Лазерная доплеровская флоуметрия в исследовании микролимфодинамики

Введение

Микроциркуляторное русло, как участок единой сосудистой системы человека, является связующим звеном между компартментами внутренней среды организма — кровью, лимфой и интерстициальным пространством — и по своей структуре и функции уязвимо для внешних и/или внутренних негативных воздействий.

Для исследования микрогемоциркуляции традиционно (с момента начала применения в клинической практике) используется лазерная доплеровская флоуметрия (ЛДФ) [1–5]. Особенность метода заключается в том, что субстратом измерения является не кровоток в отдельном сосуде, а общая микроциркуляторная картина перфузии зондируемого участка биоткани, представляющая собой суперпозицию разнонаправленных движений частиц в большом количестве микрососудов и изменения концентрации этих частиц в исследуемом участке [2, 3]. В этом направлении многочисленными исследованиями были разработаны способы анализа микроциркуляции с помощью ЛДФ, установлены ритмы колебаний кровотока в микроциркуляторном русле и их диагностическое значение [1–3, 6–10]. В то же время работы, посвященные использованию ЛДФ в оценке микролимфодинамики, в настоящее время не столь многочисленны [11–15].

Особенностью нашего исследования является раздельное изучение оптических характеристик сосудистых сегментов и анализ спектрального состава сигнала ЛДФ, зарегистрированного на выделенном кровеносном и лимфатическом сосудах.

Цель исследования заключалась в выявлении и обосновании диапазонов длин волн зондирующего излучения для оценки гемолимфодинамики методом ЛДФ на основе одновременного сравнительного экспериментального исследования коэффициента отражения и амплитудно-частотных характеристик ЛДФ-сигнала на изолированных сегментах кровеносной и лимфатической систем.

В процессе исследования решались следующие задачи:

выявить диапазоны длин волн зондирующего излучения с максимальными различиями отраженного сигнала в зависимости от наполнения кровеносного или лимфатического сосуда, оптимальные для оценки крово- и лимфотока;

выполнить сравнительный анализ амплитудно-частотных показателей ЛДФ-сигнала на выделенных кровеносном и лимфатическом сосудах in vivo.

Материалы и методы

Эксперименты проводили на базе кафедры физиологии Санкт-Петербургского государственного университета на самцах лабораторных крыс линии Wistar в возрасте 5–6 мес, массой 180–200 г.

Опыты выполнены в соответствии с требованиями Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (Страсбург, 2006).

Исследование спектральных характерис­тик кро­ви и лимфы в изолированных сосудах. Стати­ческие спектральные характеристики крови и лимфы изучались на изолированных сосудах, полученных в остром опыте от стандартных лабораторных крыс линии Wistar (самцы в возрасте 5–6 мес, n=5). У предварительно обездвиженной с помощью эфирного наркоза крысы препарировали и извлекали участки грудного лимфатического протока и нижней полой вены, содержащие лимфу и кровь соответственно.

Выбор крупных сосудов обусловлен тем, что возможности прибора не позволяют сфокусировать сигнал исключительно на лимфатических или кровеносных капиллярах. Размеры же крупного сосуда соответствуют области зондирования ЛДФ-системы, что позволяет зарегистрировать отдельные сигналы от кровеносного или лимфатического сосуда.

После извлечения препараты помещали на специальную подложку черного цвета, над которой с помощью металлической скобы жестко фиксировали световоды от источника излучения и фотоприемника (рис. 1). Для предотвращения высыхания препарат постоянно орошали 0,9% раствором натрия хлорида.

---

Рис. 1. Установка для исследования изолированного сосуда

---

В качестве источника излучения использовали вольфрамовую галогеновую лампу HL-2000 (Ocean Optics, США). Приемное оптическое волокно было соединено со спектрометром HR4000 (Ocean Optics, США). Исследования проводили в спектральном диапазоне 0,40–0,86 мкм.

Первоначально регистрировали спектр отражения сосуда, заполненного биологической средой (кровью или лимфой). Затем одна из лигатур срезалась, кровь или лимфа вытекали из сосуда, после чего выполнялась повторная регистрация спектра отражения.

