Нейротропное действие карбамилированного дарбэпоэтина на модели первичной культуры гиппокампа
Активация церебральной эритропоэтиновой системы может служить перспективной стратегией для лечения различных нейродегенеративных и психоневрологических заболеваний благодаря запуску нейропротекторных механизмов и улучшению когнитивных функций. Отсутствие сведений о возможном нейротропном действии эритропоэтина снижает возможность использования мозгового рецептора к эритропоэтину в качестве терапевтической мишени при нейродегенеративных заболеваниях, связанных с гипоксией и воспалением.
Цель исследования — изучение влияния агониста эритропоэтинового рецептора карбамилированного дарбэпоэтина (CdEpo) на морфофункциональные характеристики нейрон-глиальных сетей первичной культуры гиппокампа мышей в условиях нормоксии.
Материалы и методы. Для изучения влияния стимуляции эритропоэтинового рецептора на функциональную активность нейрон-глиальных сетей гиппокампа использовали первичные культуры из диссоциированных клеток гиппокампа, полученных из эмбрионов (Е18) мышей линии C57BL/6. Эксперименты проводились на 18–23-й дни развития культуры in vitro. Длительность воздействия CdEpo (100 нг/мл) составила 24 ч. Функциональные изменения оценивали по электрической и метаболической активности клеток культуры с использованием методов локальной фиксации потенциала (patch clamp), мультиэлектродной регистрации биоэлектрической активности нейронных сетей и кальциевого имиджинга соответственно. Морфологические характеристики клеток первичной культуры гиппокампа исследовали с помощью просвечивающей электронной микроскопии.
Результаты. Воздействие CdEpo в течение суток на клетки первичной культуры гиппокампа не влияло на частоту спонтанных одиночных потенциалов действия, спонтанную пачечную активность клеток, на характеристики потенциалов действия нейронов (амплитуду фазы деполяризации, пороговый потенциал, амплитуду фазы гиперполяризации), емкость мембраны; не оказывало воздействия на биоэлектрические параметры сетевой активности нейронов (число спайков в составе сетевой пачки, длительность сетевой пачки и межпачечный интервал), кальциевую активность нейронов и глиальных клеток, определяемую по параметрам длительности и частоты спонтанных кальциевых осцилляций. На ультраструктурном уровне под влиянием CdEpo не изменялось количество зрелых асимметричных синаптических контактов, но происходил морфогенез внутренней структуры дендритных шипиков: повышалось число шипиков с эндоплазматическим ретикулумом и/или шипиковым аппаратом внутри, что является уникальным явлением для модели первичной культуры гиппокампа.
Заключение. На модели первичной культуры гиппокампа выявлено отсутствие нейротропного действия CdEpo — по параметрам биоэлектрической активности одиночных нейронов, нейронных сетей, а также активности астроцитарных сетей — по параметрам изменения концентрации внутриклеточного кальция (кальциевых осцилляций) в условиях нормоксии. В то же время CdEpo вызывает в некоторых нейронах изменение внутренней организации дендритных шипиков с появлением в них шипикового аппарата. Отсутствие влияния CdEpo на работу интактных нейронов и глии свидетельствует об относительной безопасности использования данной молекулы в терапевтических целях в качестве цитопротектора для тканей мозга.
Введение
Активация эритропоэтиновой системы головного мозга может служить перспективной стратегией для лечения различных нейродегенеративных и психоневрологических заболеваний благодаря запуску нейропротекторных механизмов и улучшению когнитивных функций [1, 2]. Оказалось, что выделяемый астроцитами эритропоэтин не только участвует в активации эритропоэза, но и стимулирует миграцию нейробластов в область ишемического повреждения мозга, т.е. регенерацию нервной ткани [3]. Выяснено, что транскрипционным фактором, запускающим экспрессию гена эритропоэтина в астроцитах при гипоксии, является hypoxia-inducible factor 2 (HIF-2) [4].
