Генотипирование ВИЧ и филогенетический анализ в системе вирусологического мониторинга ВИЧ-инфекции

Введение

Длительный период развития эпидемического процесса ВИЧ-инфекции с высоким уровнем пораженности населения на значительной части территорий Российской Федерации, рост числа вторичных заболеваний у ВИЧ-инфицированных предопределили появление значительного количества лиц с ВИЧ, нуждающихся в амбулаторном и стационарном лечении [1].

Указанные обстоятельства, а также рост числа случаев ВИЧ-инфекции среди доноров и медицинских работников актуализируют проблему заражения ВИЧ-инфекцией пациентов при оказании им медицинской помощи в учреждениях здравоохранения, а также медицинских работников при выполнении ими профессиональных обязанностей [2].

Современные особенности течения эпидемии ВИЧ-инфекции и рост числа случаев заражения ВИЧ с неоднозначной трактовкой причин и условий инфицирования обусловили острую необходимость проведения молекулярно-генетического мониторинга ВИЧ-инфекции, который стал возможен при развитии современных лабораторных технологий [3, 4].

Генотипирование ВИЧ и последующий филогенетический анализ являются методами высокой чувствительности и специфичности, позволяющими получить корректные и в значительной степени достоверные результаты с установлением генетического сходства или различия между нуклеотидными последовательностями образцов в очагах инфицирования ВИЧ внутри одного субтипа, обеспечить доказательную базу наличия/отсутствия эпидемиологической связи между ними [5, 6].

Использование современных молекулярно-генетических технологий в системе вирусологического мониторинга ВИЧ-инфекции расширяет научные знания о биолого-генетических характеристиках возбудителя, его взаимодействии с организмом человека, раскрывает особенности развития механизма заболевания, увеличивает возможности лабораторной и эпидемиологической диагностики инфекции, вызванной ВИЧ.

Цель исследования — оценить возможности и эффективность использования современных молекулярно-генетических технологий в определении источника инфицирования и установлении причинно-следственных связей в эпидемическом очаге ВИЧ-инфекции.

Материалы и методы

Молекулярно-генетическая экспертиза проводилась в лаборатории молекулярно-генетических и серологических методов исследования Приволжского окружного центра по профилактике и борьбе со СПИД Нижегородского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора. В исследуемую группу были включены два образца плазмы крови: медицинской сестры М. (№1048) и предполагаемого источника инфекции — пациентки П. (№1049). В группу сравнения вошли 18 образцов плазмы крови ВИЧ-инфицированных пациентов из региона проживания исследуемой группы (№№1051–1058, 1060–1068, 1070). В работе также использованы 13 нуклеотидных последовательностей генома вируса из международной базы GenBank. Построение филогенетического дерева и расчет генетической дистанции проводили путем анализа 33 образцов.

Идентификацию нуклеотидных последовательностей генома ВИЧ проводили при помощи коммерческих тест-систем ViroSeq HIV-1 (Abbott, США) и «АмплиСенс HIV-Resist-Seq» (ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) методом секвенирования амплифицированных фрагментов гена pol с использованием праймеров, включенных в комплект с терминатором сиквенсовой реакции BigDye (Sequencing Module — BigDye v. 3.1), на генетических анализаторах ABI Prism 3100 и ABI 3500XL (Applied Biosystems, США). Исследования проводились с использованием нуклеотидных последовательностей ВИЧ-1 участка гена протеазы (pro) и обратной транскриптазы (rev).

Анализ данных секвенирования осуществляли с помощью программного обеспечения ViroSeq HIV-1 Genotyping System Software v. 2.8 (Celera Diagnostic, США) и «ДЕОНА» («МедАйТи Групп», Россия).

Генотипирование ВИЧ проводили путем интеграции с базой данных Стэнфордского университета в режиме реального времени (https://hivdb.stanford.edu).

Для определения субтипов ВИЧ-1 изучаемых об­разцов применяли программное обеспечение COMET HIV-1/2 and HCV (https://comet.retrovirology.lu) и REGA HIV-1 Subtyping Tool v. 3.0 (http://RegaSubtyping/stanford-hiv/typingtool).

Для выявления существующих гомологов штаммов ВИЧ в базах данных использовали программу BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast).

Филогенетический анализ и расчет генетических дистанций выполняли при помощи программы MEGA 5.2 с использованием статистического метода Maximum Likelihood analysis, двухпараметрической модели Kimura (Bootstrap level 1000).

