Обучаясь у природы: бактериальные споры как мишень для современных технологий в медицине (обзор)

Введение

В зависимости от наличия наружной мембраны и толщины пептидогликанового слоя бактерии разделяют на грамположительные и грамотрицательные. Попадая в неблагоприятные условия обитания, некоторые грамположительные бактерии реализуют свою способность формировать споры. Эти шаро­образные или слегка удлиненные плотные структуры обладают чрезвычайной стойкостью к физическим и химическим факторам окружающей среды и признаны самой устойчивой формой жизни на планете [1, 2]. Поскольку формирование спор происходит внутри материнской клетки (спорангия), они получили название эндоспор. Способность патогенных микроорганизмов формировать эндоспоры обусловливает их широкую распространенность. В некоторых случаях споры возбудителей болезней способны выступать в качестве самостоятельного инфекционного агента [1, 3, 4].

Например, споры возбудителя сибирской язвы Bacillus anthracis могут существовать в почве в течение десятилетий, сохраняя потенциальную эпизоотическую и эпидемиологическую опасность и способность, оказавшись на поверхности, стать источником заражения людей и животных. По этой причине сибиреязвенные скотомогильники в течение длительного времени сохраняют статус режимного биологического объекта [2, 4]. Кроме того, вызывает серьезную озабоченность возможность спор B. anthracis выступать в качестве одного из наиболее вероятных агентов биотерроризма [4–6]. Трагический случай преднамеренного распространения спор возбудителей сибирской язвы, зафиксированный в США в 2001 г. (они в виде порошкообразных форм были отправлены в почтовых конвертах), продемонстрировал очевидную легкость, с которой споровые формы этого опасного патогена могут стать причиной вспышки инфекционного заболевания [3, 5, 7].

Исследование внешней архитектоники и морфологического строения спор у различных спорообразующих бактерий выявило ряд особенностей [2, 4, 6]. По структуре эндоспоры делятся на две категории: те, которые заключены в плотную наружную оболочку — экзоспориум; и те, которые ее не имеют. Так, почвенные бактерии Bacillus subtilis — наиболее изученный пример формирования спор, не образующих экзоспориума [3, 5, 7]. Если за десятилетия изучения дормантных клеточных форм бактерий микробиологи накопили достаточно знаний о строении и функции эндоспор, то в отношении экзоспор до настоящего времени остается немало вопросов [5, 6–8].

Большинство сведений о молекулярных механизмах формирования и функциях спор у спорообразующих грамположительных бактерий были изучены и хорошо охарактеризованы на штаммах Bacillus spp. и Clostridium spp., в основном с использованием молекулярно-генетических методов и трансмиссионной электронной микроскопии [3, 5, 8]. Например, изоляты B. subtilis в течение многих лет были и остаются одной из распространенных моделей для изучения генетической регуляции и биохимической структурной организации бактериальных спор [3, 6, 9]. Кроме уже упоминавшихся B. anthracis среди патогенных спорообразующих бактерий особое внимание привлекают Bacillus cereus, вызывающие токсикоинфекции, а также представители рода Clostridium spp.: С. botulinum (возбудитель ботулизма), С. perfringens (этиологичес­кий агент газовой гангрены) и С. difficile (наиболее частый в мире источник внутригоспитальных инфекций) [8–11].

Актуальность исследования структуры и пространственной организации этих дормантных бактериальных форм с помощью современных аналитических технологий молекулярной микробиологии связана в первую очередь с их эпидемиологическим значением.

В настоящее время ведется поиск высокочувствительных и быстрых диагностических технологий обнаружения бактериальных спор, что является актуальной проблемой для медицинской диагностики, эпидемиологии, а также решения задач биобезопасности. Кроме того, до сих пор остаются нерешенными вопросы эффективной стерилизации медицинского оборудования и изделий медицинского назначения, что важно для профилактики нозокомиальных инфекций, вызванных патогенными спорообразующими возбудителями [3, 6, 7].

Другим перспективным инновационным биотехнологическим направлением является попытка искусственного копирования архитектоники бактериальных спор для придания подобной устойчивости модельным аналоговым системам, которые способны найти широкое научно-практическое применение в фармакологии, медицине, экологии, сельском хозяйстве и в иных отраслях [8, 12].

В обзоре проведена оценка результатов изучения молекулярных механизмов устойчивости бактериальных спор с помощью современных аналитических инструментов, а также выявлены направления применения полученных знаний в современных биотехнологиях.

