Интегрон-зависимые механизмы резистентности к антибиотикам у штаммов Escherichia coli, выделенных из человека и животных в двух провинциях Ирана

Введение

Escherichia coli — это бактерия, которая существует как симбионт либо как патоген у человека и различных видов животных [1–5]. Известно, что именно этот микроорганизм является причиной частых ветеринарных, медицинских и социально-экономических проблем во многих странах мира [6–8].
В течение десятилетий неизбирательное, несанкционированное и неконтролируемое применение противомикробных препаратов для лекарственной терапии человека и животных привело к распространению генов лекарственной устойчивости у бактерий. Это послужило причиной развития резистентности к антибиотикам, что представляет серьезную угрозу здоровью людей и животных [8–9].

Лекарственная резистентность бактерий детерминируется главным образом генетическими компонентами, такими как плазмиды, транспозоны и интегроны. Некоторые авторы считают, что именно интегроны и конъюгативные плазмиды осуществляют перенос генов резистентности [9–12]. Интегроны — это генетические структуры, содержащие сайт-специфический механизм рекомбинации, позволяющий бактериям приобретать и экспрессировать кассеты генов, определяющих резистентность к антибиотикам [13–15]. Интегроны не обладают механизмом транспозиции, однако могут переноситься в сочетании с функцио­нальными транспозонами и/или конъюгативными плазмидами [13]. Кроме того, они содержат сайт-специфическую систему рекомбинации, способную захватывать и экспрессировать гены в форме кассет генов [16, 17]. Важнейшие компоненты интегронов класса 1 включают: а) 5’-консервативный сегмент (5’-CS), на котором находится ген интегразы (intI), который кодирует сайт-специфическую рекомбиназу; б) соседний сайт attI, который распознается интегразой и действует как рецептор для генных кассет; в) общую область (области) промотора, P_ant(P₁) и/или P_ant(P₂), из которых экспрессируются интегрированные кассеты генов [18, 19]. Консервативный сегмент 3’-CS, расположенный по ходу транскрипции ниже встроенных кассет генов, обычно содержит комбинацию из трех генов: qacE1, отвечающего за антибиотикорезистентность; sulI, играющего роль в резистентности к сульфонамидам; orf5 — открытой рамки считывания, функция которой в настоящее время не ясна [20].

В ряде исследований показано, что существуют клональное распространение резистентных штаммов, перенос резистентных генов между бактериями, обитающими у людей и животных, и обмен филогенетическими и генотипическими характеристиками [21]. Экспоненциальное увеличение и распространение бактерий, резистентных к противомикробным препаратам, вызывает огромную озабоченность в связи с трудностями лечения таких инфекций.

Установлено, что в быстром распространении резистентных бактерий большую роль играют гены, детерминирующие резистентность к антибиотикам, переносимые плазмидами, транспозонами и интегронами [17, 22–24]. Показано широкое распространение интегронов среди клинических изолятов [25–28]. Следовательно, высокий уровень лекарственной устойчивости клинических изолятов может объясняться селективным давлением антибиотиков и широко распространенным присутствием интегронов.

Насколько нам известно, существует недостаток информации о наличии интегронов в изолятах E. coli и их участии в развитии лекарственной резистентности. Поэтому целью настоящего исследования было изучение связи между наличием интегронов и резистентностью к противомикробным препаратам у штаммов E. coli, выделенных от человека и животных в провинциях Альборз и Исфахан (Иран).

Материалы и методы

Место проведения исследования. Исследование проводили в двух городах: Карадж, расположенном в провинции Альборз, и Заваре, расположенном в провинции Исфахан. Население провинции Альборз — 2,4 млн. человек, провинции Исфахан — 1,6 млн. человек.

Настоящее исследование было одобрено Коми­те­том по этике филиала Исламского университета Азад (Карадж).

Всего было собрано 80 образцов фекалий: от крупного рогатого скота (n=20), овец (n=20), домашней птицы (n=20) и людей (n=20). Фекалии были взяты у внешне здоровых людей, образцы отправили в медицинскую лабораторию Амини (провинция Альборз). Фекальные образцы были собраны у кур, выведенных на частной ферме в городе Карадж, у крупного рогатого скота и овец, содержащихся в частном животноводческом хозяйстве в городе Заваре. Ни одно животное не пострадало во время сбора проб в этом исследовании.

Выделение E. coli из образцов. Образцы фекалий помещали в питательную среду LST (Merck, Германия), а затем — в среду EC (Merck) при 44,5°C, после чего высевали на агар EMB (Merck). Колонии с металлическим блеском — вероятные изоляты E. сoli — были проверены методом IMViC для подтверждения [29].

