Секвенирование участка VP1–2A генома для субтипирования вируса гепатита A

А.А. Залесских, Т.Н. Быстрова

Ключевые слова: гепатит А; генотипирование; секвенирование.

Цель исследования — совершенствование методики секвенирования участка VP1–2A генома для молекулярно-генетического типирования вируса гепатита А.

Материалы и методы. Экстракцию нуклеиновых кислот проводили с помощью коммерческих наборов выделения нуклеиновых кислот и обратной транскрипции в ручном и автоматическом вариантах. Подбор последовательностей праймеров осуществляли с помощью программного обеспечения DNASTAR. Олигонуклеотиды синтезировали амидофосфитным методом с последующей очисткой электрофорезом в полиакриламидном геле. Искомые фрагменты генома получены методом ПЦР. Для приготовления реакционной смеси использовали коммерческие компоненты. Учет результатов проводили методом электрофореза в агарозном геле с окрашиванием ДНК бромидом этидия. Фрагменты ДНК после амплификации очищали методом адсорбции на колонках с диоксидом кремния. Определение последовательности очищенных фрагментов выполняли методом секвенирования по Сэнгеру. Полученные последовательности фрагмента VP1–2A анализировали в программном пакете MEGA 6. Оптимизированная методика секвенирования участка VP1–2A генома возбудителя апробирована на 171 образце клинического материала и проб внешней среды, содержащих РНК вируса гепатита А.

Результаты. Методика секвенирования оптимизирована на этапе амплификации вариабельного участка VP1–2A структурной части генома возбудителя, для чего были созданы авторские последовательности праймеров и подобраны условия полимеразной реакции (длина, локализация и температура отжига, концентрация праймеров и матрицы). Искомый фрагмент длиной 249 пар нуклеотидов находился в регионе 2988—3237 пар нуклеотидов согласно референсному штамму HM175. С помощью оптимизированной методики секвенирования фрагмента VP1–2A генома возбудителя в Н. Новгороде за период 2000–2017 гг. в 76 пробах из 171 образца, содержащего РНК возбудителя, установлен генотип вируса гепатита А. Выявлено преобладание возбудителя субтипа IA — 97% (74 из 76 образцов), и только 2 образца принадлежали субтипу IB.

Заключение. Оптимизированная методика секвенирования на этапе амплификации участка VP1–2A генома вируса гепатита А позволяет определять генотипическую структуру циркулирующих штаммов вируса, идентифицировать завозные штаммы возбудителя и устанавливать эпидемиологическую связь между различными случаями заболевания.

Введение

Гепатит А продолжает оставаться самой частой причиной вирусного гепатита. В течение последних двух лет в странах Западной Европы, традиционно относящихся к низкоэндемичным территориям, зарегистрировано более 25 тыс. случаев этого заболевания [1–3].

В России гепатит А также относят к инфекциям, имеющим большое социально-экономическое значение. Уровень официально регистрируемой заболеваемости в стране колебался в течение последних 10 лет в значительных пределах от — 4,29 до 37,9 на 100 тыс. населения. В 2017 г. по сравнению с 2016 г. выросло на 20% число очагов групповой заболеваемости [4–7]. Сохраняются выраженные различия показателя инцидентности в субъектах страны: в ряде регионов заболеваемость гепатитом А превысила среднероссийский показатель в 1,5–4 раза. Эта инфекция в последнее десятилетие стойко занимает второе место после хронического гепатита С по величине экономического ущерба среди вирусных гепатитов. В 2017 г. он составил более 1 млрд. рублей [5, 7–9].

Молекулярно-генетические методы исследования, включая определение разнообразия геновариантов возбудителя, являются теоретической базой изучения особенностей проявления эпидемического процесса гепатита А и механизмов его регуляции. Развитие молекулярно-генетических технологий в последние десятилетия позволило не только изучать изменчивость возбудителя инфекции, но и существенно поднять уровень эпидемиологической диагностики при работе в эпидемических очагах за счет более точного определения источников инфекции, путей и факторов передачи вируса гепатита А, установления эпидемиологической связи между различными случаями инфицирования. Вместе с тем в России имеются лишь единичные работы о генотипической структуре вируса гепатита А, циркулирующего на различных территориях страны. Проведение исследований затруднено в связи с отсутствием коммерческих наборов реагентов для генотипирования.

Генетическую изменчивость возбудителя чаще всего исследуют с помощью метода секвенирования, для чего выполняется амплификация искомого фрагмента генома вируса. Для проведения реакции применяются собственные или описанные в литературе последовательности праймеров и условия реакции, эффективность которых варьирует в широких пределах [10–15].

Материалы и методы

Экстракцию нуклеиновых кислот и обратную транскрипцию РНК в комплементарную ДНК проводили с помощью коммерческих наборов выделения нуклеиновых кислот и обратной транскрипции в ручном и автоматическом вариантах с применением роботизированной станции (Xiril, Швейцария).

Подбор последовательностей праймеров осуществляли с помощью программы PrimerSelect программного пакета DNASTAR (США). Олигонуклеотиды синтезированы амидофосфитным методом с последующей очисткой электрофорезом в полиакриламидном геле («Синтол», Россия).

Для приготовления ПЦР использовали коммерческие компоненты («Интерлабсервис», Россия): буфер для ПЦР (концентрация MgCl₂ — 15 мкмоль/л); смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов (концентрации каждого — 1,74 мкмоль/л); Taq-полимеразу (активностью 5 ед./мкл). Реакцию амплификации проводили с помощью амплификатора Maxygene Therm-1000 (Axygen, США).

Электрофорез продуктов ПЦР выполняли в 1,5% агарозном геле с окрашиванием ДНК бромидом этидия и фиксированием результатов в системе гель-документации G:Box F3 (Syngene, США).

Фрагменты ДНК после амплификации очищали методом адсорбции на колонках с диоксидом кремния с помощью набора для очистки смесей для ПЦР (Qiagen, США). Определение последовательности очищенных фрагментов проводили на генетическом секвенаторе ABI PRISM 3100 (Applied Biosystems, США) согласно инструкции производителя.

Полученные последовательности фрагмента VP1–2A анализировали в программном пакете MEGA 6, а также с помощью онлайн-сервисов BLAST (NCBI, США), Hepatitis A virus genotyping tool (RIVM, Нидерланды, http://www.rivm.nl/mpf/typingtool/hav/introduction).

Оптимизированная методика секвенирования участка VP1–2A генома возбудителя апробирована на 171 образце клинического материала и проб внешней среды, содержащих РНК вируса гепатита А. В процессе исследования использовали клинический материал от больных гепатитом А и концентраты сточных вод, отобранных в Н. Новгороде за период 2000–2017 гг.

Результаты и обсуждение

В качестве цели для секвенирования был выбран участок VP1–2A структурной части генома вируса гепатита А, обладающий достаточно высокой вариабельностью относительно других регионов генома. В библиотеке NCBI Genbank накоплено большое число охарактеризованных по данному участку изолятов вируса, выделенных в разных странах [16, 17].

Для оптимизации методики секвенирования на этапе амплификации искомого участка применяли авторские праймеры, созданные на основе последовательностей, использованных B.H. Robertson и соавт. в исследованиях по открытию генотипов вируса гепатита А [18]. Модификацию осуществляли с целью сближения температуры плавления олигонуклеотидов, для минимизации вероятности появления шпилек и праймер-димеров. Необходимые параметры достигнуты путем изменения длины праймеров и локализации их отжига с помощью программного обеспечения DNASTAR, что позволило существенно повысить эффективность амплификации по сравнению с прототипными олигонуклеотидами. Последовательность праймеров указана в таблице.

Последовательность праймеров для амплификации участка VP1–2A генома вируса гепатита А

Длина искомого фрагмента амплификации составляла 249 пар нуклеотидов (см. рисунок). Реакционная смесь включала в себя следующие компоненты: 5 мкл буфера для ПЦР; 2,5 мкл смеси дезоксинуклеозидтрифосфатов; по 2,5 мкл прямого и обратного праймеров (концентрации — 3 мкмоль/л каждого); 0,25 мкл Taq-полимеразы; 2,25 мкл деионизованной воды. Общий объем смеси составил 25 мкл, включая 10 мкл комплементарной ДНК исследуемого образца.

Электрофореграмма амплифицированных фрагментов VP1–2A генома вируса гепатита А длиной 249 пар нуклеотидов (п. н.), левый ряд — маркер молекулярной массы

При амплификации использовали следующую программу для термоциклера: 95°С — 5 мин; затем 42 цикла (95°С — 10 с; 53,5°С — 10 с; 72°С — 10 с), заключительная элонгация: 72°C — 1 мин. Температуру отжига праймеров (53,5°С) подбирали экспериментально для достижения максимального выхода специфического продукта реакции, количество которого учитывалось с помощью электрофореза.

Вариабельный фрагмент генома VP1–2A вируса гепатита А был получен в 76 образцах из 171, положительных на РНК возбудителя. Можно предположить, что такой результат связан с низкой концентрацией РНК в пробах и разной чувствительностью тест-системы для определения РНК и описанной методики, что требует дальнейшего исследования.

После амплификации образцы очищали от продуктов реакции, а затем проводили определение последовательности полученных фрагментов на автоматическом секвенаторе. Полученные последовательности VP1–2A выравнивали между собой и анализировали на гомологию с депонированными в Genbank изолятами вируса гепатита А различного географического происхождения в программном пакете MEGA 6.

Впервые с помощью оптимизированной методики секвенирования фрагмента VP1–2A генома возбудителя показана исключительная циркуляция в период 2000–2017 гг. среди населения Н. Новгорода I генотипа вируса гепатита А. Установлено, что субтип IA преобладал в 97% (74 образца из 76), и только 2 образца принадлежали субтипу IB.

Филогенетический анализ показал, что гомология всех изолятов вируса гепатита А субтипа IA составляла 93% (за 100% принимается полная идентичность изолятов) и выше с последовательностями, выделенными в европейской части России и образующими единый филогенетический кластер. Это согласуется с данными публикаций о циркулирующих в европейской части России геновариантах вируса гепатита А [13, 19]. Обнаруженные штаммы субтипа IB имели максимальную гомологию с изолятами, выделенными в Египте и Болгарии, что указывает на вероятные завозные случаи инфекции из стран Средиземноморья [20].

Заключение

Оптимизированная методика секвенирования на этапе амплификации участка VP1–2A генома вируса гепатита А позволила впервые определить генотипическую структуру циркулирующих штаммов этого вируса в Н. Новгороде в 2000–2017 гг. и может использоваться для слежения за циркуляцией и изменчивостью вируса гепатита А, для расследования групповых заболеваний, установления эпидемиологической связи между различными случаями заболевания и идентификации завозных штаммов возбудителя.

Финансирование исследования. Работа выполнена по государственному заданию в рамках утвержденной темы НИР ФБУН ННИИЭМ им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора.

Конфликт интересов отсутствует.

Литература

Vaz J., Floyd C., Mason B., Shankar A.G., Lewis H. Control of a community outbreak of hepatitis A in an area of low endemicity, Wales, 2016. Hum Vaccin Immunother 2017; 13(10): 2352–2356, https://doi.org/10.1080/21645515.2017.1347242.
Michaelis K., Wenzel J.J., Stark K., Faber M. Hepatitis A virus infections and outbreaks in asylum seekers arriving to Germany, September 2015 to March 2016. Emerg Microbes Infect 2017; 6(4): e26, https://doi.org/10.1038/emi.2017.11.
Gallone M.F., Desiante F., Gallone M.S., Barbuti G., Tafuri S., Germinario C. Serosurveillance of hepatitis A in a region which adopted the universal mass vaccination. Medicine (Baltimore) 2017; 96(9): e5884, https://doi.org/10.1097/md.0000000000005884.
Гепатит А: этиология, эпидемиология, диагностика, профилактика. Под ред. В.В. Шкарина. Н. Новгород: НижГМА; 2015.
Вирусные гепатиты в Российской Федерации: аналитический обзор. Под ред. Покровского В.И., Тотоляна А.А. СПб: ФБУН НИИЭМ им. Пастера; 2016.
Кареткина Г.Н. Вирусный гепатит А в прошлом, настоящем и будущем. Инфекционные болезни: новости, мнения, обучение 2014; 3(8): 38–48.
Мукомолов С.Л., Михайлов М.И., Семененко Т.А., Селькова Е.П., Герасимова И.Е. Бремя гепатита А в Российской Федерации: научный обзор. Эпидемиология и вакцинопрофилактика 2014; 6(79): 24–34.
Чернов А.В., Брусенская Т.Ю., Корчагин В.В. Анализ заболеваемости острыми вирусными гепатитами по Воронежской области. Территория инноваций 2017; 4(8): 117–120.
WHO position paper on hepatitis A vaccines. Wkly Epidemiol Rec 2012; 87(28/29): 261–276. URL: http://www.who.int/wer/2012/wer8728_29/en/.
Карандашова И.В., Пименов Н.Н., Неверов А.Д., Михайловская Г.В., Долгин В.А., Браславская С.И., Комарова С.В., Лыткина И.Н., Шулакова Н.И., Шипулин Г.А., Чуланов В.П. Молекулярно-эпидемиологические особенности вспышки гепатита А в Москве. Эпидемиология и инфекционные болезни. Актуальные вопросы 2012; 3: 9–14.
Bondarenko T.Y., Ternovoi V.A., Netesov S.V. Hepatitis a virus: structure-functional features of genome, molecular diagnostics, and cultivation. Molecular Genetics, Microbiology and Virology 2013; 28(3): 99–109, https://doi.org/10.3103/s0891416813030038.
Мукомолов C.Л., Калинина О.В. Молекулярная эпидемиология вирусных гепатитов. Мир вирусных гепатитов 2003; 11: 2–7.
Чуланов В.П., Карандашова И.В., Пименов Н.Н., Молочный В.П., Томилка Г.С., Слепцова С.С., Семенова В.К., Малый В.П., Бойко В.В., Камолов Б.Д., Волчкова Е.В. Клиническое значение генетического разнообразия вируса гепатита А. Эпидемиология и инфекционные болезни 2014; 19(4): 12–17.
Nainan O.V., Xia G., Vaughan G., Margolis H.S. Diagnosis of hepatitis A virus infection: a molecular approach. Clin Microbiol Rev 2006; 9(1): 63–79, https://doi.org/10.1128/cmr.19.1.63-79.2006.
Vaughan G., Goncalves Rossi L.M., Forbi J.C., de Paula V.S., Purdy M.A., Xia G., Khudyakov Y.E. Hepatitis A virus: host interactions, molecular epidemiology and evolution. Infect Genet Evol 2014; 21: 227–243, https://doi.org/10.1016/j.meegid.2013.10.023.
Costa-Mattioli M., Di Napoli A., Ferré V., Billaudel S., Perez-Bercoff R., Cristina J. Genetic variability of hepatitis A virus. J Gen Virol 2003; 84(Pt 12): 3191–3201, https://doi.org/10.1099/vir.0.19532-0.
Sánchez G., Bosch A., Pintó R.M. Genome variability and capsid structural constraints of hepatitis A virus. J Virol 2003; 77(1): 452–459, https://doi.org/10.1128/jvi.77.1.452-459.2003.
Robertson B.H., Jansen R.W., Khanna B. Genetic relatedness of hepatitis A virus strains recovered from different geographical regions. J Gen Virol 1992; 73 (Pt 6): 1365–1677, https://doi.org/10.1099/0022-1317-73-6-1365.
Mukomolov S., Kontio M., Zheleznova N., Jokinen S., Sinayskaya E., Stalevskaya A., Davidkin I. Increased circulation of hepatitis A virus genotype IIIA over the last decade in St. Petersburg, Russia. J Med Virol 2012; 84(10): 1528–1534, https://doi.org/10.1002/jmv.23378.
Bruni R., Taffon S., Equestre M., Cella E., Lo Presti A., Costantino A., Chionne P., Madonna E., Golkocheva-Markova E., Bankova D., Ciccozzi M., Teoharov P., Ciccaglione A.R. Hepatitis A virus genotypes and strains from an endemic area of Europe, Bulgaria 2012–2014. BMC Infect Dis 2017; 17(1): 497, https://doi.org/10.1186/s12879-017-2596-1.