Эффективность использования эндотелиальных колониеформирующих клеток для создания тканеинженерного сосудистого протеза в условиях in vitro

Цель исследования — оценка эффективности использования эндотелиальных колониеформирующих клеток (ECFCs) для заселения полимерного сосудистого графта в условиях пульсирующего биореактора.

Материалы и методы. Графты изготавливали методом электроспиннинга из смеси поли(3-гидроксибутирата-ко-3-гидроксивалерата), поли(ε-капролактона) и коллагена I типа. Для проведения экспериментов была использована коммерческая культура первичных эндотелиальных клеток коронарной артерии человека (HCAEC), культура эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC) и полученные из периферической крови пациентов с ишемической болезнью сердца ECFCs. В графты вводили суспензию клеток в концентрации 700 тыс./мл, культивировали 2 сут в статических условиях, затем в пульсирующем биореакторе при напряжении сдвига 1,27 дин/см² в течение одних суток и 2,85 дин/см² — еще 5 сут. Проводили иммунофлюоресцентное окрашивание внутренней поверхности графта на выявление маркеров CD31, VEGFR-2, CD144, vWF, F-актина и коллагена IV типа, а также подсчет плотности клеток на 1 мм² поверхности графта.

Результаты. Во всех культурах клеток при культивировании в динамических условиях регистрировали изменения, свидетельствовавшие об их адаптации к напряжению сдвига, выразившиеся в усилении экспрессии специфических маркеров (VEGFR-2), увеличении секреторной активности в отношении vWF и коллагена IV типа, упорядочивании филаментов F-актина и ориентации клеток вдоль потока, стимуляции образования межклеточных контактов. Однако при этом происходило неизбежное частичное смывание клеток с поверхности графта. Анализ плотности клеточного слоя после окончания динамического культивирования позволил заключить, что ECFCs отличаются наибольшей адгезией к полимеру и устойчивостью к смыванию потоком.

Заключение. С учетом возможности получения из легкодоступного источника (периферическая кровь) и продемонстрированной хорошей адаптации к условиям динамического культивирования ECFCs можно признать наиболее перспективной культурой для заселения тканеинженерных сосудистых протезов. Однако значительное уменьшение плотности клеточного слоя под воздействием напряжения сдвига свидетельствует о недостаточной адгезии клеток к поверхности и требует проведения дальнейших исследований по оптимизации фидерного слоя, покрывающего поверхность полимерного матрикса.

1. Benrashid E., McCoy C.C., Youngwirth L.M., Kim J., Manson R.J., Otto J.C., Lawson J.H. Tissue engineered vascular grafts: origins, development, and current strategies for clinical application. Methods 2016; 99: 13–19, https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2015.07.014.
2. Drews J.D., Miyachi H., Shinoka T. Tissue-engineered vascular grafts for congenital cardiac disease: clinical experience and current status. Trends Cardiovasc Med 2017; 27(8): 521–531, https://doi.org/10.1016/j.tcm.2017.06.013.
3. Melchiorri A.J., Hibino N., Fisher J.P. Strategies and techniques to enhance the in situ endothelialization of small-diameter biodegradable polymeric vascular grafts. Tissue Eng Part B Rev 2013; 19(4): 292–307, https://doi.org/10.1089/ten.teb.2012.0577.
4. Hoch E., Tovar G.E., Borchers K. Bioprinting of artificial blood vessels: current approaches towards a demanding goal. Eur J Cardiothorac Surg 2014; 46(5): 767–778, https://doi.org/10.1093/ejcts/ezu242.
5. Wang X., Lin P., Yao Q., Chen C. Development of small-diameter vascular grafts. World J Surg 2007; 31(4): 682–689, https://doi.org/10.1007/s00268-006-0731-z.
6. Hauser S., Jung F., Pietzsch J. Human endothelial cell models in biomaterial research. Trends Biotechnol 2017; 35(3): 265–277, https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2016.09.007.
7. Couet F., Meghezi S., Mantovani D. Fetal development, mechanobiology and optimal control processes can improve vascular tissue regeneration in bioreactors: an integrative review. Med Eng Phys 2012; 34(3): 269–278, https://doi.org/10.1016/j.medengphy.2011.10.009.
8. van Haaften E.E., Bouten C.V.C., Kurniawan N.A. Vascular mechanobiology: towards control of in situ regeneration. Cells 2017; 6(3): E19, https://doi.org/10.3390/cells6030019.
9. Kirton J.P., Xu Q. Endothelial precursors in vascular repair. Microvasc Res 2010; 79(3): 193–199, https://doi.org/10.1016/j.mvr.2010.02.009.
10. Lee P.S., Poh K.K. Endothelial progenitor cells in cardiovascular diseases. World J Stem Cells 2014; 6(3): 355–366, https://doi.org/10.4252/wjsc.v6.i3.355.
11. Jaffe E.A., Nachman R.L., Becker C.G., Minick C.R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest 1973; 52(11): 2745–2756, https://doi.org/10.1172/jci107470.
12. Kolbe M., Dohle E., Katerla D., Kirkpatrick C.J., Fuchs S. Enrichment of outgrowth endothelial cells in high and low colony-forming cultures from peripheral blood progenitors. Tissue Eng Part C Methods 2010; 16(5): 877–886, https://doi.org/10.1089/ten.tec.2009.0492.
13. Tzima E., Irani-Tehrani M., Kiosses W.B., Dejana E., Schultz D.A., Engelhardt B., Cao G., DeLisser H., Schwartz M.A. A mechanosensory complex that mediates the endothelial cell response to fluid shear stress. Nature 2005; 437(7057): 426–431, https://doi.org/10.1038/nature03952.
14. Nayak L., Lin Z., Jain M.K. “Go with the flow”: how Krüppel-like factor 2 regulates the vasoprotective effects of shear stress. Antioxid Redox Signal 2011; 15(5): 1449–1461, https://doi.org/10.1089/ars.2010.3647.
15. Fisher A.B., Chien S., Barakat A.I., Nerem R.M. Endothelial cellular response to altered shear stress. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2001; 281(3): L529–L533, https://doi.org/10.1152/ajplung.2001.281.3.l529.
16. Liu H., Gong X., Jing X., Ding X., Yao Y., Huang Y., Fan Y. Shear stress with appropriate time-step and amplification enhances endothelial cell retention on vascular grafts. J Tissue Eng Regen Med 2017; 11(11): 2965–2978, https://doi.org/10.1002/term.2196.
17. Tondreau M.Y., Laterreur V., Gauvin R., Vallières K., Bourget J.M., Lacroix D., Tremblay C., Germain L., Ruel J., Auger F.A. Mechanical properties of endothelialized fibroblast-derived vascular scaffolds stimulated in a bioreactor. Acta Biomater 2015; 18: 176–185, https://doi.org/10.1016/j.actbio.2015.02.026.
18. Wang X., Cooper S. Adhesion of endothelial cells and endothelial progenitor cells on peptide-linked polymers in shear flow. Tissue Eng Part A 2013; 19(9–10): 1113–1121, https://doi.org/10.1089/ten.tea.2011.0653.
19. dela Paz N.G., Walshe T.E., Leach L.L., Saint-Geniez M., D’Amore P.A. Role of shear-stress-induced VEGF expression in endothelial cell survival. J Cell Sci 2012; 125(4): 831–843, https://doi.org/10.1242/jcs.084301.
20. Gogia S., Neelamegham S. Role of fluid shear stress in regulating VWF structure, function and related blood disorders. Biorheology 2015; 52(5–6): 319–335, https://doi.org/10.3233/bir-15061.
21. Матвеева В.Г., Ханова М.Ю., Великанова Е.А., Ан­тонова Л.В., Сардин Е.С., Крутицкий С.С., Бар­ба­раш О.Л. Возможность получения и характеристика ко­лониеформирующих эндотелиальных клеток из пери­ферической крови пациентов с ишемической болезнью сердца. Цитология 2018; 60(8): 598–608.

Velikanova E.A., Matveeva V.G., Krivkina E.O., Sevostianova V.V., Khanova M.Yu., Kudryavtseva Yu.A., Antonova L.V. Effectiveness of Using Endothelial Colony-Forming Cells for Creating Tissue-Engineered Vascular Grafts under in vitro Conditions. Sovremennye tehnologii v medicine 2019; 11(4): 44, https://doi.org/10.17691/stm2019.11.4.05