Нейропротекторное действие эритропоэтина (EPO) осуществляется предположительно через гетеромерный гетеродимерный тканевой протекторный рецептор, включающий субъединицу общего бета-рецептора (βcR, или CD131) [5] и по структуре отличающийся от классического гомодимерного эритропоэтинового рецептора (EpoR), участвующего в эритропоэзе [6]. Кроме того, для запуска механизма нейропротекции достаточно кратковременного доступа лиганда к гетеродимерному рецептору, тогда как для стимуляции эритропоэза с помощью гомодимерного EpoR требуется длительное воздействие лиганда [7]. Белок βcR относится к подсемейству рецепторов цитокинов 1-го типа и может образовывать гетеромерные рецепторы с субъединицами рецепторов к IL-3, IL-5 и GM-CSF. Установлено, что в ответ на клеточный стресс встраивание βcR в клеточную мембрану может изменяться [8]. Трудность в исследовании рецепторов к эритропоэтину в мозге заключается в отсутствии надежных коммерческих антител к комплексному гетеродимерному рецептору [9, 10]. На данный момент молекулярные механизмы действия эритропоэтина и его дериватов в головном мозге остаются неясными. В частности, нет данных об их возможном нейротропном действии, что снижает возможность использования мозгового рецептора к эритропоэтину в качестве терапевтической мишени при нейродегенеративных заболеваниях, в том числе связанных с гипоксией и воспалением.
В нашем исследовании в качестве агониста к гетеродимерному рецептору предлагается карбамилированная форма дарбэпоэтина (CdЕpo). CdЕpo получают путем карбамилирования всех аминокислотных остатков лизина, входящего в молекулу дарбэпоэтина, а также аминокислотного остатка аланина в N-концевой области белка. Карбамилирование эритропоэтина приводит к модификации сайтов связывания молекулы с рецептором EpoR, в частности высокоаффинного сайта Pro42–Trp51, содержащего остаток лизина Lys45. Предполагается, что потеря кроветворной активности является результатом карбамилирования именно этого остатка [11].
Поскольку применение агониста гетеродимерного эритропоэтинового рецептора в качестве нейропротектора предполагает взаимодействие с клетками нервной системы, необходимо оценить возможности CdEpo оказывать нейротропное действие. В связи с этим целью исследования явилось изучение влияния карбамилированного дарбэпоэтина на морфофункциональные характеристики клеток нейрон-глиальных сетей в модели первичной культуры гиппокампа мышей.
Материалы и методы
Первичные культуры гиппокампа. В качестве объекта исследования использованы первичные культуры гиппокампа, полученные от 18-дневных эмбрионов мышей линии C57BL/6 (Е18) и культивируемые в течение 23 сут. Основные правила содержания и ухода за экспериментальными животными соответствовали нормативам, указанным в приказе Министерства здравоохранения РФ от 1 апреля 2016 г. №199н «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики», Национальном стандарте Российской Федерации (ГОСТ 33044-2014 «Принципы надлежащей лабораторной практики»), санитарно-эпидемиологических правилах 2.2.1.3218-14 от 29 августа 2014 №51 и согласованы с локальным этическим комитетом Приволжского исследовательского медицинского университета.
Диссоциация клеток достигалась путем обработки ткани гиппокампа 0,25% трипсином (25200-056; Invitrogen, США). Cмену культуральной среды осуществляли через день. Жизнеспособность культур поддерживали в СО2-инкубаторе при температуре 35,5°C в газовой смеси, содержащей 5% СО2. Для изучения были взяты клеточные культуры на 18–23-е сутки развития in vitro. Предварительные электронно-микроскопические исследования показали [12], что на данном этапе развития первичной культуры нейроны взаимодействуют в сети в основном с помощью зрелых синаптических контактов. Регистрацию функциональной активности нейрон-глиальных сетей осуществляли через 24 ч после добавления в культуральную среду карбамилированного дарбэпоэтина (100 нг/мл).
Кальциевый имиджинг. С использованием флюоресцентной микроскопии, реализованной на базе конфокального лазерного сканирующего микроскопа LSM 510 (Carl Zeiss, Германия), осуществляли мониторинг функциональной активности нейронов и глии по параметру кратковременного изменения внутриклеточной концентрации кальция (кальциевые осцилляции). В качестве кальциевого зонда использовали Oregon Green 488 BAPTA-1 АМ (Thermo Fisher Scientific, США). Записи кальциевых осцилляций (событий) длились 10 мин с частотой смены кадров 4 с–1. Полученные серии изображений обрабатывали с помощью оригинального программного обеспечения [13]. Данная программа позволяет построить график зависимости интенсивности флюресценции от времени для каждой клетки и отметить на них осцилляторные события, а также дает возможность определить такие параметры, как частоту и длительность кальциевых событий.
Электрическая активность. Электрофизиологические показатели единичных нейронов в составе сетей первичных культур гиппокампа мышей определяли методом локальной фиксации потенциала (patch clamp) в конфигурации «целая клетка». Для его реализации использовали установку SliceScope Pro 2000 (Scientifica, Великобритания), усилитель Double patch clamp EPC-10 USB (HEKA Electronik, Германия), устройство для изготовления микропипеток Flaming Brown Micropipette Puller, model P-97 (Sutter Instrument CO, США), перистальтический насос Masterflex L/S (Cole-Parmer Instrument, Малайзия), фотовидеокамеру AxioCam ICm 1 (Carl Zeiss, Германия), капилляры из боросиликатного стекла GC120F-7.5 (Harvard Apparatus, Великобритания), а также программное обеспечение для записи и обработки электрофизиологических данных PatchMaster (HEKA Electronik, Германия), MiniAnalysis (Synaptosoft Inc., США).
Для измерения активности нейронов использовали внеклеточный раствор, содержащий (ммоль): NaCl — 130; KCl — 2,5; MgCl2 — 1,5; CaCl2 — 1,5; глюкозу — 10; HEPES — 10 при 24°C, осмолярности 300±5 мосм, pH — 7,3–7,4; а также внутриклеточный раствор (ммоль): K-gluconate — 130; HEPES — 10; EGTA — 2; L-аскорбиновая кислота — 3; MgCl2 — 2; Na2-GTP — 1 и Na2-ATP — 2 (pH=7,2; осмолярность — 295±3 мосм). Для блокирования натриевых токов при записи спонтанных возбуждающих постсинаптических токов использовали аналогичный внутриклеточный раствор с бромидом QX-314 в концентрации 2 мМ.
В работе задействованы клетки с сопротивлением доступа ниже 20 МОм и током утечки –100 … 100 пA. Потенциал покоя для нейронов поддерживался на уровне –70 мВ. Были исследованы такие параметры потенциала действия, как его амплитуда — высчитывалась по точкам от подпорогового потенциала до точки овершута; амплитуда гиперполяризации — по разнице между нижней точкой периода гиперполяризации после потенциала действия и базовой линией стимуляционной ступеньки, на которой этот потенциал возник; амплитуда порогового потенциала — по скорости нарастания потенциала каждой из клеток. Перечисленные выше параметры определяли по первому потенциалу действия на пороговом стимуле. Спонтанную активность нейронов в составе клеточной культуры регистрировали на протяжении 5 мин. Емкость мембраны тестировали подачей импульса в 5 мВ и высчитывали по изменению тока.
Для построения графиков и статистического анализа использовали программу GraphPad Prism 6 (GraphPad Software Inc., США).
Мультиэлектродная регистрация нейросетевой активности. Известно, что нейронная сеть мозга рассматривается как структурно-функциональная единица, отвечающая за процессы обработки, хранения и воспроизведения информации. При мультиэлектродной регистрации сетевой активности in vitro первичные культуры клеток мозга, в частности гиппокампа, выращивали непосредственно на мультиэлектродных матрицах. Регистрацию спонтанной биоэлектрической активности проводили с использованием матрицы мультиэлектродной системы MEA60 (Multichannel Systems, Германия) при стандартных условиях окружающей среды: температуре, содержании углекислого газа и кислорода, влажности [14].
Для получения данных использовали набор программного обеспечения MC Rack (Multichannel Systems, Германия). Исследовали основные характеристики спонтанной биоэлектрической активности нейронной сети: частоту и длительность малых сетевых пачек, количество спайков в пачке, длительность межпачечного интервала, процент свободных спайков.
Электронная микроскопия. Для электронно-микроскопических исследований обработку ткани проводили по стандартной методике. В качестве фиксаторов использовали последовательно 2,5% раствор глутарового альдегида на фосфатном буфере (рН=7,4) и 1% раствор четырехокиси осмия с феррицианидом калия. Материал обезвоживали в спиртах восходящей концентрации (до 100% спирта), далее — в 100% ацетоне. После обезвоживания обрабатывали смесью (1:1) 100% ацетона и смеси смол Epon–Araldit в течение 1 ч. После этого ткань заключали в смесь Epon–Araldit еще на 1 ч с последующей поляризацией смолы. Ультратонкие срезы выполняли на ультратоме Leica EMT UC7 (Leica Microsystems, Германия). Их контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца по методу Reynolds, затем просматривали в электронном микроскопе Morgagni 268D (FIE, США). Подсчет синаптических контактов осуществляли в пяти полях зрения площадью 1600 мкм2.
Статистика. Полученные данные изменения флюоресценции красителя Oregon Green 488 BAPTA-1 АМ, отражающие динамику внутриклеточного кальция (частота и длительность кальциевых событий), морфометрические и электрофизиологические данные представлены в работе в виде среднего ± стандартная ошибка среднего (M±SEM). Достоверность статистических различий выборок проверяли с помощью непараметрического теста Манна–Уитни. Для выявления статистически значимых различий в характеристиках биоэлектрической активности использовали метод анализа ANOVA по одному параметру с применением теста Стьюдента–Ньюмана–Кельса, статистически значимыми считали различия выборок при р<0,05.
Результаты и обсуждение
Исследование метаболической активности по параметру кратковременного изменения концентрации внутриклеточного кальция позволило оценить такие характеристики функционирования нейрон-глиальной сети, как длительность и частота кальциевых событий (рис. 1). Карбамилированный дарбэпоэтин статистически значимо не влиял на частоту кальциевых осцилляций в нейронах (4,88±0,12 с — в контроле и 3,87±0,57 с — в экспериментальной группе) и глие (0,74±0,07 и 0,57±0,17 соответственно) и на среднюю длительность кальциевых событий в нейронах (5,6±1,05 с — в контроле и 7,17±1,59 c — в экспериментальной группе) и глиальных клетках (11,7±0,85 и 10,75±0,11 с соответственно).
Проводимые электрофизиологические исследования показали отсутствие под действием СdEpo статистически значимых изменений следующих параметров потенциалов действия: размер (92,10±1,42 мВ — в контроле и 91,98±3,30 мВ — в экспериментальной группе) (рис. 2, г); величина гиперполяризации (–4,75±0,33 мВ — в контроле и –4,38±0,59 мВ — в экспериментальной группе) (рис. 2, в); величина порогового потенциала, необходимого для возникновения потенциала действия (7,24±1,57 мВ — в контроле и 4,62±1,04 мВ — при инкубации с CdEpo) (рис. 2, б). Емкость мембраны (1,132±0,1330 нФ — в контроле и 1,209±0,3371 нФ — в экспериментальной группе) (рис. 2, а) также не подверглась изменениям после обработки культур CdEpo. Отсутствовали статистически значимые изменения в частоте спонтанного возникновения потенциалов действия (р=0,2398).
Исследование нейросетевой активности не выявило статистически значимых различий в первичных культурах гиппокампа при добавлении карбамилированного дарбэпоэтина (рис. 3). Неизменными оставались как параметры спайков в пачке (рис. 3, а, в), так и характеристики самих пачек импульсов (рис. 3, б, г, д), а также процент свободных спайков нейронов, не вовлеченных в нейросетевую активность (рис. 3, е).
Ультраструктурный анализ синаптического пула нейронных сетей первичной культуры гиппокампа не обнаружил статистически значимых различий по количеству зрелых химических асимметричных контактов между группами (рис. 4, а). В то же время выявлено увеличение количества дендритных шипиков с эндоплазматическим ретикулумом и шипиковым аппаратом (рис. 4, б, рис. 5, е), редко встречаемых в первичных культурах клеток гиппокампа мышей. При качественном анализе ультраструктуры внутриклеточных органелл (митохондрий, ядра) значимых изменений в ультраструктурной организации не отмечено. Кристы в митохондриях были хорошо визуализированы в клетках как контрольной (рис. 5, а), так и исследуемой группы (рис. 5, г). В глиальных клетках наблюдались осмиофильные гранулы гликогена, различные органеллы интактной структуры (рис. 5, б и 5, д).
Таким образом, исследование воздействия CdEpo на интактные нейрон-глиальные сети in vitro через 24 ч продемонстрировало отсутствие нейротропного действия у карбамилированного деривата эритропоэтина. Следовательно, активация церебральных эритропоэтиновых рецепторов не вызывает изменения характеристик возбудимости нейронов, в частности потенциалзависимых ионных каналов, участвующих в генерации потенциалов действия. Кроме того, при нормоксии после аппликации СdЕро не выявлено изменения активности астроцитов по параметрам регистрации внутриклеточного кальция как характеристики спонтанной активности невозбудимых клеток глии.
Отсутствие нейротропного действия у СdЕро на модели первичной культуры гиппокампа подтверждает гипотезу о том, что эритропоэтин прежде всего является цитопротектором, запускающим каскад внутриклеточного сигналинга [15], способствующего адаптации клетки к гипоксии, чем и обусловлено улучшение функции нейронов и глии, наблюдаемое в эксперименте при моделировании ишемии/гипоксии.
Действительно, в наших исследованиях обнаружено адаптогенное действие СdЕро на морфогенез шипикового аппарата даже в условиях нормоксии, что позволяет модулировать поступающий к клетке сигнал через синапс. Ранее [16] была показана возможность влияния шипикового аппарата на быструю и медленную компоненты затухания кальциевой осцилляции, которая обеспечивается как наличием кальциевых помп в органелле, так и физическим присутствием шипикового аппарата в шипиковой ножке (эффект изолирования).
Заключение
Отсутствие статистически значимых различий по параметрам потенциалов действия и по длительности кальциевых событий в одиночных клетках, отсутствие изменений в биоэлектрической сетевой активности, а также нарушений ультраструктуры диссоциированных клеток гиппокампа после суточного воздействия карбамилированной формы дарбэпоэтина CdEpo демонстрирует относительную безопасность использования данной молекулы в терапевтических целях в качестве цитопротектора, поскольку она не оказывает значимых воздействий на работу интактных нейронов и глии.
Финансирование исследования. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований в рамках научного проекта №18-34-00877.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов, о которых необходимо сообщить.
Литература
- Hernández C.C., Burgos C.F., Gajardo A.H., Silva-Grecchi T., Gavilan J., Toledo J.R., Fuentealba J. Neuroprotective effects of erythropoietin on neurodegenerative and ischemic brain diseases: the role of erythropoietin receptor. Neural Regen Res 2017; 12(9): 1381–1389, https://doi.org/10.4103/1673-5374.215240.
- Ponce L.L., Navarro J.C., Ahmed O., Robertson C.S. Erythropoietin neuroprotection with traumatic brain injury. Pathophysiology 2013; 20(1): 31–38, https://doi.org/10.1016/j.pathophys.2012.02.005.
- Alnaeeli M., Wang L., Piknova B., Rogers H., Li X., Noguchi C.T. Erythropoietin in brain development and beyond. Anat Res Int 2012; 2012; 953264, https://doi.org/10.1155/2012/953264.
- Chavez J.C., Baranova O., Lin J., Pichiule P. The transcriptional activator hypoxia inducible factor 2 (HIF-2/EPAS-1) regulates the oxygen-dependent expression of erythropoietin in cortical astrocytes. J Neurosci 2006; 26(37): 9471–9481, https://doi.org/10.1523/jneurosci.2838-06.2006.
- Khan A.I., Coldewey S.M., Patel N.S., Rogazzo M., Collino M., Yaqoob M.M., Radermacher P., Kapoor A., Thiemermann C. Erythropoietin attenuates cardiac dysfunction in experimental sepsis in mice via activation of the β-common receptor. Dis Model Mech 2013; 6(4): 1021–1030, https://doi.org/10.1242/dmm.011908.
- Leist M., Ghezzi P., Grasso G., Bianchi R., Villa P., Fratelli M., Savino C., Bianchi M., Nielsen J., Gerwien J., Kallunki P., Larsen A.K., Helboe L., Christensen S., Pedersen L.O., Nielsen M., Torup L., Sager T., Sfacteria A., Erbayraktar S., Erbayraktar Z., Gokmen N., Yilmaz O., Cerami-Hand C., Xie Q.W., Coleman T., Cerami A., Brines M. Derivatives of erythropoietin that are tissue protective but not erythropoietic. Science 2004; 305(5681): 239–242, https://doi.org/10.1126/science.1098313.
- Brines M., Cerami A. Emerging biological roles for erythropoietin in the nervous system. Nat Rev Neurosci 2005; 6(6): 484–494, https://doi.org/10.1038/nrn1687.
- Bohr S., Patel S.J., Vasko R., Shen K., Iracheta-Vellve A., Lee J., Bale S.S., Chakraborty N., Brines M., Cerami A., Berthiaume F., Yarmush M.L. Modulation of cellular stress response via the erythropoietin/CD131 heteroreceptor complex in mouse mesenchymal-derived cells. J Mol Med 2015; 93(2): 199–210, https://doi.org/10.1007/s00109-014-1218-2.
- Elliott S., Busse L., Bass M.B., Lu H., Sarosi I., Sinclair A.M., Spahr C., Um M., Van G., Begley C.G. Anti-Epo receptor antibodies do not predict Epo receptor expression. Blood 2006; 107(5): 1892–1895, https://doi.org/10.1182/blood-2005-10-4066.
- Kirkeby A., van Beek J., Nielsen J., Leist M., Helboe L. Functional and immunochemical characterisation of different antibodies against the erythropoietin receptor. J Neurosci Methods 2007; 164(1): 50–58, https://doi.org/10.1016/j.jneumeth.2007.03.026.
- Жученко М.А., Серебрякова М.В., Серегин Ю.А., Черепушкин С.А., Лобанова Н.В., Клишин А.А., Вологжанникова А.А., Казаков А.С., Пермяков С.Е. Карбамилированный дарбэпоэтин альфа: структура и свойства. Биотехнология 2017; 33(4): 28–43, https://doi.org/10.21519/0234-2758-2017-33-4-28-43.
- Shirokova О.М., Frumkina L.Е., Vedunova М.V., Mitroshina Е.V., Zakharov Y.N., Khaspekov L.G., Mukhina I.V. Morphofunctional patterns of neuronal network developing in dissociated hippocampal cell cultures. Sovremennye tehnologii v medicine 2013; 5(2): 6–13.
- Zakharov Y.N., Mitroshina E.V., Vedunova M.V., Korotchenko S.A., Kalintseva Y.I., Mukhina I.V., Potanina A.V. Fluorescence analysis of the metabolic activity patterns of a neuronal–glial network. Journal of Optical Technology 2012; 79(6): 348, https://doi.org/10.1364/jot.79.000348.
- Pimashkin A., Gladkov A., Mukhina I., Kazantsev V. Adaptive enhancement of learning protocol in hippocampal cultured networks grown on multielectrode arrays. Front Neural Circuits 2013; 7, https://doi.org/10.3389/fncir.2013.00087.
- Ding J., Wang J., Li Q.Y., Yu J.Z., Ma C.G., Wang X., Lu C.Z., Xiao B.G., Neuroprotection and CD131/GDNF/AKT pathway of carbamylated erythropoietin in hypoxic neurons. Mol Neurobiol 2017; 54(7): 5051–5060, https://doi.org/10.1007/s12035-016-0022-0.
- Majewska A., Brown E., Ross J., Yuste R. Mechanisms of calcium decay kinetics in hippocampal spines: role of spine calcium pumps and calcium diffusion through the spine neck in biochemical compartmentalization. J Neurosci 2000; 20(5): 1722–1734, https://doi.org/10.1523/jneurosci.20-05-01722.2000.