Результаты и обсуждение

Генотипирование ВИЧ и последующий филогенетический анализ являются важным дополнением, а иногда и единственным объективным доказательством наличия или отсутствия эпидемиологической связи между исследуемыми образцами. Они позволяют разобраться в сложных случаях при установлении причин и источника инфицирования ВИЧ. В нашем исследовании эффективность использования этих методов рассмотрена на конкретном случае.

Так, согласно сведениям, предоставленным сотрудниками Центра по профилактике и борьбе со СПИД (Центр СПИД) — одного из субъектов Приволжского федерального округа, 30.07.2016 г. при разборе системы для внутривенного введения, используемой для пациентки П. с ранее известным положительным ВИЧ-статусом, у медицинской сестры М. с ее слов (на момент аварии М. находилась одна в процедурном кабинете) произошла аварийная ситуация — укол дистальной фаланги указательного пальца правой верхней конечности. Экстренные мероприятия и постконтактная химиопрофилактика проведены в полном объеме, экспресс-тестирование на ВИЧ-инфекцию на рабочем месте в момент аварии не выполнялось. Результаты предыдущего тестирования М. на маркеры ВИЧ-инфекции (апрель 2016 г.) были отрицательными. Иммунный блоттинг от 17.08.2016 г. показал сомнительный результат, от 06.09.2016 г. — положительный, поставлен диагноз «ВИЧ-инфекция, профессиональное инфицирование?».

С целью лабораторного подтверждения/опровержения данного факта в лаборатории Приволжского окружного центра СПИД выполнены генотипирование и последующий филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей генома вирусов, выделенных из образцов плазмы крови исследуемой группы (медсестры М. и пациентки П.) и группы сравнения, а также образцов из базы GenBank.

Генетическое типирование установило, что все используемые вирусные изоляты, в том числе образцы исследуемой группы (№1048 и №1049), относятся к субтипу А (А6) ВИЧ-1. Данная ситуация обусловила необходимость филогенетического анализа, который показал, что образцы №1048 и №1049 не группируются в отдельный кластер, для каждого из них обнаружены генетически более близкие образцы из группы сравнения (см. рисунок). Дистанция, рассчитанная между нуклеотидными последовательностями образцов исследуемой группы, составила 0,050, а между нуклеотидными последовательностями данных образцов и образцов из группы сравнения варьировала от 0,007 до 0,058 (среднее — 0,032). Таким образом, генетическая близость меж­ду об­разцами исследуемой группы не выше, чем между образцами этой группы и группы сравнения. Данный факт может свидетельствовать о низкой вероятности наличия эпидемиологической связи между медицинской сестрой М. и пациенткой П.

Филогенетическое дерево образцов исследуемой группы (№№1048, 1049) и группы сравнения, построенное с использованием нуклеотидных последовательностей гена pol ВИЧ-1

Вместе с тем, согласно данным, предоставленным также сотрудниками Центра СПИД, медицинская сестра М. могла иметь эпидемически значимые контакты с ВИЧ-инфицированным пациентом Н. (№1051 из группы сравнения), ранее состоявшим на диспансерном учете в Центре. Результаты проведенного филогенетического анализа позволили установить, что дистанция, рассчитанная между нуклеотидными последовательностями образца №1048 и образца №1051 — 0,007, свидетельствует о высокой степени генетической близости данных изолятов. Они достоверно образовывали общий кластер на филогенетическом дереве (см. рисунок), что подтверждает наличие эпидемиологической связи между ними.

Таким образом, в данном конкретном случае проведенная молекулярно-генетическая экспертиза с использованием современных лабораторных технологий генотипирования и последующего филогенетического анализа позволила установить, что образец, полученный от медицинской сестры М. (№1048), генетически более близок с образцом из группы сравнения — пациентом Н. (№1051), чем с предполагаемым источником инфекции — пациенткой П. (№1049). Полученный вывод достоверно не подтверждает факта профессионального заражения ВИЧ-инфекцией.

Заключение

Генотипирование и последующий филогенетический анализ, используемые для молекулярно-генетической экспертизы, проводимой при подозрении на профессиональное инфицирование ВИЧ, не подтвердили генетического родства между образцами исследуемой группы и обнаружили генетически более близкие образцы из группы сравнения. Полученные результаты явились основанием для отказа в постановке диагноза профессионального инфицирования ВИЧ.

Применение данных современных молекулярно-генетических методов показало их практическую значимость и эффективность.

Финансирование исследования и конфликт интересов. Исследование не финансировалось какими-либо источниками, и конфликты интересов, связанные с данным исследованием, отсутствуют.