Поиск источников проводился в ресурсах Кокрановской библиотеки (директория Wiley Online Library), EMBASE (EMBASE.com), PubMed, PubMed Central, EMBASE и MEDLINE, интегрированных на платформе Elsevier, CINAHL, Web of Science Core Collection (SCI-EXPANDED). Стратегия выборки определялась поиском научных публикаций, содержащихся в тематических каталогах. Глубина поиска — 2003‒2019 гг.

Эндоспоры и молекулярные механизмы их устойчивости

Споруляция у грамположительных бактерий. Ранние классификации бактерий базировались на их способности к споруляции [13]. Спорообразование у бактерий формировалось как защитный механизм, значительно повышающий возможность выживания в окружающей среде. Бактериальные споры могут выдерживать такие неблагоприятные внешние факторы, как высокие и низкие температуры, отсутствие питательного субстрата, воздействие антибактериальных препаратов и дезинфектантов, радиация, высокое давление, ультрафиолетовое излучение [14–17].

Ступенчатый процесс спорообразования достаточно сложен, представляет собой последовательную генетическую регуляцию синтеза многочисленных специфических белков, сопровождающегося клеточной дифференциацией, и занимает около 8 ч [15, 18, 19]. Итогом споруляции является формирование зрелой, метаболически бездействующей и репродуктивно неактивной эндоспоры, которая морфологически и структурно радикально отличается от материнской клетки [20–22].

Молекулярно-генетическая регуляция спорообразования. Споруляция представляет собой генетически детерминированный процесс формирования споры внутри вегетативной материнской клетки, которая находится в стационарной фазе жизненного цикла. Под воздействием стрессорных факторов включаются генетические механизмы, обеспечивающие синтез транскрипционных факторов. Они отвечают за биорегуляцию и последовательность морфофункциональных изменений, которые в конечном счете ведут к превращению вегетативной формы в спору [11, 23–26].

В значительной мере регуляция спорообразования и обеспечивающие ее сложные молекулярно-генетические системы были раскрыты только в начале XXI в. [13, 27–29]. Пусковым фактором споруляции является отсутствие необходимого питательного субстрата. На этом фоне происходит активация гена spo0A, кодирующего одноименную белковую молекулу [19, 30, 31]. В результате реакции фосфорилирования белок Spo0A переходит в активную форму Spo0A~Р и вызывает экспрессию целого ряда генов — около 200, среди которых sigH, spoIIE, ftsZ и др. Все эти гены кодируют синтез белков, обеспечивающих последовательное течение семи стадий споруляции (рис. 1). В частности, ген sigH модулирует синтез белковых σ-субъединиц транскрипции (σН, σF), регулирующих правильную стадийность спорообразования [31–33]. Этот паттерн регуляции дает определенные сигналы экспрессии генов в материнской клетке и передней части споры, которые управляют споруляцией (для ее завершения требуется несколько часов), и включает активацию набора альтернативных σ-факторов. Эти факторы придают каскаду однонаправленность, кульминацией которой является формирование эндоспоры [29, 34].

---

Рис. 1. Последовательность морфологических изменений, происходящих на разных стадиях споруляции у грамположительных бактерий (рисунок авторов)

---

В результате клетка подвергается очень сложной, четко определенной последовательности морфологических и биохимических событий, которые в конечном итоге приводят к образованию зрелых эндоспор. Специальный белок за счет энергии АТФ с усилием помещает одну полную копию ДНК в будущую проспору, и деление завершается. После завершения формирования споры материнская клетка подвергается запрограммированному аутолизу, выпуская зрелую спору в окружающую среду [35].

Молекулярные механизмы термоустойчивости спор. Ключевое значение для сохранения эндоспор имеет их термоустойчивость, что отличает эти эндоспоры от вегетативных клеток. Механизмы термо­устойчивости эндоспор крайне сложны и в полной мере пока не изучены [15, 22, 36, 37].

Как правило, термическая стерилизация является методом выбора для обеспечения надежной стерилизации. Однако исследования, проведенные Р. Scheldeman с соавт. [38] и W.W. Schubert с соавт. [39], показали, что эндоспоры способны сохраниться после стандартных термических методов стерилизации и для их уничтожения необходимы специальные режимы термической обработки.

Известно, что основой толерантности к высоким температурам является дегидратация спящей клетки [15, 37]. Итогом споруляции является образование эндоспор, находящихся в состоянии репродуктивного и метаболического покоя, сниженных ферментативной активности и содержания высокоэнергетических соединений (АТФ и НАДН). Наличие нескольких дополнительных оболочек по сравнению с обычной вегетативной клеткой служит барьером против проникновения воды и растворенных в ней веществ. Дегидратация предохраняет находящиеся внутри белки от денатурации при экстремально высоких температурах и необратимой агрегации, что опосредует способность спор выживать в течение длительного времени (десятки, сотни и более лет) без запаса питательных веществ в условиях, когда вегетативные клетки погибают [22, 36, 37, 40].

В медицинских учреждениях стандартно используют два варианта стерилизации оборудования и инструментария. Первый метод — паровой. Он заключается в обработке объекта 110-градусным паром в течение 20 мин. Второй вариант — суховоздушный, он предполагает выдерживание изделия в стерилизаторе при температуре от 120°C и выше не менее 45 мин. Тем не менее уже упомянутые работы [38, 39] демонстрируют недостаточную эффективность применяемых методов тепловой обработки, поскольку некоторые эндоспоры способны сохраниться. Например, сухой жар при 110°C убивает споры спустя 3 ч, а при 140°C — через 1 ч. Исследователи считают, что необходимы более эффективные способы стерилизации, чтобы полностью уничтожить дормантные формы бактерий.

Дегидратация эндоспор обеспечивается дипиколиновой (пиридин-2,6-дикарбоновой) кислотой (ДПК), которая образует хелатный комплекс с кальцием и другими двухвалентными катионами и снижает содержание воды в спорах до очень низкого уровня [7, 15, 22, 37, 41, 42]. ДПК составляет 5–15% от общей массы эндоспоры и не обнаруживается в вегетативных клетках [15, 40, 43, 44] (рис. 2).

---

Рис. 2. Визуализация и рамановская спектроскопия спор: а, б — эндоспоры В. subtilis (атомно-силовая микроскопия); в — рамановский спектр эндоспоры В. subtilis и биомаркер «дипиколиновая кислота» (фото и рисунок — авторов)

---

Роль ДПК в бактериальной клетке до настоящего времени не до конца понятна, хотя обнаружено это вещество было уже давно и с тех пор активно исследовалось [22, 41, 42, 44]. Помимо выполнения ключевой роли в обеспечении дегидратации клетки [36] ДПК активно участвует в сохранении метаболически неактивного состояния [7], в стабилизации внутриклеточных протеинов [7, 36, 37, 41]. В данном случае клетка оказывается надежно защищенной от экстремального термического воздействия, поскольку процессы денатурации, агрегации и лизиса происходят в период до вегетативного прорастания [43, 44].

По мнению исследователей A. Driks [45] и P. Setlow [29], c включением ДПК в структуру молекул ДНК и РНК образуется гелеобразная полимерная матрица и повышается устойчивость нуклеиновых кислот в условиях гипертермии.

При наступлении благоприятных внешних условий начинается прорастание споры и образование вегетативной бактериальной формы. При этом ДПК выходит во внешнюю среду, а в клетку поступает вода, запуская метаболические реакции [22, 36].

Уникальные свойства ДПК эндоспор позволили современным биотехнологам рассматривать ее в качестве перспективного наполнителя (эксципиента) для повышения стабильности жидких биофармацевтических высококонцентрированных белковых препаратов (например, антител) для повышения их эффективности и профилактики неспецифической агрегации [37]. Кроме того, в последние годы ДПК рассматривается как уникальный и надежный биологический маркер бактериальных эндоспор и поэтому представляет значительный интерес для разработчиков колориметрических и флюорометрических диагностических систем [22, 41]. В настоящее время для надежной, быстрой и однозначной идентификации этой маркерной молекулы в режиме реального времени все бóльшую популярность при­обретает метод комбинационного рассеяния (когерентная рамановская спектроскопия) [22, 43, 46–49].

Молекулярная структура и морфология эндоспор. Формирование сложной клеточной стенки происходит еще на стадии проспоры внутри материнской клетки. Внутренней оболочкой дочерней клетки является пептидогликан, который впоследствии, после прорастания споры, становит­ся основной клеточной стенкой. Над ним надстраивается кортекс — дополнительный слой пептидогликана, который несколько отличается составом от внутреннего слоя [13, 23, 25, 50]. В частности, между гликановыми цепями имеются измененные поперечные пептидные и мурамико-δ-лактамные связи [15, 41, 51, 52].

Снаружи формируются плотные белковые оболочки, количество которых варьирует у разных видов бактерий. Изучение химической структуры наружной оболочки споры длительное время было затруднено из-за плотной сшивки белковых молекул. Именно благодаря этим прочным связям дормантная форма получает устойчивость к гидролазам и другим агрессивным внешним факторам. После появления метода масс-спектрометрии в наружной оболочке удалось установить наличие 70 различных белков [51, 53, 54].

Все перечисленные структуры характеризуются низкой проницаемостью для воды и других неорганических и органических молекул. Благодаря особенностям сборки и пространственного расположения молекул оболочек эндоспоры могут длительно сохранять жизнеспособность в ожидании благоприятных для прорастания условий окружающей среды [7, 15, 55, 56].