Исследование ЛДФ-сигнала крово- и лимфотока in vivo. В данной части исследования были также задействованы 5 лабораторных крыс (самцов) линии Wistar. В качестве объекта для исследования ЛДФ-характеристик крово- и лимфотока in vivo нами были выбраны воротная вена и грудной лимфатический проток. Для измерения использовали диагностическую систему Biopac LDF 100C (Biopac Instruments, США) с длиной волны зондирующего излучения 830±10 нм.

У предварительно наркотизированной диэтиловым эфиром крысы вскрывали брюшную и грудную полость, брали на швы-держалки и отводили грудной лимфатический проток и воротную вену. С помощью игольчатого датчика TSD144 выполняли 2-минутную регистрацию ЛДФ-сигнала на обоих сосудах поочередно.

Затем с помощью продолжения экспозиции ди­этилового эфира достигали остановки сердца крысы. После остановки кровообращения проводили повторную 2-минутную регистрацию сигнала над грудным лимфатическим протоком и воротной веной, дополнительно регистрировали сигнал от кишечного лимфатического ствола.

Для обработки полученных ЛДФ-сигналов рассчитывали величины среднего показателя перфузии, а также его стандартного отклонения (флакса). Затем с помощью программы AcqKnowledge 3.8.2. строили амплитудно-частотные спектры.

Статистическая обработка проводилась с помощью пакета программ для статистического анализа GraphPad Prism 6.0. Для сравнения значений межгрупповых показателей применяли непарный непараметрический критерий Манна–Уитни.

Результаты и обсуждение

Опыты на изолированных сосудах. Спектры отражения изолированных грудного протока и нижней полой вены показаны на рис. 2. Одна кривая соответствует спектру отражения наполненного сосуда. После эвакуации крови или лимфы регистрировались статистически значимые (p=0,0059) изменения коэффициента отражения в определенных волновых диапазонах (700–860 и 410–560 нм), что демонстрирует другая кривая.

---

Рис. 2. Спектры отражения кровеносного и лимфатического сосудов: а — нижняя полая вена; б — грудной лимфатический проток

---

С нашей точки зрения, разность коэффициентов отражения в вышеуказанных диапазонах позволяет оценивать динамику наполнения зондируемого объекта кровью или лимфой соответственно.

Во всех опытах с кровеносными сосудами различия коэффициента отражения регистрировались в двух спектральных диапазонах: 410–560 и 700–860 нм, в то время как для лимфатических сосудов — только в диапазоне 700–860 нм.

В литературе широко представлены исследования, в которых ЛДФ применяется для анализа микрогемоциркуляции. Используемые при этом диагностические системы (Biopac; Biopac Systems, США; ЛАКК; «Лазма», Россия и др.) имеют длину волны зондирующего излучения, укладывающуюся в диапазон 700–860 нм (830 нм — для Biopac, 780 нм — для серийных ЛАКК и т.п.).

Выявленные нами различия коэффициентов отражения в диапазоне 700–860 нм имеют разнонаправленный характер для кровеносных и лимфатических сосудов. У кровеносных сосудов это проявляется с увеличением коэффициента отражения сосуда при уменьшении кровенаполнения. У лимфатических сосудов уменьшение лимфонаполнения, напротив, приводит к уменьшению коэффициента отражения. Величина этого различия характеризует вклад кровеносного и лимфатического компонентов перфузии микроциркуляторного русла.

ЛДФ-исследования in vivo. При работающем и остановленном сердце на грудном лимфатическом протоке были зарегистрированы ЛДФ-сигналы, показанные на рис. 3.

---

Рис. 3. ЛДФ-сигнал на грудном лимфатическом протоке: а — при работающем сердце; б — при остановленном сердце

---

В данных сигналах можно отметить наличие фазных осцилляций. Средний уровень показателя перфузии при работающем сердце составил 290 перфузионных единиц (пф. ед., BPU) при величине флакса в 20 пф. ед. В условиях кардиоплегии при сохранении фазных осцилляций средняя величина показателя перфузии уменьшилась до 124 пф. ед. (p=0,023) при величине флакса 11 пф. ед. (p>0,05). Данный феномен может быть обусловлен исключением системных факторов лимфодинамики (присасывающего действия грудной клетки и сердца), хотя в целом уровень модулирующих воздействий (сократительной активности лимфангионов) остается на прежнем уровне.