Тест на чувствительность к антибиотикам. Фенотипическую устойчивость E. сoli к антибиотикам измеряли методом диффузии в агаре по Кирби–Бауэру с использованием коммерческих дисков. Диски Padtan-Teb (Иран) помещали на агаровые пластины Mюллера–Хинтона в соответствии с рекомендациями Института клинических и лабораторных стандартов. Использовали 11 дисков, содержащих следующие антибиотики: ампициллин (AM) 10 мкг, пиперациллин (PIP) 100 мкг, цефазолин (CZ) 30 мкг, стрептомицин (SМ) 10 мкг, канамицин (K) 30 мкг, гентамицин (GM) 10 мкг, неомицин (N) 30 мкг, тобрамицин (TOB) 10 мкг, амикацин (AN) 30 мкг, налидиксовая кислота (NA) 30 мкг и сульфаметоксазол/триметоприм (SXT) 23,75/1,25 мкг. Для определения чувствительности к антибиотикам культуру E. coli гомогенизировали в стерильном солевом растворе (0,85% NaCl) и доводили до мутности в соответствии со стандартами МакФарланда 0,5 ед. Затем это равномерно наносили на агаровые пластины Mюллера–Хинтона. Пластины переворачивали, а затем инкубировали при 35°С в течение 18 ч. После этого измеряли диаметры зон ингибирования роста и сравнивали со стандартом, а также с E. coli ATCC 25922 и Staphylococcus aureus ATCC 29213 в качестве положительного контроля. Изоляты с промежуточной лекарственной устойчивостью считались чувствительными, а изоляты, устойчивые к трем и более классам антибиотиков, считались мультирезистентными [30–32].

Амплификация интегронов с помощью ПЦР

Экстракция ДНК. Две колонии каждого бактериального изолята помещали в пробирки, содержащие 100 мкл дистиллированной воды. Пробирки нагревали при 100ºC в течение 10 мин, а затем осаждали клетки путем центрифугирования. Супернатант, содержащий ДНК, отбирали и хранили при –20ºC [29].

Дуплексная реакция ПЦР для индикации изолятов E. coli. Все изоляты E. coli тестировали с помощью множественной ПЦР с применением ранее описанных условий и протоколов [33]. Для амплификации фрагментов 287 и 789 п.н. генов int1 и int2 были использованы два набора праймеров соответственно (табл. 1). Дуплексную реакцию ПЦР проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей ПЦР-буфер (10 мМ Трис-HCl, 50 мМ KCl и 1,5 мМ MgCl₂, рН=8,7), dNTP (200 мкМ), каждый праймер (0,4 мкМ), ДНК-полимеразу Taq (1 МЕ) и матричную ДНК (2 мкл). Для проведения реакции использовали ДНК-термоциклер (CP2-003, Corbett, Австралия) и следующий режим: начальная денатурация при 94°C в течение 4 мин; 30 циклов денатурации при 94ºC в течение 5 с; отжиг при 59°C в течение 10 с; удлинение при 72°С в течение 30 с и конечная стадия расширения в течение 5 мин при 72°С с последующим выдерживанием при 4°С. Продукты ПЦР подвергали электрофорезу в 1,5% агарозном геле, содержащем бромид этидия, при напряжении 80 В в течение 1 ч.

---

Таблица 1. Два набора праймеров, использованных в реакции мультиплексной ПЦР

---

Результаты

Гены интегронов были обнаружены в 33 из 80 изолятов E. coli (41,25%). Среди них 25 изолятов (31,25%) содержали интегроны класса 1, включая штаммы, изолированные у овец (n=4), кур (n=12), коров (n=1) и людей (n=8). Восемь изолятов (10,0%) содержали комплексы класса 2, включая штаммы, полученные от овец (n=1), кур (n=6) и человека (n=1) (см. рисунок). Большинство штаммов E. coli, выделенных у овец, кур, коров и людей, были устойчивы к пиперациллину, тобрамицину, амикацину и гентамицину, тогда как меньшее число штаммов были устойчивы к цефазолину и налидиксовой кислоте (табл. 2).

---

Обнаружение гена int1 и int2 среди штаммов E. coli. Дорожка M — маркеры 100 п.н.; дорожки 1–6 — положительные штаммы

---

Таблица 2. Варианты резистентности E. coli к антибиотикам

---

У овец интегрон класса 1 был обнаружен в четырех изолятах E. coli, устойчивых к сульфаметоксазолу/триметоприму; а интегрон класса 2 — только в одном изоляте, устойчивом к сульфаметоксазолу/триметоприму (табл. 3). С другой стороны, интегроны классов 1 и 2 были обнаружены соответственно в 12 и 6 изолятах E. coli, характеризующихся мультирезистентностью, выделенных в пробах от домашней птицы (табл. 4). В пробах, полученных от коров, был обнаружен только один интегрон класса 1 в одном изоляте E. сoli, устойчивом к стрептомицину и сульфаметоксазолу/триметоприму (табл. 5). В одном из 8 изолятов E. coli, полученных от человека, присутствовали интегроны класса 1 и класса 2. Множественная лекарственная устойчивость была обнаружена у большинства изолятов E. сoli, выделенных от человека (табл. 6).

