Новая технология выявления амилоида в тканях человека, основанная на использовании флуоресцентного красителя — аналога Конго красного

Цель исследования — разработка новой технологии выявления амилоида в тканях человека, основанной на использовании флуоресцентного красителя — динатриевой соли 2,7-(1-амино-4-сульфо-2-нафтилазо)флуорена (ДСНАФ).

Материалы и методы. Синтез ДСНАФ осуществляли путем диазотирования 2,7-диаминофлуорена в токе аргона с последующим азосочетанием с нафтионовой кислотой. Идентификацию ДСНАФ проводили при помощи масс-спектрометрии MALDI. Материалом для гистохимического исследования служили образцы миокарда мужчин и женщин (n=11) в возрасте от 85 до 98 лет. Парафиновые срезы миокарда окрашивали 0,1%-м водным раствором Конго красного или водным раствором (0,1%-й или 0,034%-й) ДСНАФ при одинаковых условиях.

Результаты. Впервые показано, что синтезированный на основе флуорена аналог Конго красного может быть успешно использован для выявления амилоидных скоплений на гистологических срезах миокарда человека. По специфичности и интенсивности окрашивания амилоида ДСНАФ сопоставим с Конго красным, который считается «золотым стандартом» выявления амилоида. Интенсивность флуоресценции ДСНАФ при связывании с амилоидными фибриллами существенно выше интенсивности флуоресценции Конго красного (при меньшей интенсивности фоновой флуоресценции мышечной ткани сердца). Это особенно важно для идентификации малых скоплений амилоида в тканях человека, что актуально при исследовании биопсийного материала.

Заключение. Разработанная технология выявления амилоида может служить новым перспективным методом идентификации амилоидных скоплений в тканях человека.

1. Шавловский М.М. Молекулярные и генетические основы этиопатогенеза амилоидозов. Медицинский академический журнал 2010; 10(4): 63–81.
2. Sipe J.D., Benson M.D., Buxbaum J.N., Ikeda S.I., Merlini G., Saraiva M.J., Westermark P. Amyloid fibril proteins and amyloidosis: chemical identification and clinical classification International Society of Amyloidosis 2016 Nomenclature Guidelines. Amyloid 2016; 23(4): 209–213, https://doi.org/10.1080/13506129.2016.1257986.
3. Hassan W., Al-Sergani H., Mourad W., Tabbaa R. Amyloid heart disease. New frontiers and insights in pathophysiology, diagnosis, and management. Tex Heart Inst 2005; 32(2): 178–184.
4. Morais G.C.P., Arruda M.M., Bonadia J.C.A., Pozzan G. Cardiac amyloidosis: a challenging diagnosis. Autops Case Rep 2014; 4(4): 9–17, https://doi.org/10.4322/acr.2014.034.
5. Жданова Е.А., Рамеев В.В., Моисеев С.В., Коз­лов­ская Л.В., Сафарова А.Ф. Амилоидоз сердца. Клиническая фармакология и терапия 2011; 5: 44–50.
6. Ухолкина Г.Б., Кучин Г.А., Бычкова О.П., Чихи­рев О.А. Амилоидоз сердца в клинической практике. Журнал сердечная недостаточность 2016; 17(1): 57–68, https://doi.org/10.18087/rhfj.2016.1.2201.
7. Овчаренко С.И., Сон Е.А., Окишева Е.А., Се­дов В.П., Маколкин В.И. Амилоидоз сердца. Клиницист 2007; 6: 32–38.
8. Нонка Т.Г., Репин А.Н. Возможности диагностики и лечения амилоидоза сердца. Клиническая медицина 2015; 93(4): 66–73.
9. Linke R.P. Congo red staining of amyloid: improvements and practical guide for a more precise diagnosis of amyloid and the different amyloidoses. In: Protein misfolding, aggregation, and conformational diseases. Springer US; 2006; p. 239–276, https://doi.org/10.1007/0-387-25919-8_12.
10. Коржевский Д.Э., Гиляров А.В. Основы гистологической техники. СПб: СпецЛит; 2010.
11. Picken M.M. Amyloidosis — where are we now and where are we heading? Arch Pathol Lab Med 2010; 134(4): 545–551.
12. Clement C.G., Truong L.D. An evaluation of Congo red fluorescence for the diagnosis of amyloidosis. Hum Pathol 2014; 45(8): 1766–1772, https://doi.org/10.1016/j.humpath.2014.04.016.
13. Sapozhnikov S.P., Karyshev P.B., Sheptukhina A.I., Nikolayeva O.V., Avruyskaya A.A., Mitrasov Y.N., Kozlov V.A. Novel fluorescent probes for amyloid detection. Sovremennye tehnologii v medicine 2017; 9(2): 91–98, https://doi.org/10.17691/stm2017.9.2.11.
14. Gusel’nikova V.V., Gudkova A.Ya., Semernin E.N., Grudinin N.A., Krutikov A.N., Shavloskii M.M., Mil’man B.L., Korzhevskii D.E., Mikhailova E.V., Kaminskaya E.V., Mikhailov V.M. Characterization of amyloid deposits found in internal organs of MDX mice. Cell Tiss Biol 2017; 11(1): 27–34, https://doi.org/10.1134/s1990519x17010047.
15. Gusel’nikova V., Antimonova O., Fedorova E., Shavlovsky M., Krutikov A., Mikhailova E., Gudkova A., Mikhailov V., Korzhevskii D. Fluorescent characterization of amyloid deposits in the kidneys of mdx mice. Eur J Histochem 2018; 62(2): 2870, https://doi.org/10.4081/ejh.2018.2870.
16. Gusel’nikova V.V., Antimonova O.I., Fedorova E.A., Shavlovskii M.M., Krutikov A.N., Mikhailova E.V., Kaminskaya E.V., Gudkova A.Ya., Korzhevskii D.E., Mikhailov V.M. Fluorene derivative disodium salt as a new fluorescent dye for identification of amyloid deposits in the myocardium of mdx mice. Cell Tiss Biol 2018; 12(3): 213–216, https://doi.org/10.1134/s1990519x18030057.
17. Grigorev I.P., Korzhevskii D.E. Current technologies for fixation of biological material for immunohistochemical analysis (review). Sovremennye tehnologii v medicine 2018; 10(2): 156–165, https://doi.org/10.17691/stm2018.10.2.19.
18. Антимонова О.И., Коржевский Д.Э., Шавлов­ский М.М. Способ флуоресцентной идентификации амилоида. Патент РФ 2673815. 2018.
19. Коржевский Д.Э., Сухорукова Е.Г. Гистохимические методы окрашивания гистологических препаратов. В кн.: Морфологическая диагностика: подготовка материала для морфологического исследования и электронной мик­ро­скопии. Под ред. Коржевского Д.Э. СПб; 2013; с. 85–97.
20. Cohen A.S., Calkins E., Levene C.I. Studies on experimental amyloidosis. I. Analysis of histology and staining reactions of casein-induced amyloidosis in the rabbit. Am J Pathol 1959; 35: 971–989.
21. Antimonova O.I., Grudinina N.A., Egorova V.V., Ilyina V.V., Zabrodskay Y.A., Ramsay E.S., Shabalin K.A., Protasov A.V., Yakimov A.P., Polukeev V.A., Shavlovsky M.M. Time machine: can a dye from 1928 be re-purposed for modern, fluorescence-based detection of amyloid-like fibrils? Dyes and Pigments 2020; 172: 107863, https://doi.org/10.1016/j.dyepig.2019.107863.
22. Dapson R.W. Amyloid from a histochemical perspective. A review of the structure, properties and types of amyloid, and a proposed staining mechanism for Congo red staining. Biotech Histochem 2018; 93(8): 543–556, https://doi.org/10.1080/10520295.2018.1528385.

Guselnikova V.V., Antimonova O.I., Fedorova E.A., Shavlovsky M.M., Safray A.E., Rukavishnikova A.A., Ilyin V.V., Milman B.L., Korzhevskii D.E. A Novel Method for Amyloid Detection in Human Tissue Load Using a Fluorescent Dye — Congo Red Analogue. Sovremennye tehnologii v medicine 2020; 12(1): 65, https://doi.org/10.17691/stm2020.12.1.08