Белки Tumor M2-пируваткиназа, матричная карбоангидраза IX и металлопротеиназа 9 — новые прогностические маркеры почечно-клеточного рака

З.В. Амоев, А.В. Алясова, Т.Н. Горшкова, Е.И. Самсонова, Е.В. Строкина, К.Н. Конторщикова

Ключевые слова: tumor M2-пируваткиназа; матричная карбоангидраза IX; металлопротеиназа 9; почечно-клеточный рак; маркеры почечно-клеточного рака.

Цель исследования — оценка возможности использования опухолевой M2-пируваткиназы (Тu M2-PK) в плазме, матричной карбоангидразы IX (СА9) и матриксной металлопротеиназы 9 (ММР9) в сыворотке крови у больных почечно-клеточным раком в качестве прогностических признаков течения заболевания и ответа на проводимое лечение.

Материалы и методы. Исследованы образцы плазмы и сыворотки крови 46 больных светлоклеточным раком почки T_1–4N_0–1M_0–1, полученные до оперативного вмешательства и через 8–9 дней после операции. Контрольную группу составили 20 практически здоровых лиц, сопоставимых по возрасту с обследованными больными. Количественное определение метаболического онкомаркера в ЭДТА-плазме крови методом иммуноферментного анализа проводили с помощью набора SheBo Tumor M2-РК (Германия). Определение СА9 методом иммуноферментного анализа выполняли с помощью набора Human Carbonic Anhydrase IX Quantikine ELISA Kit (США), а ММР9 — набора Quantikine ELISA Kit (США).

Результаты. У больных почечно-клеточным раком в образцах крови выявлено статистически значимое повышение уровня Tu M2-PK, СА9 и статистически значимое снижение ММР9 по сравнению с группой здоровых лиц. Уровень Tu M2-PK у больных локализованными формами рака почки статистически значимо ниже, чем у больных диссеминированным раком. Увеличение размера первичной опухоли и снижение степени дифференцировки рака сопровождается возрастанием уровня Tu M2-PK в плазме, снижением содержания СА9 и ММР9 в сыворотке крови больных. Выполнение оперативного вмешательства в объеме нефрэктомии в ранние сроки после операции не влияет на содержание в плазме Tu M2-PK, но сопровождается снижением уровней СА9 и ММР9 в сыворотке крови больных.

Заключение. Результаты проведенных исследований указывают на потенциальное значение Tu M2-PK, CA9, ММР9 как возможных биологических маркеров для прогнозирования течения заболевания у больных почечно-клеточным раком.

Введение

Сложности ранней диагностики почечно-клеточного рака (ПКР) и прогнозирования развития диссеминированных форм заболевания обусловливают необходимость поиска новых прогностических маркеров [1]. Одним из них является онкомаркер опухолевая М2-пируваткиназа (Tu M2-РК), относящийся к классу метаболических опухолевых маркеров. Повышенные его уровни выявлены у пациентов со злокачественными опухолями желудочно-кишечного тракта, почек, c раком молочной железы, легких [2–4].

Матричная карбоангидраза IX (СА9) — трансмембранный гликопротеин, относящийся к карбоангидразной группе ферментов, которые играют важную роль в регуляции избыточного выделения протонов в клетке и таким образом контролируют рН [5, 6]. Экспрессия СА9 выявляется почти во всех типах опухолей (при раке шейки матки, пищевода, легких, молочной железы, головного мозга, вульвы). В последние годы в литературе встречаются исследования прогностического и предиктивного значения экспрессии СА9 опухолевыми клетками при светлоклеточном ПКР [7, 8]. Однако подробного исследования содержания СА9 в сыворотке крови больных ПКР и его изменений не представлено.

Матриксные металлопротеиназы (ММР) — семейство эндопептидаз, которые встречаются на разных этапах развития опухоли и задействованы в механизмах, позволяющих малигнизированным клеткам избегать иммунного надзора и апоптоза [9, 10]. Высокий уровень экспрессии ММР9 выявлен в клетках опухоли при раке легкого, мочевого пузыря, шейки матки, прямой кишки, простаты, почки, при карциноме эндометрия [10–12]. При всем сказанном мы не обнаружили в доступной литературе исследований, посвященных выявлению связи названных белков в сыворотке крови больных ПКР с клинико-морфологическими особенностями течения заболевания, а также ответом на проводимое лечение.

Целью исследования явилась оценка возможности использования опухолевой M2-пируваткиназы (Тu M2-PK) в плазме, матричной карбоангидразы IX (СА9) и матриксной металлопротеиназы 9 (ММР9) в сыворотке крови у больных почечно-клеточным раком в качестве прогностических признаков течения заболевания и ответа на проводимое лечение.

Материалы и методы

Исследование выполнено на образцах плазмы и сыворотки крови 46 больных светлоклеточным раком почки T_1–4N_0–1M_0–1 (средний возраст — 58,3 года), полученных до проведения оперативного вмешательства и через 8–9 дней после операции. У 33% больных (15/46) новообразование почки соответствало T₁, у 26% (12/46) — T₂, у 28% (13/46) — T₃, у 13% (6/46) — Т₄. Локализованная форма заболевания (T_1–3N₀M₀) выявлена у 46% пациентов (21/46), диссеминированная — у 54% (25/46).

Объемы диагностики и лечения больных раком почки соответствовали рекомендуемым алгоритмам по диагностике и лечению злокачественных новообразований, утвержденным Минздравом России. Диагноз светлоклеточного рака почки у всех пациентов подтвержден гистологическим исследованием. Cтепень дифференцировки опухоли по Fuhrman: градация I — 20% (9/46) пациентов, градация II — 26% (12/46), градация III — 54% (25/46). Всем больным была выполнена нефрэктомия. В качестве контроля использовали образцы плазмы и сыворотки крови 20 практически здоровых лиц, сопоставимых по возрасту с обследованными больными.

Исследование проведено в соответствии с Хельсинкской декларацией (2013) и одобрено Этическим комитетом Приволжского медицинского исследовательского университета. От каждого пациента получено информированное согласие.

Количественное определение метаболического онкомаркера — Tu M2-РК в ЭДТА-плазме крови методом иммуноферментного анализа выполняли с помощью набора ScheBo Tumor M2-РК (ScheBo Biotech AG, Германия). Для определения СА9 в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа применяли набор Human Carbonic Anhydrase IX Quantikine ELISA Kit (R&D Systems, США), а для определения ММР9 — набор Quantikine ELISA Kit (R&D Systems).

Статистическую обработку проводили с помощью пакета программ Statistica 6.0. Для проверки гипотезы о соответствии распределения полученных вариантов нормальному распределению применяли критерий Шапиро–Уилка. Результаты представлены в виде М±σ, где М — среднее значение, а σ — среднее квадратичное отклонение. Для оценки существенности различий двух выборок использовали критерий Стьюдента. Различия считались статистически значимыми при р<0,05. Вычисление значимости различий долей проводили по методу углового преобразования Фишера.

Результаты и обсуждение

Результаты исследования показали, что у больных ПКР в образцах крови наблюдается статистически значимое повышение уровня Tu M2-PK, СА9 и статистически значимое снижение содержания ММР9 по сравнению с группой здоровых лиц (рис. 1).

Рис. 1. Содержание Tu M2-PK, СА9 и ММР9 в образцах крови больных раком почки и здоровых лиц

* — различия статистически значимы при сравнении с контролем (р<0,05)

Повышение уровня метаболического онкомаркера Tu M2-PK в плазме может быть связано с отличиями метаболизма клеток опухолей и их ускоренной пролиферацией по сравнению с нормальными клетками. Повышение концентрации СА9 в сыворотке крови может быть обусловлено тем, что одним из механизмов, лежащих в основе ее гиперэкспрессии в опухолевых тканях, является гипоксия. В условиях гипоксии ген СА9 индуцируется его регулятором транскрипции — гипоксия-индуцируемым фактором (HIF-1). Карбоангидраза IX способствует локальному повышению кислотности клетками опухоли, что приводит к росту опухоли и метастазам. Другой механизм, регулирующий повышенную экспрессию СА9 в тканях опухоли, — потеря опухолесупрессирующего гена Гиппеля–Линдау (VHL). Мутации гена VHL могут приводить к гиперэкспрессии СА9 в опухолевых клеточных линиях. Согласно данным работы [7], высокая экспрессия СА9 связана с благоприятным прогнозом при локализованном и метастатическом ПКР и хорошей безрецидивной выживаемостью. По мнению M.H. Bui с соавт. [13], высокая экспрессия CA9 предполагает лучшую выживаемость даже после учета таких факторов, как Т-стадия, шкала Fuhrman и общее состояние пациента (р≤0,005).

Металлопротеиназы в литературе рассматриваются в качестве критических молекул, «ассистирующих» опухолевым клеткам на протяжении всего процесса метастазирования [9]. Являясь ключевыми ферментами метаболизма компонентов соединительной ткани, они участвуют в различных патологических процессах, требующих пролиферации, миграции клеток и перестройки внеклеточного матрикса. Статистически значимое снижение уровня ММР9 в сыворотке крови у больных раком почки по сравнению с группой контроля может быть связано с повышенной утилизацией ММР9 вследствие усиления ремоделирования ткани, мобилизации матрикс-связанных факторов роста и процессинга цитокинов, сопровождающих опухолевый процесс. Кроме того, некоторые авторы считают ММР9 критическим причинным фактором (триггером) опухоль-индуцированного ангиогенеза [14].

Мы посчитали целесообразным проанализировать содержание Tu M2-PK, СА9 и ММР9 в образцах крови больных локальными и диссеминированной формами заболевания (рис. 2), а также изменение их уровня в зависимости от размеров первичной опухоли (рис. 3).

Рис. 2. Содержание Тu M2-PK, СА9 и ММР9 у больных локализованным и диссеминированным раком почки

* — различия статистически значимы при сравнении с контролем (р<0,05); ⁺ — при сравнении с группой локализованных опухолей (р<0,05)

Рис. 3. Содержание Тu M2-PK, СА9 и ММР9 в образцах крови больных раком почки с различными размерами первичной опухоли

* — различия статистически значимы пр сравнении с контролем (р<0,05); ⁺ — при сравнении с опухолями рТ₁ (р<0,05)

У больных локализованным раком почки уровень Tu M2-PK в плазме статистически значимо превышал норму, что может быть связано с нарушением клеточного метаболизма при опухолевом росте, но при этом был статистически значимо ниже (в 3,2 раза), чем у больных диссеминированным раком почки. Концентрация СА9 при обеих формах рака статистически значимо не отличалась и оставалась достоверно выше соответствующего значения у здоровых лиц. Содержание ММР9 в сыворотке крови больных обеих групп статистически значимо не отличалось, оставаясь достоверно ниже контроля.

При увеличении размеров первичной опухоли до рТ₄ наблюдалось статистически значимое повышение уровня Tu M2-PK в плазме не только по сравнению с содержанием онкомаркера в группе здоровых лиц, но и по сравнению с его значением у пациентов, имеющих опухоль рТ₁ (р<0,05). Другие исследователи [4] также отмечали повышение уровня данного белка уже при I стадии и выявляли возрастание чувствительности маркера с увеличением стадийности заболевания. Концентрация СА9 в сыворотке крови больных с опухолями рТ₁–Т₃ статистически значимо превышала нормальный уровень, однако у пациентов, имевших опухоли рТ₄, она не отличалась от нормы и была ниже, чем в группе больных с опухолями рТ₁ (р<0,05). Известно, что потеря экспрессии CA9 является неблагоприятным фактором прогноза и связана с развитием метастазов и рецидива заболевания, а также с низкой безрецидивной выживаемостью [7, 15], причем в большинстве случаев болезнь оказывается метастатической уже на момент диагностики. Действительно, в нашем исследовании у больных с опухолями рТ₄ отдаленные метастазы были выявлены при первичном обследовании пациентов. Увеличение размера первичной опухоли сопровождалось тенденцией к снижению содержания ММР9 в сыворотке крови больных. У лиц, имевших опухоли, классифицированные как рТ₄, содержание ММР9 было в 1,4 раза ниже (р<0,05), чем у пациентов с опухолями рТ₁.

Отмечено статистически значимое возрастание уровня Tu M2-PK в плазме крови по мере снижения степени дифференцировки ПКР (рис. 4), что отражало нарастание метаболических нарушений у пациентов с опухолями, характеризующимися более агрессивным течением. Так, у больных с III степенью дифференцировки уровень Tu M2-PK в плазме крови был в 3,2 выше (р<0,05), чем у больных с опухолями I степени дифференцировки.

Рис. 4. Содержание Тu M2-PK, СА9 и ММР9 в образцах крови больных раком почки с различной степенью дифференцировки опухоли

* — различия статистически значимы при сравнении с контролем (р<0,05); ⁺ — при сравнении с группой, имеющей опухоли I степени злокачественности (р<0,05)

Содержание СА9 в сыворотке, напротив, статистически значимо снижалось по мере потери дифференцировки опухолевыми клетками. У больных с опухолями III степени дифференцировки оно не отличалось от нормы и было в 2,7 раза ниже (р<0,05), чем у лиц с опухолями I степени дифференцировки. Известно, что при понижении степени дифференцировки опухоли снижается и даже полностью теряется экспрессия СА9. В работах Д.В. Щукина и соавт. [16] показана четкая связь экспрессии CA9 со степенью дифференцировки опухоли (градацией Fuhrman), однако другие исследователи отрицают существование такой зависимости [8]. По мнению ряда авторов [10, 15], низкая экспрессия CA9 ассоциируется с низкой канцер-специфической выживаемостью, общей выживаемостью и выживаемостью без прогрессирования.

Концентрация ММР9 в сыворотке крови больных с опухолями низкой степени дифференцировки также статистически значимо снижалась по сравнению не только с нормой, но и с показателями лиц, имевших опухоль I степени дифференцировки. По-видимому, подобные изменения связаны с повышенным расходом белка ММР9 в активно пролиферирующих клетках, который разрушает коллаген IV базальной мембраны и активизирует инвазию опухолевых клеток в подлежащие ткани. В.П. Авдошин и соавт. [17] также наблюдали различия уротелиальных карцином низкой и высокой степени злокачественности по уровню экспрессии MMP9. Необходимо отметить, что полученные данные о снижении концентрации ММP9 в сыворотке крови больных по мере увеличения размеров образования или снижения степени дифференцировки опухоли не соответствуют данным, полученным исследователями, изучавшими экспрессию ММP9 на опухолевых клетках [10]. Несмотря на возрастание пролиферативной активности опухолевых клеток и продукции ММP9, можно предположить, что значительная часть ММP9 используется малигнизированными клетками местно (для разрушения белков базальных мембран, инвазии опухолевых клеток в подлежащие ткани, неоангиогенеза) и не поступает в кровоток.

Исследование уровня Tu M2-PK в плазме крови в послеоперационном периоде не выявило статистически значимой разницы до- и послеоперационных значений маркера, что ранее было отмечено и в работах других исследователей [4]. Индивидуальный анализ показал, что содержание Tu M2-PK стало в 2 раза ниже по сравнению с исходным его уровнем только у 9% пациентов. В остальных случаях концентрация маркера изменялась незначительно или возрастала в 1,5–1,8 раза по сравнению с предоперационным значением. По данным работы [18], после успешной операции уровень Tu M2-PK возвращается к норме в более поздние сроки, чем в нашем исследовании, — в среднем через 11 нед, причем нормализации может предшествовать первоначальное повышение содержания Tu M2-PK в крови.

Концентрация СА9 после операции снижалась в 2,17 раза по сравнению с исходным уровнем (до операции — 134,53±15,29, после операции — 61,78±22,06 пг/мл; р<0,05) и не отличалась от нормы (56,84±11,10 пг/мл). Индивидуальный анализ выявил снижение уровня СА9 в 2,5–5,5 раза у 70% обследованных больных на 8–9-й день после выполнения радикальной операции. Подобные изменения уровня белка в послеоперационном периоде подтверждают существующее предположение [10, 13] о преимущественной продукции СА9 опухолевыми клетками.

Содержание ММР9 после операции не изменялось, оставаясь статистически значимо ниже значений контрольной группы. Индивидуальный анализ выявил, что у всех обследованных больных уровень ММР9 в сыворотке крови на 8–9-й день после хирургического вмешательства имеет тенденцию к снижению, однако выраженное уменьшение количества ММР9 в 1,5–2 раза по сравнению с исходным отмечалось только в 40% случаев.

Таким образом, определение уровня Tu M2-PK в плазме крови больных ПКР позволяет предполагать распространенность и активность опухолевого процесса. Содержание его не меняется в плазме крови больных в ранние сроки после операции.

Уровень CA9 в сыворотке крови больных раком почки достоверно превышает его содержание у здоровых лиц, но статистически значимо ниже у больных с опухолями рТ₄ по сравнению с пациентами, имеющими опухоли меньших размеров, а также у больных с низкодифференцированными опухолями по сравнению с показателями при высокодифференцированных новообразованиях. Сывороточный уровень CA9 статистически значимо уменьшается в послеоперационном периоде.

Концентрация ММР9 в сыворотке крови больных статистически значимо снижается по мере повышения агрессивности опухолевого процесса и не изменяется в раннем послеоперационном периоде.

Заключение

Результаты проведенных исследований убедительно свидетельствуют о потенциальном значении белков Tu M2-PK, CA9, ММР9 как ценных биологических маркеров для прогнозирования течения заболевания у больных почечно-клеточным раком.

Финансирование исследования и конфликт интересов. Исследование не финансировалось какими-либо источниками, и конфликты интересов, связанные с данным исследованием, отсутствуют.

Литература

Переводчикова Н.И., Горбунова В.А. Руководство по химиотерапии опухолевых заболеваний. М: Практическая медицина; 2017.
Лазарев С.М., Массард Ж., Решетов А.В., Николаев Г.В., Волгин Г.Н., Осипов Э.В., Ломтева Е.Ю., Нохрин А.В., Какышева О.Е. Роль онкомаркеров СЕа, Cyfra-21, NSE, TuM2-РК в диагностике и лечении рака легкого. Вестник хирургии им. И.И. Грекова 2010; 1(169): 39–43.
Клeр Х.У., Хардт П., Айгенбродт Х.Е. Новый опухолевый маркер: метаболический онкомаркер Tu M2-PK. Клинические перспективы в гастроэнтерологии, гепатологии 2001; 6: 12–15.
Мовсесян В.В. Диагностическая значимость опухолевого маркера ТuМ2-РК при новообразованиях почки. Автореф. … дис. канд. мед. наук. М; 2007.
Oosterwijk-Wakka J.C., Boerman O.C., Mulders P.F., Oosterwijk E. Application of monoclonal antibody G250 recognizing carbonic anhydrase IX in renal cell carcinoma. Int J Mol Sci 2013; 14(6): 11402–11423, https://doi.org/10.3390/ijms140611402.
Leibovich B.C., Sheinin Y., Lohse C.M., Thompson R.H., Cheville J.C., Zavada J., Kwon E.D. Carbonic anhydrase IX is not an independent predictor of outcome for patients with clear cell renal cell carcinoma. J Clin Oncol 2007; 25(30): 4757–4764, https://doi.org/10.1200/jco.2007.12.1087.
Горбань Н.А., Попов А.М., Карякин О.Б. Прогностическое значение экспрессии карбоангидразы 9 в сочетании с другими маркерами при светлоклеточном почечно-клеточном раке. Онкоурология 2016; 12(3): 40–44, https://doi.org/10.17650/1726-9776-2016-12-3-40-44.
Пасечник Д.Г., Коган М.И., Ахохов З.М. Особенности экспрессии и прогностическое значение пептидных молекул, связанных с ключевыми свойствами почечно-клеточного рака. Урологические ведомости 2017; 7(4): 5–16, https://doi.org/10.17816/uroved745-16.
Рогова Л.Н., Шестернина Н.В., Замечник Т.В., Фастова И.А. Матриксные металлопротеиназы, их роль в физиологических и патологических процессах (обзор). Вестник новых медицинских технологий 2011; 18(2): 86–89.
Черданцева Т.М., Бобров И.П., Варламов С.В., Мяделец М.Н., Климачев И.В., Авдалян А.М., Ганов Д.И., Лазарев А.Ф. Прогностическое значение исследования матриксной металлопротеиназы 9 при почечно-клеточном раке. Онкоурология 2018; 14(3): 17–24, https://doi.org/10.17650/1726-9776-2018-14-3-17-24.
Колбанов К.И., Трахтенберг А.Х., Франк Г.А., Завалишина Л.Э., Бойко А.В., Пикин О.В., Глушко В.А. Факторы прогноза, результаты хирургического и комбинированного лечения больных с различными морфологическими типами немелкоклеточного рака легкого. Онкология. Журнал им. П.А. Герцена 2013; 2(3): 11–16.
Shaco-Levy R., Sharabi S., Benharroch D., Piura B., Sion-Vardy N. Matrix metalloproteinases 2 and 9, E-cadherin, and beta-catenin expression in endometriosis, low-grade endometrial carcinoma and non-neoplastic eutopic endometrium. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 2008; 139(2): 226–232, https://doi.org/10.1016/j.ejogrb.2008.01.004.
Bui M.H., Seligson D., Han K.R., Pantuck A.J., Dorey F.J., Huang Y., Horvath S., Leibovich B.C., Chopra S., Liao S.Y., Stanbridge E.J., Lerman M.I., Palotie A., Figlin R.A., Belldegrun A.S. Carbonic anhydrase IX is an independent predictor of survival in advanced renal clear cell carcinoma: implications for prognosis and therapy. Clin Cancer Res 2003; 9(2): 802–811.
Ганусевич И.И. Роль матриксных металлопротеиназ (ММП) при злокачественных новообразованиях. II. Участие ММП в ангиогенезе, инвазии и метастазировании опухолей. Онкология 2010; 12(2): 108–117.
Ingels A., Hew M., Algaba F., de Boer O.J., van Moorselaar R.J., Horenblas S., Zondervan P., de la Rosette J.J., Pilar Pes Laguna M. Vimentin over-expression and carbonic anhydrase IX under-expression are independent predictors of recurrence, specific and overall survival in non-metastatic clear-cell renal carcinoma: a validation study. World J Urol 2017; 35(1): 81–87, https://doi.org/10.1007/s00345-016-1854-y.
Щукин Д.В., Лесовой В.Н., Яковцова И.И., Данилюк С.В. Активность матриксной металлопротеиназы-9 (ММП-9) при внутривенозном распространении почечно-клеточного рака. Вісник проблем біології і медицини 2015; 1(2): 283–290.
Авдошин В.П., Котельникова Е.В., Бабиченко И.И. Диагностическая и прогностическая значимость экспрессии иммуногистохимических маркеров Ki 67, ММР9 и коллагена IV у больных папиллярным уротелиальным раком мочевого пузыря. Вестник Российского университета дружбы народов. Серия: Медицина 2011; 4: 80–86.
Wechsel H.W., Petri E., Bichler K.H., Feil G. Marker for renal cell carcinoma (RCC): the dimeric form of pyruvate kinase type M2 (Tu M2-PK). Anticancer Res 1999; 19(4A): 2583–2590.