Сигналы, зарегистрированные на воротной вене, приведены на рис. 4. При регистрации ЛДФ-сигнала (в ус­ловиях работающего сердца) кривая имеет четкий волнообразный ха­рактер, с частотой, соответствующей частоте сердечных сокращений. Средняя величина показателя перфузии при этом составляет 185 пф. ед. при величине флакса 69 пф. ед. При регистрации сигнала на воротной вене в условиях остановки сердца кривая становится хаотической, колебания показателя перфузии не носят постоянного характера. Среднее значение показателя перфузии значимо ниже — 94 пф. ед. (p=0,027), также существенно снижается и величина флакса — до 13 пф. ед. (p=0,036).

---

Рис. 4. ЛДФ-сигнал на воротной вене: а — при работающем сердце; б — при остановленном сердце

---

Таким образом, для сигнала от кровеносного сосуда при работающем сердце прежде всего характерна большая величина флакса. Поскольку флакс характеризует разброс колебаний показателя перфузии под действием разнообразных факторов модуляции кровотока, можно заключить, что высокий флакс в сигнале с кровеносного сосуда обусловлен преобладающим значением работы сердца с его пропульсивно-присасывающим действием. При остановленном сердце данный фактор исключен, что приводит к снижению величины флакса и снижению показателя перфузии.

Оценка спектральных характеристик сигнала с воротной вены, зарегистрированного при работающем сердце, показывает, что медленноволновая гармоника в спектре (в диапазоне 0,05–0,20 Гц) не выявляется. Ближайшая к оси ординат гармоника отмечается начиная с частоты 0,3 Гц. В спектре преобладает пульсовая гармоника с пиком на частоте 2,53–2,59 Гц, что соответствует частоте сердечных сокращений 150–155 в минуту. В отсутствие сердечной деятельности каких-либо выраженных гармоник в спектре венозного сигнала не отмечается
(рис. 5).

---

Рис. 5. Амплитудно-частотный спектр венозного сигнала: а — при работающем сердце; б — при остановленном сердце

---

В спектре лимфатического сигнала при работающем сердце присутствует выраженная медленноволновая гармоника, сред­няя амплитуда — 0,68±0,12 пф. ед. (при максимальной амплитуде 2,09 пф. ед.). В условиях остановленного сердца в амплитудно-частотном спектре сигнала, зарегистрированного на грудном протоке, средняя амплитуда медленноволнового участка (0,05–0,2 Гц) составляет 0,36±0,08 пф. ед. (при максимальной амплитуде 1,02 пф. ед.) (рис. 6).

---

Рис. 6. Амплитудно-частотный спектр сигнала грудного протока: а — при работающем сердце; б — при остановленном сердце

---

Таким образом, диагностическая ЛДФ-система с длиной волны зондирующего излучения 830±10 нм обнаруживает способность к регистрации как лимфо-, так и кровотока. При этом лимфоток регистрируется как при работающем сердце, так и после его остановки. Движение лимфы под действием сокращений лимфангионов формирует амплитудную гармонику в диапазоне длин волн 0,05–0,20 Гц.

Следует отметить, что данная область в большинстве исследований обозначается как диапазон, характеризующий функционирование местных механизмов модуляции кровотока (миогенных, нейрогенных и эндотелиальных) [1, 8, 13, 15]. Учитывая наши данные, можно заключить, что при ЛДФ-исследованиях с расположением датчика на коже пациента результирующий сигнал представляет собой суперпозицию сигналов как от компонентов крови, так и от компонентов лимфы. Следовательно, требуется переоценка существующих алгоритмов интерпретации амплитуды медленноволновой гармоники и разработка математических методов различения лимфатического и кровеносного компонентов ЛДФ-сигнала.

Заключение

Результаты исследования in vivo спектральных составляющих колебаний микроциркуляторного русла методом ЛДФ при изменении скорости движения крови и лимфы и изучения ex vivo динамики спектров отражения кровеносных и лимфатических сосудов при изменении объема крови и лимфы демонстрируют, что метод ЛДФ позволяет регистрировать сигнал, характеризующий изменение перфузии тканей за счет лимфонаполнения. Спектральные отражательные свойства изолированных сосудов в свою очередь характеризуются разнонаправленным изменением коэффициента отражения при уменьшении объема крови и лимфы в исследуемом объеме биоткани, что следует учитывать при выборе источника излучения в ходе ЛДФ-исследований и разработки новых методик проведения функциональных проб.

Финансирование исследования. Работа выполнена в инициативном порядке.

Конфликт интересов. Авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов.