Реактивность нейтрофилоподобных клеток HL-60 при взаимодействии с персистирующими формами Escherichia coli

Введение

Одной из самых актуальных проблем современной медицинской науки является прогрессирующая устойчивость бактерий к антимикробным препаратам. Известно несколько механизмов, позволяющих бактериям выживать в присутствии антибиотиков. До недавнего времени считалось, что существует пять типов механизмов резистентности: модификация мишени, инактивация антибиотика, активное выведение антибиотика из микробной клетки (эффлюкс), нарушение проницаемости внешних структур микробной клетки, формирование метаболического «шунта» [1]. Сейчас этот перечень дополняют еще двумя механизмами резистентности, к которым относятся биопленочная резистентность [2] и формирование особых форм бактериальных клеток — персистеров, или персистирующих бактерий [3]. Персистеры (персистирующие бактерии) — это метаболически неактивные формы бактерий, которые толерантны к антибиотикам [4].

В настоящее время над исследованием персистирующих бактериальных клеток работает значительное количество научных коллективов: в 2018 г., по данным PubMed, было опубликовано более 150 научных работ, касающихся изучения персистирующих бактерий. Физиология их исследована достаточно детально. Изучены процессы формирования персистеров [3, 5], расшифрованы механизмы их обратной трансформации в нормально функционирующую бактерию [6]. Разработаны способы накопления персистеров — удалось добиться того, что в бактериальной популяции присутствует 80–90% персистеров [7–9]. Исследованы особенности «замороженного» метаболизма этих форм, расшифрованы молекулярные основы устойчивости таких бактерий к антибиотикам [10, 11]. Изучены особенности поверхностных структур персистеров [12]. Предложены методы морфологического и функционального исследования бактерий-персистеров [13]. Однако остаются неясными вопросы, касающиеся вирулентности персистеров и особенностей их взаимоотношений с клеточными и тканевыми структурами организма человека. В частности, исследование взаимоотношений персистеров с иммунной системой является крайне актуальной задачей современной биомедицинской науки. Очень важно понимание механизмов реакций между наиболее значимыми иммунными эффекторами человека — нейтрофилами и персистирующими бактериями. К настоящему моменту исследована только одна сторона этого явления — фагоцит-индуцированное формирование персистеров [14]. Другая сторона, а именно вопрос, как фагоциты реагируют на бактерии-персистеры, остается неизученной.

Цель настоящей работы — сравнить реактивность нейтрофилоподобных клеток HL-60 при взаимодействии с персистерами и нативными клетками актуального оппортунистического патогена Escherichia coli, используя в качестве критерия интенсивность респираторного взрыва.

Материалы и методы

Получение бактерий-персистеров. Клетки-пер­сис­теры получали по общепринятой методике культивирования бактерий. В нашем исследовании использовали референсные штаммы E. coli ATCC 25922 в среде с добавлением 200 мкг/мл карбонил цианид 3-хлорфенилгидразона (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazine, CCCP) [15]. Суточную культуру бактерий вносили в бульон Луриа–Бертани (бульон LB; Becton Dickinson, США) до получения мутности 0,5 ед. по шкале МакФарланда, затем 0,5 мл полученной суспензии переносили в 5 мл бульона LB и инкубировали 18 ч при 37°C. Из 18-часовой культуры отбирали три пробы объемом 0,98 мл.

Обработка проб включала два этапа. На первом этапе в 1-ю пробу вносили 0,02 мл CCCP (Sigma-Aldrich, США), растворенного в диметилсульфоксиде — dimethyl sulfoxide, DMSO (Molegular Probes, США) в концентрации 10 мг/мл, во 2-ю и 3-ю пробы — по 0,02 мл DMSO. Пробы инкубировали в шейкере при 37°C в течение 3 ч, затем дважды отмывали в физрастворе и ресуспендировали в 0,2 мл бульона LB.

На втором этапе к 1-й и 2-й пробам добавляли 0,2 мл бульона LB с ципрофлоксацином («Синтез», Россия) в концентрации 10 мкг/мл, к 3-й пробе — 0,2 мл бульона LB без антибиотика. Инкубацию выполняли при условиях, описанных в 1-м этапе. Пробы дважды отмывали и ресуспендировали в 1 мл буфера HEPES (Sigma-Aldrich). Для подтверждения наличия в 1-й пробе бактерий-персистеров без примеси нативных бактерий делали контрольные высевы из пробы до и после инкубации с ципрофлоксацином. По 0,02 мл 100-кратных разведений пробы рассевали на чашки с агаром Мюллера–Хинтона (Bio-Rad Laboratories, США). Чашки инкубировали в течение 24 ч при 37°C, затем проводили подсчет колониеобразующих единиц (КОЕ). Критерием наличия персистеров служил рост примерно одинакового числа КОЕ в пробах до и после инкубации с ципрофлоксацином [15]. После инкубации выполняли стандартизацию концентрации бактериальных клеток на проточном цитофлюори­метре NovoCyte (ACEA Biosciences, США). Анализ полученных данных о популяции бактериальных клеток осуществляли при помощи программного обеспечения NovoExpress software. Для каждого образца анализировали минимум 1·10⁶/мл бактериальных клеток. Количественное определение исследуемых бактерий проводили без применения флюоресцентных красителей, измеряя прямое светорассеивание и боковое светорассеяние каждой бактериальной клетки.

Получение фагоцитирующих клеток: культивирование и дифференцировка клеточной линии HL-60. В качестве источника фагоцитирующих нейтрофилоподобных клеток использовали промиелоцитарную линию клеток HL-60 (ATCC CCL-240), находящихся на стадии развития миелобласта. Для создания среды культивирования к минимальной питательной среде (IMDM) добавляли фетальную бычью сыворотку (HI FBS; Gibco, США) до конечной концентрации 20%, L-глутамин (Glutamax; Gibco) до конечной концентрации 1% и пенициллин-стрептомицин (Pen Strep; Gibco) до конечной концентрации 1%. Клеточную линию выращивали до уровня
(5–8)·10⁵ кл./мл в полной среде и пересевали каждые 3–4 дня путем центрифугирования при 1500 об./мин в течение 5 мин. Для запуска дифференцировки доводили концентрацию культуры клеток до плотности 3·10⁵ кл./мл и инкубировали в течение ночи, чтобы получить популяцию экспоненциально растущей культуры клеток. Затем доводили экспоненциально растущие клетки до плотности 3·10⁵ кл./мл в полной питательной среде, дополненной до конечной концентрации 1,25% DMSO с целью индукции дифференцировки и созревания нейтрофилоподобных клеток в течение 5 дней. После 5 дней дифференцировки HL-60 отмывали центрифугированием при 1500 об./мин в течение 5 мин, отбирали супернатант и отмывали клеточную взвесь центрифугированием при тех же условиях в HEPES-буфере, обогащенном Ca²⁺ и человеческим сывороточным альбумином. После такой промывки клетки разводили в этом же буфере, оценивали их жизнеспособность и осуществляли подсчет при помощи клеточного счетчика с использованием трипанового синего. После подсчета культуры клеток для достижения реакции респираторного взрыва HL-60 доводили до концентрации 1·10⁶/мл в полном HEPES-буфере.

Оценка респираторного взрыва. Для оценки респираторного взрыва нейтрофилоподобных клеток HL-60 в реакции с нативными клетками E. сoli и E. coli-персистерами (соотношение бактерии/фагоциты — 40/1) использовали известный метод, основанный на флюоресценции окисленных форм красителя Amplex Red (Molecular Probes, США). В качестве положительного контроля реакции использовали форбол-12-миристат-13-ацетат, а в качестве отрицательного — HEPES-буфер. Результаты выражали в процентах относительно показателей стимуляции (средний угол наклона кривой за 30 мин реакции) нейтрофилоподобных клеток HL-60 форбол-12-миристат-13-ацетатом. Количественную оценку респираторного взрыва проводили на микропланшетном ридере Infinite M200 (Tecan Group Ltd., Швейцария). Кинетическое определение флюоресценции респираторного взрыва между изучаемыми микроорганизмами и эффекторными клетками осуществляли в течение 40 мин с детекцией флюоресценции каждую минуту в течение 40 циклов, при возбуждении 545 нм и излучении 590 нм. Все эксперименты были выполнены в 4–6 повторениях, все пробы были включены в эксперимент в триплетах.

Полученная информация была статистически обработана при помощи штатного программного обеспечения, управляющего работой ридера Infinite M200.

Результаты и обсуждение

Количество жизнеспособных бактерий в пробах до и после инкубации с ципрофлоксацином было примерно одинаковым и составляло 3,3·10⁵ и 3,2·10⁵ КОЕ/мл соответственно (p>0,05). Согласно критериям L. Grassi и соавт. [15], такие результаты свидетельствуют о том, что 1-я проба после обработки ципрофлоксацином содержала преимущественно клетки E. сoli в форме персистеров.

Динамика типовой реакции респираторного взрыва нейтрофилоподобных клеток HL-60 при взаимодействии с разными формами (персистерами и нативными бактериями) E. сoli показана на рисунке. Количественные показатели активации респираторного взрыва нейтрофилоподобных клеток HL-60 при взаимодействии с разными формами (персистерами и нативными бактериями) E. сoli представлены в таблице. Нативные клетки E. сoli вызывали статистически значимое ускорение окисления флюоро­фора Amplex Red в системе с нейтрофилоподобными клетками: угол наклона кривой составлял более 14% от значений положительного контроля (в негативном контроле — 6±3%). Скорость окисления Amplex Red в системе «E. сoli-персистеры–нейтрофилоподобные клетки» была существенно выше, чем это наблюдалось с нативными E. сoli, и составляла 42±7% от положительного контроля.

Примеры динамики типовой реакции респираторного взрыва у ней­тро­филоподобных клеток HL-60 при взаимодействии с нативными бактериями E. сoli (3) и персистерами E. сoli (4). Положительный контроль (5) — стимуляция форбол-12-миристат-13-ацетатом; отрицательный контроль — HEPES-буфер (2). Нестимулированные нейтрофилоподобные клетки HL-60 (1)

Показатели активации респираторного взрыва нейтрофилоподобных клеток HL-60 при взаимодействии с нативными бактериями и персистерами (средний угол наклона кривой за 30 мин реакции)

Результаты показали, что и нативные бактерии E. сoli, и E. сoli-персистеры обладают способностью активировать респираторный метаболизм фагоцитов. Однако нейтрофилоподобные клетки отвечали на контакт с бактериями-персистерами E. сoli более интенсивно, чем в случае взаимодействия с нативными бактериями. Это может быть связано со сниженным метаболическим профилем персистеров [8]. Угнетение метаболизма неизбежно ведет к замедлению всех энергозависимых реакций бактериальной клетки, включая механизмы ускользания от иммунных эффекторов. Нативные бактерии с нормальным воспроизводством энергии сохраняют и проявляют антифагоцитарные свойства, снижая фагоцитоз и респираторный взрыв нейтрофилов. Это доказано для всех бактерий, обладающих патогенным потенциалом [16]. Клетки E. сoli не являются исключением, реализация вирулентности у них служит энергозависимым процессом, блокада которого приводит к угнетению антифагоцитарной защиты [17]. Обнаруженная закономерность внушает оптимизм: бактерии-персистеры не являются неуязвимыми и могут быть элиминированы за счет фагоцитарных реакций.

Заключение

Полученные результаты позволяют сделать несколько важных выводов. Во-первых, бактерии-персистеры E. сoli могут стимулировать респираторный метаболизм фагоцитирующих нейтрофилоподобных клеток линии HL-60. Во-вторых, способность персистеров E. сoli стимулировать респираторный взрыв нейтрофилов выражена существенно сильнее, чем у нативных бактерий E. сoli. Это свидетельствует о том, что важнейшие эффекторы иммунитета, нейтрофилы, способны распознавать персистеры E. сoli и атаковать их.

Финансирование исследования. Работа вы­полнена при финансовой поддержке Рос­сийского фонда фундаментальных исследований (проект №18-015-00301 «Реактивность нейтрофилов при взаимодействии с грамотрицательными бактериями-персистерами»).

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов.