Мультимодальная оптическая когерентная томография: возможности визуализации кровеносных и лимфатических сосудов вульвы

Введение

Склероатрофический лишай является хроническим воспалительным кожно-слизистым расстройством генитальной и экстрагенитальной локализации. Это изнурительное заболевание, вызывающее зуд, боль, дизурию, ограничение мочеиспускания, диспареунию и значительные сексуальные дисфункции у женщин [1]. Этиология склероатрофического лишая еще недостаточно ясна, но многие данные, полученные в последние годы, указывают на аутоиммунную природу заболевания у генетически предрасположенных пациентов. Так, в работе N. Oyama с соавт. [2] примерно у 75% пациентов со склероатрофическим лишаем (против 7% в контрольной группе) обнаружены циркулирующие аутоантитела, направленные против ECM1 (белок внеклеточного матрикса 1). Подтверждение этим данным можно найти и в других работах [3].

В норме белок ЕСМ1 экспрессируется в различных компонентах кожи, включая все живые слои эпидермиса, стенки кровеносных сосудов и коллагеновые волокна дермы, способствуя тем самым поддержанию общей структуры кожи. О роли белка ЕСМ1 известно, что он участвует в контроле дифференцировки кератиноцитов в эпидермисе; играет роль в структурной организации дермы, связываясь с перликаном, матриксной металлопротеиназой 9 и фибулином; стимулирует пролиферацию эндотелиальных клеток и ангио­генез [4].

Нарушение функции белка ЕСМ1 при склеро­атрофическом лишае происходит вследствие аутоиммунной реакции и приводит к развитию следующих клинико-патологических изменений: со стороны эпителия — к гиперкератозу и/или атрофии; со стороны дермы — к гомогенизации, склерозу и гиалинозу волокон коллагена; со стороны кровеносных сосудов — к повреждению эндотелия, приводящему к усилению проницаемости сосудистой стенки [4]. При склероатрофическом лишае снижение экспрессии белка ЕСМ1 в кровеносных сосудах происходит на фоне повышенного синтеза коллагена V типа, что является причиной гиалинизации субэпителиальной зоны [5]. Важно отметить, что гиалинизация коллагеновых волокон сосочкового слоя дермы и кровеносных капилляров является классическим признаком склероатрофического лишая, который был предложен в качестве системы оценки степени его тяжести еще в 1986 г. [6].

В ряде исследований детально изучались изменения в кровеносных сосудах при развитии склероатрофического лишая вульвы [7–9]. Так, в работе [8] методом электронной микроскопии и иммунногистохимическим исследованием биопсийного материала обнаружено несколько феноменов: а) повреждение эндотелиальных клеток кровеносных сосудов за счет отслоения перицитов от эндотелиальных клеток; б) дез­­организация архитектоники кровеносных сосудов и в) исчезновение капилляров в сосочковом слое дермы.

О роли лимфатических сосудов в патогенезе данного заболевания практически ничего не известно. В здоровой коже лимфатические сосуды — это слепые концы, берущие начало в интерстициальном пространстве кожных сосочков. Лимфатические капилляры представляют собой тонкостенные сосуды размером от 30 до 80 мкм в диаметре, состоящие из одного слоя эндотелиальных клеток, напоминающих по форме лист дуба [10]. Лимфатическая сосудистая сеть координирует местное воспаление и иммунитет, а ее дисфункция может способствовать нерегулируемому локальному воспалению. Лимфатическая недостаточность делает данный участок кожи или слизистой оболочки уязвимым для инфекции, воспаления и малигнизации [10–12].

Прижизненная диагностика дистрофических заболеваний вульвы затруднена в том числе и из-за отсутствия информативных и объективных методов визуализации. Вульвоскопия обычно проводится с целью выявления атипического эпителия для исключения малигнизации. Серьезным ограничением метода вульвоскопии является высокая зависимость от толщины эпителия, которая неравномерна в разных участках вульвы и варьирует от пациента к пациенту, а также от наличия на поверхности рогового слоя. До сих пор не существует общепринятых вульвоскопических признаков дистрофии вульвы, поэтому вопрос об информативности вульвоскопии в диагностике ее дистрофических заболеваний является дискутабельным [13]. Золотым стандартом постановки диагноза дистрофии вульвы по-прежнему остается гистологический анализ биопсийного материала.

