе времени. ОНП гена 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы (hOGG1) Ser326Cys rs1052133 C977G и гена TP53 Pro72Arg rs1042522 C215G определяли методом ПЦР с электрофорезом. Все анализы проведены с использованием диагностических наборов для выявления полиморфизмов в геноме человека методом ПЦР «SNP-ЭКСПРЕСС» (НПФ «Литех», Россия). С образцом выделенной ДНК параллельно выполняли две реакции амплификации — с двумя парами аллель-специфичных праймеров. Использовали амплификатор детектирующий «ДТ-прайм» в модификации 5М («ДНК-Технология», Россия).

Полученные в ходе исследования результаты обрабатывали с использованием пакета прикладных программ Statistica 10.0 (StatSoft, Inc., США). Для оценки статистической значимости различий между относительными величинами применяли критерий ² с поправкой Йетса. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимали равным 0,05 [15].

Для вычисления отношения шансов использовали сертифицированный калькулятор для расчета статистики в исследованиях «случай–контроль» «Ген-Эксперт» (онлайн http://gen-exp.ru/calculator_or.php).

Результаты

При изучении частоты встречаемости гаплотипов ОНП гена эндотелиальной синтазы оксида азота (С786Т rs2070744) выявлено, что генотип СС (гомозигота по аллелю 1) распространен у пациентов с СД 2 с частотой, не отличающейся статистически значимо от таковой у лиц без нарушений углеводного обмена. Практически не отличаются частоты встречаемости гетерозигот (СТ) и гомозигот по аллелю 2 (ТТ) у лиц обследованных групп (см. таблицу).

Частота встречаемости гаплотипов полиморфизмов исследуемых генов у пациентов с сахарным диабетом 2-го типа и условно здоровых лиц

Не выявлено статистически значимой разницы значений и между встречаемостями аллелей С и Т в обследованных группах субъектов.

Полученные данные свидетельствуют об отсутствии ассоциации развития СД 2 с аллелями С и Т полиморфизма гена С786Т эндотелиальной синтазы оксида азота. При этом по гендерному составу, возрасту, индексу массы тела, наличию сопутствующих заболеваний представители гаплотипов СС, СТ и ТТ сопоставимы.

При исследовании частоты встречаемости гаплотипов ОНП гена 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы (Ser326Cys rs1052133 C977G) установлено, что генотип CC (гомозигота по аллелю 1) и CG (гетерозигота) распространены у пациентов с СД 2 практически так же, как и у лиц без нарушений углеводного обмена, а генотип GG не зарегистрирован (см. таблицу). По гендерному составу, возрасту, индексу массы тела, наличию сопутствующих заболеваний представители различных гаплотипов были также сопоставимы.

Анализ результатов исследования частот встречаемости ОНП гена белка р53 (Pro72Arg rs1042522 C215G) показал, что генотип СС (гомозигота по аллелю 1) распространен у пациентов с СД 2 практически так же, как и у лиц без нарушений углеводного обмена. Существенно не отличается частота встречаемости гетерозигот (GС) и гомозигот по аллелю 2 (GG) (см. таблицу).

Частоты встречаемости аллелей С и G указанного ОНП в основной группе и группе сравнения практически одинаковы. Различий между представителями гаплотипов ОНП гена белка р53 по гендерному составу, возрасту, индексу массы тела и сопутствующим заболеваниям не выявлено.

Однако при анализе результатов индивидуального типирования того или иного полиморфизма генов необходимо учитывать, что в человеческом организме одновременно работает множество сочетаний полиморфизмов и мутаций. Поэтому после выявления ОНП основных генов, выбранных нами для анализа, мы провели исследование распространенности сочетаний ОНП в группе пациентов с СД 2 и в группе сравнения.

На диаграммах (см. рисунок) отражена частота встречаемости сочетаний полиморфизмов изученных нами генов в определенной последовательности. Первый генотип в каждом сочетании отражает полиморфизм гена эндотелиальной синтазы оксида азота eNOS3 (rs2070744), следующий генотип отражает полиморфизм гена ТР53 (rs1042522) и последний генотип отражает полиморфизм гена 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы hOGG1 (rs1052133).

Распространенность сочетаний полиморфизмов выбранных для исследования генов:

а — у пациентов с впервые выявленным СД 2; б — у условно здоровых лиц; последовательность ОНП в ряду: eNOS3, TP53, hOGG1

Представленные данные свидетельствуют о разнообразии сочетаний ОНП на примере трех исследуемых нами генов.

Наиболее распространенное сочетание у пациентов с СД 2 — это гомозигота по аллели 2 ОНП eNOS3 С786Т, гомозигота по аллели 2 ОНП белка р53 Pro72Arg и гомозигота по аллели 1 hOGG1 Ser326Cys (отмечалось в 21,3% случаев). Затем следует сочетание: гетерозигота ОНП eNOS3 С786Т, гетерозигота белка р53 Pro72Arg и гомозигота по аллели 1 hOGG1 Ser326Cys (13,7% случаев). Самые редкие сочетания — это гомозигота по аллели 1 eNOS3 ОНП С786Т, гомозигота по аллели 1 ОНП белка р53 Pro72Arg и гомозигота по аллели 1 hOGG1 Ser326Cys (2% случаев), а также: гомозигота по аллели 2 ОНП eNOS3 С786Т, гомозигота по аллели 1 ОНП белка р53 Pro72Arg и гомозигота по аллели 1 hOGG1 Ser326Cys (4% случаев) (см. рисунок, а).

У лиц без нарушений углеводного обмена также определено три самых распространенных сочетания. Первое — это гетерозигота ОНП eNOS3 С786Т, гомозигота по аллели 2 ОНП белка р53 Pro72Arg и гомозигота по аллели 1 hOGG1 Ser326Cys (отмечалось в 15% случаев). Второе сочетание — гетерозигота ОНП eNOS3 С786Т, гомозигота по аллели 2 ОНП белка р53 Pro72Arg и гетерозигота hOGG1 Ser326Cys (выявлялось в 15,1% случаев). Третье сочетание — гомозигота по аллели 1 ОНП eNOS3 С786Т, гомозигота по аллели 2 ОНП белка р53 Pro72Arg и гомозигота по аллели 1 hOGG1 Ser326Cys (регистрировалось в 16% случаев) (см. рисунок, б).

Полученные в нашем исследовании результаты о распространенности сочетаний полиморфных генов могут стать основой для дальнейшего наблюдения за особенностями биохимических процессов, метаболизма, фармакологического ответа как у пациентов с СД 2, так и у лиц без нарушений углеводного обмена.

Обсуждение

Полученные данные свидетельствуют о том, что частота встречаемости полиморфных генов эндотелиальной синтазы оксида азота, 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы и белка р53 у пациентов с впервые выявленным СД 2 без тяжелых диабетических осложнений сопоставима с частотой у лиц без нарушений углеводного обмена.

В последнее время одни авторы пишут о влиянии изученных полиморфизмов на риск развития СД 2 и его осложнений, в то время как другие исследователи не подтверждают данной ассоциации [16, 17], что показали и результаты наших исследований. Вместе с тем противоречивые данные литературы и полученные результаты предполагают необходимость динамического наблюдения за жизненными показаниями пациентов с различными гаплотипами полиморфных генов с целью уточнения влияния генетических особенностей на тяжесть и скорость прогрессирования сахарного диабета. Это обусловлено двумя причинами: 1) изученные полиморфные гены могут быть ассоциированы не столько с риском развития СД 2, сколько с тяжестью течения заболевания, что в последующем скажется на формировании осложнений и приведет к меньшей эффективности сахароснижающей терапии; 2) определенное значение может иметь генетическое разнообразие возможных сочетаний ОНП генов у пациентов: генетические особенности больного могут влиять на переносимость и безопасность применяемого сахароснижающего препарата [2].

Ранее [18] нами были выявлены так называемые фенотипы «ответа» и «провала» среди изученных полиморфных генов, которые ответственны за индивидуальный ответ пациента на терапию метформином. Установлено, что своевременное определение соответствующего фенотипа «ответа» — одно из важнейших направлений персонализированной фармакотерапии, достоверно способствующее повышению ее эффективности [19] и, что немаловажно, безопасности [20]. Тем не менее полученные данные не отменяют необходимости динамического наблюдения за показателями эффективности и безопасности назначенной фармакотерапии, а также за прогрессированием заболевания.

Заключение

Результаты исследования демонстрируют наличие генетического полиморфизма у пациентов с впервые выявленным сахарным диабетом 2-го типа. Сочетания полиморфных генов вносят значительный вклад в прогрессирование заболевания и в развитие отдаленных эффектов фармакотерапии, а также являются индивидуальным фактором, необходимым для персонализации лечения.

Финансирование исследования. Авторы заявляют об отсутствии финансирования при проведении исследования.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Литература