---

Таблица 3. Типы лекарственной устойчивости E. сoli у овец

---

Таблица 4. Типы лекарственной устойчивости E. coli у кур

---

Таблица 5. Типы лекарственной устойчивости E. coli у коров

---

Таблица 6. Типы лекарственной устойчивости E. сoli у людей

---

Таблица 7. Устойчивость к антибиотикам изолятов E. coli с интегронами и без интегронов, %

---

У интегрон-положительных штаммов E. сoli наблюдалась устойчивость более чем к шести противомикробным препаратам (табл. 7). Наши результаты показали, что интегроны широко распространены среди изолятов E. сoli, выделенных в провинции Альборз; при этом интегроны класса 1 более распространены, чем интегроны класса 2.

Обсуждение

Устойчивость энтеробактерий к антибиотикам может быть вызвана мутацией или наличием в бактериальной клетке подвижных ДНК-элементов, таких как плазмиды, транспозоны и интегроны [34]. Интегроны обладают способностью захватывать гены устойчивости к антибиотикам с помощью механизма рекомбинации. На сегодня известны пять классов интегронов, классифицированных по типу гена интегразы [35, 36].

Об эпидемиологическом распространении интегронов среди различных микроорганизмов информации пока недостаточно. В нашем исследовании 41,25% штаммов E. coli, выделенных у овец, кур, коров и людей, содержали один или два интегронных гена. Эти результаты попадают в диапазон значений (22–59%), сообщаемых различными авторами [27, 37]. В некоторых из этих изолятов был обнаружен только один класс интегронов, хотя в основном отмечалось несколько. Это наблюдение означает, что интегроны присутствуют в геноме энтеробактерий и могут быть связаны с распространением генетической информации, необходимой для развития устойчивости к антибиотикам.

Результаты нашего исследования показали, что 31,25% изолятов E. coli имеют интегроны класса 1. Это значение выше, чем в сообщении T. Tennstedt с соавт. [38], которые обнаружили присутствие интегронов класса 1 в 12,4% резистентных плазмид, полученных из образцов сточных вод. Вместе с тем этот показатель (12,4%) ниже, чем в Норвегии [39], Западной и Центральной Европе [27], Нидерландах [40], Франции [26], Корее [41] и Китае [42].

Спектры резистентности к антибиотикам, обнаруженные в нашем исследовании, показали, что у домашних животных высеваются бактерии, устойчивые к стрептомицину, что можно объяснить использованием стрептомицина и спектиномицина в животноводстве [43–47]. Не исключено, что кишечные палочки, устойчивые к стрептомицину, могут попадать к человеку алиментарным путем, связанным с употреблением контаминированных продуктов [48–50]. Кроме того, интегроны кишечной палочки животных могут передаваться E. сoli человека в процессе прохождения через кишечник.

Те спектры резистентности к антибиотикам, которые мы наблюдали в изолятах E. coli животных и человека в настоящем исследовании, соответствуют выводам другого исследования, проведенного в Ирландии, показавшего, что множественная лекарственная устойчивость E. сoli из почвы и фекалий крупного рогатого скота связана с интегронами класса 1 [51]. В некоторых работах сообщалось о присутствии интегронов в уропатогенной кишечной палочке [52, 53]. Авторы этих сообщений полагают, что наличие интегронов обусловливает моно- и множественную резистентность к противомикробным препаратам штаммов E. сoli. В настоящем исследовании интегроны классов 1 и 2 обнаружены соответственно в 12 и 6 изолятах E. coli с множественной лекарственной резистентностью, полученных от домашней птицы. Эти результаты аналогичны данным из Европы и Канады, в которых сообщалось об устойчивости уропатогенной E. coli к противомикробным препаратам [52].

Заключение

Результаты исследования показали, что интегроны широко распространены среди штаммов E. coli, выделенных в провинции Альборз (Иран). Это свидетельствует о необходимости усиления эпиднадзора, тщательного изучения многообразия факторов, действующих в этих условиях, и разработки адекватных стратегий профилактики.

Вклад авторов. RR планировал и проводил молекулярно-генетические исследования. HM выполнял биохимическое исследование. NH участвовал в разработке исследования и проводил статистический анализ. RK собирал образцы и проводил молекулярно-генетические исследования. FК предложил идею исследования, координировал его и подготовил проект статьи. Все авторы внесли одинаковый вклад в эту работу. Все авторы прочитали и утвердили окончательный вариант статьи.

Финансирование исследования. Работа была поддержана грантом Karaj Branch. Islamic Azad University данного Hamed Moradi для получения степени магистра наук.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.