Мультимодальная оптическая когерентная томография (ОКТ) является неинвазивным методом визуализации биологических тканей с высоким пространственным разрешением — 10–15 мкм на глубину до 1,5 мм [14, 15]. С помощью ОКТ можно оценить как общую структуру биоткани (количество и толщину слоев, яркость сигнала) и состояние соединительной ткани, так и микроциркуляцию (кровоток и лимфоток) в реальном масштабе времени. Этот подход уже зарекомендовал себя в решении ряда задач, включая задачи визуализации микроциркуляции на слизистой оболочке полости рта [16] и мониторинг сосудистой реакции в ответ на лечение [17, 18].

ОКТ-лимфангиография основана на анализе соответствия пространственно-временной спекловой статистики в областях интереса и ожидаемой [19, 20]. Для визуализации микроциркуляции в кровеносных и лимфатических сосудах не требуется применения дополнительных контрастирующих веществ.

Исследований, направленных на прижизненное изучение состояния кровеносных и лимфатических сосудов в ткани вульвы, нами не обнаружено. Поэтому целью данной работы явилось изучение возможностей прижизненного исследования особенностей кровеносных и лимфатических сосудов вульвы при склероатрофическом лишае методом мультимодальной оптической когерентной томографии.

Материалы и методы

Характеристика пациентов. Исследование проведено на базе I отделения гинекологии НОКБ им. Н.А. Семашко Н. Новгорода. Обследовано 8 пациенток, которые были разделены на две группы. В 1-й группе наблюдали трех пациенток без заболеваний вульвы, проходивших лечение в стационаре по поводу пролапса стенки влагалища. Средний возраст их составил 49 лет (30–65 лет). Во 2-ю группу вошли 5 пациенток со склероатрофическим лишаем, предъявляющих жалобы на сухость слизистой оболочки вульвы и выраженный зуд, особенно в ночное время. В ОКТ-ис­следование были включены случаи без выраженного гиперкератоза, препятствующего проникновению оптического излучения. Средний возраст пациенток составил 57,2 года (46–68 лет).

Все исследования одобрены Этическим комитетом Приволжского исследовательского медицинского университета (Н. Новгород). ОКТ-исследования проведены с информированного согласия пациенток.

Мультимодальная ОКТ. Изучение состояния кровеносных и лимфатических сосудов вульвы выполнено методом мультимодальной ОКТ прижизненно без применения контрастирующих агентов. Спектральный ОКТ-прибор разработан в Федеральном исследовательском центре Институте прикладной физики РАН (Н. Новгород) [21, 22]. Источником излучения в ОКТ служит суперлюминесцентный диод с центральной длиной волны 1310 нм, шириной спектра 100 нм. Продольное разрешение составляет 10 мкм, разрешение по латеральной координате — 15 мкм (полная ширина пучка — на половине от его максимума). 3D-изображения размером 3,4×3,4×1,25 мм строятся в реальном масштабе времени в течение 26 с. ОКТ-блок оснащен гибким волоконно-оптическим зондом, который заканчивается торцевым объективом «карандашного» типа (длина — 15 см, диаметр — 1 см) и предназначен для контактного исследования ткани. ОКТ-ангиография и ОКТ-лимфангиография основаны на анализе спекловой структуры [23, 24].

3D-массив ОКТ-данных у каждой пациентки был получен из двух точек, расположенных в центральной зоне на границе внутреннего и среднего вульварного кольца [13] (справа и слева). Для каждой исследованной точки из 3D-набора данных получали 2D-изображения поперечного сечения ткани вглубь — структурное ОКТ-изображение, на котором оценивали количество слоев, толщину эпителия, наличие кератиновых масс на поверхности эпителия, ОКТ-сигнал от соединительной ткани. Также получали en-face изображения кровеносных и лимфатических сосудов на разных глубинах.

Гистологический анализ. Состояние всех компонентов ткани вульвы верифицировали гистологическими методами с окраской препаратов гематоксилином и эозином и пикрофуксином по Ван-Гизону. Верификация лимфатических сосудов в ткани вульвы выполнена методом иммуногистохимии с помощью антител на маркеры эндотелиоцитов лимфатических сосудов Podoplanin. Гистологические препараты оценивали с помощью микроскопа Leica DM 2500 (Leica Biosystems, Германия) c цифровой видеокамерой DFC 245 C в проходящем свете. Биопсийный материал забирали сразу после проведения ОКТ из исследуемых точек. Прицельность взятия биопсии обеспечивалась маркировкой границ ОКТ-исследования.

Результаты и обсуждение

ОКТ-визуализация ткани вульвы в норме. Кожа и слизистая оболочка вульвы в норме имеют равномерную бледно-розовую окраску. На ОКТ-изображениях визуализируется слоистая структура (рис. 1, а, б). Верхний слой с низкой интенсивностью сигнала соответствует эпителию. Толщина эпителия равномерная, граница с подлежащей соединительной тканью контрастная. ОКТ-сигнал от соединительной ткани высокий, быстро затухает с глубиной.

Рис. 1. Пациентка К., 67 лет. Слизистая оболочка вульвы без патологии: а — фотография места ОКТ-исследования и взятия биопсии; б — структурное ОКТ-изображение (В-скан); в — иммуногистохимическое окрашивание лимфатических сосудов антителами к Podoplanin; г и г′ — кровеносные и лимфатические сосуды (en-face ОКТ-изображения) сразу под эпителием на глубине до 170 мкм от поверхности вульвы; д и д′ — кровеносные и лимфатические сосуды на глубине 170–300 мкм; е и е′ — кровеносные и лимфатические сосуды на глубине 300–450 мкм; ж и ж′ — кровеносные и лимфатические сосуды на глубине 450–600 мкм; бар — 1 мм. Стрелками показаны лимфатические сосуды. Э — эпителий; СТ — соединительная ткань; ЛС — лимфатические сосуды

В соединительной ткани видны продолговатые включения с низким уровнем ОКТ-сигнала, соответствующие лимфатическим сосудам при иммуногистохимическом окрашивании (рис. 1, в). На ОКТ-ангио­­графических изображениях (рис. 1, г–ж) ви­зуали­зирована плотная сеть кровеносных сосудов. В субэпителиальном слое, на глубине до 170 мкм от поверхности ткани, видны преимущественно кровеносные капиллярные петли (см. рис. 1, г). В более глубоких слоях соединительной ткани, на глубине от 170 до 600 мкм, визуализируется плотная сеть артериол и венул. Диаметр сосудов увеличивается с глубиной (см. рис. 1, д–ж). Метод ОКТ-ангиографии чувствителен к потокам в сосудах диаметром от единиц микрометров (субразрешаемые капилляры) и толще, при этом минимальный характеризуемый размер при построении ОКТ-ангиограмм оказывается порядка разрешения ОКТ-системы (15 мкм).

В отличие от кровеносных, лимфатические сосуды образуют менее плотную сеть из более крупных сосудов (рис. 1 г′–ж′). Самые крупные лимфатические сосуды расположены в соединительной ткани на глубине 300–450 мкм (рис. 1, е′). Важно отметить, что в субэпителиальном слое, на глубине до 170 мкм от поверхности ткани, лимфатические сосуды методом ОКТ-лимфангиографии не визуализируются (см. рис. 1, г′). Это можно объяснить тем, что в данной области лимфатические капилляры еще не сформированы, а лимфатическая система представлена так называемыми прелимфатиками — тканевыми щелями вдоль пучков коллагеновых волокон [25], размер которых находится за пределами разрешения метода ОКТ.

ОКТ-визуализация ткани вульвы при склеро­атрофическом лишае. Такой лишай клинически проявляется в виде фарфорово-белых папул или бляшек, которые сопровождаются покраснением, гиперкератозом, трещинами и эрозиями (рис. 2, а). У обследованных нами пациенток он распространялся на малые половые губы, большие половые губы, межгубную борозду и клитор.

Рис. 2. Пациентка К., 58 лет. Диагноз — склероатрофический лишай вульвы: а — фотография места исследования; б — структурное ОКТ-изображение (В-скан); в — гистологический препарат, окраска гематоксилином и эозином; г — иммуногистохимическое окрашивание лимфатических сосудов антителами к Podoplanin; д и д′ — кровеносные и лимфатические сосуды (en-face ОКТ-изображения) сразу под эпителием на глубине до 170 мкм от поверхности вульвы; е и е′ — кровеносные и лимфатические сосуды на глубине 170–300 мкм; ж и ж′ — кровеносные и лимфатические сосуды на глубине 300–450 мкм; з и з′ — кровеносные и лимфатические сосуды на глубине 450–600 мкм; бар — 1 мм. Э — эпителий; СТ — соединительная ткань; ЛС — лимфатические сосуды. Белыми стрелками показано скопление кератиновых масс на поверхности эпителия, черными — лимфатические сосуды

ОКТ-изображения склероатрофического лишая сохраняют слоистую структуру, однако эпителий становится очень тонким (атрофичным), толщина его равномерна (рис. 2, б). По гистологическим данным толщина эпителия составляет 35–55 мкм. Граница с соединительной тканью менее контрастная, чем в норме. На поверхности эпителия заметны яркие точки, что соответствует гиперкератозу (рис. 2, в). На В-сканах в соединительной ткани продолговатые включения (лимфатические сосуды) чаще всего не визуализируются.

На гистологических препаратах соединительная ткань изменена. В очагах хронического воспаления волокна коллагена склерозированы (см. рис. 2, в). Склероз начинается сразу под эпителием и распространяется на разные глубины (в наших наблюдениях — от 145 до 880 мкм). В некоторых случаях в субэпителиальной зоне среди склерозированной стромы отмечены очаги гиалиноза. В зоне склероза и гиалиноза наблюдается снижение количества кровеносных сосудов в субэпителиальной зоне, а также васкулярный и периваскулярный склероз практически всех кровеносных сосудов. Лимфатические сосуды чаще отсутствуют или обнаруживаются единичные мелкие сосуды (рис. 2, г). В глубоких слоях соединительной ткани, где коллагеновые волокна не изменены (глубже зоны фиброза), кровеносные и лимфатические сосуды — без изменений и представлены в большом количестве.

На ОКТ-ангиографических изображениях на всех исследуемых глубинах плотность сети кровеносных сосудов резко снижена по сравнению с нормой (рис. 2, д–з). В субэпителиальной зоне, на глубине до 170 мкм от поверхности ткани, кровеносные капиллярные петли, характерные для нормальной слизистой оболочки, исчезают. Капилляров в этой зоне либо совсем нет, либо видны «обрывки» сосудов (см. рис. 2, д). Известно, что метод ОКТ-ангиографии визуализирует только сосуды с движущейся кровью [26]. Сосуды, в которых кровоток останавливается или критическим образом снижается, перестают быть видны. Периваскулярный склероз стенок кровеносных сосудов, приводящий с существенному снижению их просвета, по всей вероятности, служит причиной плохой визуализации кровеносных сосудов на ОКТ-ангиографических изображениях.

На ОКТ-лимфангиографических изображениях на глубине до 300 мкм лимфатические сосуды, которые характерны для нормальной слизистой оболочки вульвы, не визуализируются (рис. 2, д′, е′). Далее, на глубине от 300 до 600 мкм, в некоторых случаях могут визуализироваться очень тонкие и прерывистые лимфатические сосуды (рис. 2, ж′, з′). Причиной этому служат грубые нарушения соединительной ткани — фиброз и гиалиноз коллагеновых волокон.

Таким образом, метод мультимодальной ОКТ, включающий оценку структуры тканевых слоев вульвы с функцией ангиографии и лимфангиографии, позволяет прижизненно, без контрастирующих агентов и в реальном масштабе времени, оценить состояние эпителия и соединительной ткани, плотность и архитектонику сети кровеносных и лимфатических сосудов. ОКТ дает возможность в реальном масштабе времени проводить оценку состояния тканей на разных глубинах, тем самым диагностировать глубину поражения соединительной ткани при склероатрофическом лишае вульвы и мониторировать ее состояние в ходе лечения.

Заключение

Впервые методом мультимодальной ОКТ прижизненно исследованы особенности микроциркуляции (кровотока и лимфотока) слизистой оболочки вульвы в норме и при склеротическом лишае на разных глубинах. Установлена прямая зависимость архитектоники сетей кровеносных и лимфатических сосудов от состояния соединительной ткани. При развитии склероза и гиалиноза субэпителиального слоя наблюдается резкое снижение плотности сети кровеносных сосудов и практически полное исчезновение лимфатических сосудов, что еще больше нарушает трофику ткани.

Финансирование иcследования. Работа по ОКТ-ис­­следованию ткани вульвы была поддержана Российским научным фондом, соглашение №19-75-10084. Разработка принципов метода ОКТ-лимфан­гио­гра­фии на основе анализа параметров спеклов выполнена при поддержке гранта Президента РФ №МК-3416.2018.2 (Матвеев Л.А.).

Конфликт интересов. У авторов нет конфликта интересов.