Кононенко И.В., Майоров А.Ю., Кокшарова Е.О., Шестакова М.В. Фармакогенетика сахароснижающих препаратов. Сахарный диабет 2015; 18(4): 28–34, https://doi.org/10.14341/dm7681.
Staiger H., Schaeffeler E., Schwab M., Häring H.-U. Pharmacogenetics: implications for modern type 2 diabetes therapy. Rev Diabet Stud 2015; 12(3–4): 363–376, https://doi.org/10.1900/rds.2015.12.363.
Banerjee M., Vats P. Reactive metabolites and antioxidant gene polymorphisms in type 2 diabetes mellitus. Br J Biomed Sci 2014; 20(1): 10, https://doi.org/10.4103/0971-6866.132747.
Fortis M.F., Fraga L.R., Boquett J.A., Kowalski T.W., Dutra C.G., Gonçalves R.O., Vianna F.S.L., Schüler-Faccini L., Sanseverino M.T.V. Angiogenesis and oxidative stress-related gene variants in recurrent pregnancy loss. Reprod Fertil Dev 2018; 30(3): 498–506, https://doi.org/10.1071/rd17117.
Seidlerová J., Filipovský J., Mayer O. Jr., Kučerová A., Pešta M. Association between endothelial NO synthase polymorphisms and arterial properties in the general population. Nitric Oxide 2015; 44: 47–51, https://doi.org/10.1016/j.niox.2014.11.016.
Miranda J.A., Belo V.A., Souza-Costa D.C., Lanna C.M., Tanus-Santos J.E. eNOS polymorphism associated with metabolic syndrome in children and adolescents. Mol Cell Biochem 2013; 372(1–2): 155–160, https://doi.org/10.1007/s11010-012-1456-y.
Torres-Gonzalez M., Gawlowski T., Kocalis H., Scott B.T., Dillmann W.H. Mitochondrial 8-oxoguanine glycosylase decreases mitochondrial fragmentation and improves mitochondrial function in H9C2 cells under oxidative stress conditions. Am J Physiol Cell Physiol 2014; 306(3): C221–C229, https://doi.org/10.1152/ajpcell.00140.2013.
Yuzefovych L.V., Solodushko V.A., Wilson G.L., Rachek L.I. Protection from palmitate-induced mitochondrial DNA damage prevents from mitochondrial oxidative stress, mitochondrial dysfunction, apoptosis, and impaired insulin signaling in rat L6 skeletal muscle cells. Endocrinology 2012; 153(1): 92–100, https://doi.org/10.1210/en.2011-1442.
Milić M., Kišan M., Rogulj D., Radman M., Lovrenčić M.V., Konjevoda P., Domijan A.M. Level of primary DNA damage in the early stage of metabolic syndrome. Mutat Res 2013; 758(1–2): 1–5, https://doi.org/10.1016/j.mrgentox.2013.07.013.
Hara M., Nakamura K., Nanri H., Nishida Y., Hishida A., Kawai S., Hamajima N., Kita Y., Suzuki S., Mantjoro E.M., Ohnaka K., Uemura H., Matsui D., Oze I., Mikami H., Kubo M., Tanaka H.; Japan Multi-Institutional Collaborative Cohort (J-MICC) Study Group. Associations between hOGG1 Ser326Cys polymorphism and increased body mass index and fasting glucose level in the Japanese general population. J Epidemiol 2014; 24(5): 379–384, https://doi.org/10.2188/jea.je20140002.
Zhang Z., Tang P. Genomic pathology and biomarkers in breast cancer. Crit Rev Oncog 2017; 22(5–6): 411–426, https://doi.org/10.1615/critrevoncog.v22.i5-6.60.
Bonfigli A.R., Sirolla C., Testa R., Cucchi M., Spazzafumo L., Salvioli S., Ceriello A., Olivieri F., Festa R., Procopio A.D., Brandoni G., Boemi M., Marra M., Franceschi C. The p53 codon 72 (Arg72Pro) polymorphism is associated with the degree of insulin resistance in type 2 diabetic subjects: a cross-sectional study. Acta Diabetol 2012; 50(3): 429–436, https://doi.org/10.1007/s00592-012-0450-x.
Murk W., DeWan A.T. Exhaustive genome-wide search for SNP-SNP interactions across 10 human diseases. G3 (Bethesda) 2016; 6(7): 2043–2050, https://doi.org/10.1534/g3.116.028563.
Tornovsky-Babeay S., Dadon D., Ziv O., Tzipilevich E., Kadosh T., Schyr-Ben Haroush R., Hija A., Stolovich-Rain M., Furth-Lavi J., Granot Z., Porat S., Philipson L.H., Herold K.C., Bhatti T.R., Stanley C., Ashcroft F.M., In’t Veld P., Saada A., Magnuson M.A., Glaser B., Dor Y. Type 2 diabetes and congenital hyperinsulinism cause DNA double-strand breaks and p53 activity in β cells. Cell Metab 2014; 19(1): 109–121, https://doi.org/10.1016/j.cmet.2013.11.007.
Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. М: МедиаСфера; 2006; 312 с.
Strycharz J., Drzewoski J., Szemraj J., Sliwinska A. Is p53 involved in tissue-specific insulin resistance formation? Oxid Med Cell Longev 2017; 2017: 1–23, https://doi.org/10.1155/2017/9270549.
Kung C.-P., Murphy M.E. The role of the p53 tumor suppressor in metabolism and diabetes. J Endocrinol 2016; 231(2): R61–R75, https://doi.org/10.1530/joe-16-0324.
Сорокина Ю.А. Фармакогенетические аспекты пероральной сахароснижающей терапии: фенотипы «ответа» и «провала». Медицинский совет 2015; 8: 82–85.
Сорокина Ю.А., Занозина О.В., Ловцова Л.В., Серопян М.Ю. Способ прогнозирования течения и эффективности терапии больных сахарным диабетом 2 типа. Патент РФ 2626670. 2017.
Urakov A., Urakova N. Rheology and physical-chemical characteristics of the solutions of the medicines. Journal of Physics: Conference Series 2015; 602: 012043, https://doi.org/10.1088/1742-6596/602/1/012043.