Протопласт споры представлен дегидратированной цитоплазмой, в которой расположены хромосомный материал и белковосинтезирующие системы. В химической структуре протопласта можно выделить нуклеиновые кислоты, дипиколинаты, ионы магния, кальция и марганца, а также SASP (small acid-soluble protein) — небольшие молекулы кислоторастворимых протеинов. Их молекулярная масса не превышает 12 кДа, при этом SASP составляют 20% от всех белков споры [20, 22, 34, 36]. Кислотоустойчивые белки имеют в первую очередь защитную функцию, предотвращая разрушающее воздействие на спору ультрафиолетовых лучей и свободных радикалов [20, 53, 54]. На стадии прорастания бактериальных спор SASP используются в качестве донатора аминокислот [7, 54].

Влияние на споруляцию факторов окружающей среды. Выполняя роль защитного приспособления для выживания бактериальных популяций, споры опосредуют механизмы для обеспечения собственной чрезвычайной устойчивости и сохранения целостности макромолекул (белки, ДНК) в период длительного покоя. Структурные детали эндоспор (например, устройство внешних оболочек) и их химический состав могут у разных бактерий различаться вследствие разнообразия молекулярных механизмов их формирования, а также влияния на эффективность споруляции факторов окружающей среды [48, 50].

Например, выявлено, что эффективность споруляции у изолятов B. subtilis, B. anthracis и B. cereus была максимальной при оптимальных значениях концентрации кислорода, ионного состава среды, температуры и pH, а изменения этих параметров приводили к удлинению процесса формирования спор, вплоть до его полного ингибирования, и к снижению их термоустойчивости, а также резистентности к химическому и физическому воздействиям [5, 48, 50, 57]. Так, С. Bressuire-Isoard с соавт. [57] показали, что споры B. cereus, сформировавшиеся при неоптимальных температурах, имели меньшую степень дегидратации и были менее устойчивы к влажному теплу. Кроме указанных факторов на эффективность споруляции влияют и другие. Так, N. Widderich с соавт. [31] обнаружили, что высокая соленость (около 7%) вызывает ингибирование споруляции B. subtilis на ранней стадии из-за нарушения координации переключения σ-факторов и блокирования сигналов экспрессии генов в материнской клетке, регулирующего процесс формирования спор.

Молекулярные механизмы регуляции прорастания бактериальных спор. Научный и практический интерес представляет не только спорообразование, но и обратный ему процесс прорастания бактериальных спор, который не менее сложен с позиций молекулярных механизмов регуляции всех последовательных стадий. Запускается процесс прорастания в благоприятных для конкретного бактериального вида внешних условиях. Для патогенных микроорганизмов наиболее благоприятной средой является организм животного либо человека, где они могут развиваться, размножаться и вызывать инфекционное заболевание. В частности, эндоспоры B. anthracis переходят в активную форму после попадания в ткань легких и вызывают развитие легочной формы сибирской язвы [24, 58–60].

Механизм герминации бактериальных спор инициируется при появлении в окружающей среде питательных субстратов: углеводов, аминокислот, пуриновых оснований, а также при достаточной влажности, аэрации и благоприятной температуре. Этот процесс протекает в несколько этапов, которые строго регулируются биохимическими механизмами [36, 42, 61]. Вещества, составляющие основу питания бактерии, раздражают рецепторный аппарат наружной мембраны эндоспор. Рецепторы в свою очередь активируют процесс прорастания, который на определенном этапе становится необратимым. Начальной стадией прорастания является выход наружу дипиколината кальция, ионов Н⁺, Mn²⁺, Ca²⁺, Mg²⁺. Внутрь клетки в этот момент поступает вода, показатель рН повышается до 7,7, гидролизируется гликопептидный кортекс [36, 60, 61].

На фоне изменения pH активируются внутриклеточные ферменты, запускаются процессы обмена веществ, белковосинтезирующий механизм. Клетка активно растет, набухает, увеличивается в объеме [5, 42, 57, 62]. Когда внутриклеточное давление доходит до критического уровня, происходит разрыв оболочки эндоспоры и наружу выходит вегетативная бактериальная форма [56].

Эти генетически детерминированные молекулярные механизмы прорастания спор положены в основу метода дробной стерилизации (тиндализации): объект в течение получаса подвергается воздействию пара температурой в 100°C. Затем делается перерыв на сутки, в течение которых сохраняется температурный режим, оптимальный для роста и размножения микроорганизмов. Через сутки объект вновь нагревают горячим паром. Такую процедуру повторяют несколько раз. При этом бактерии, успевшие выйти из спящего состояния, разрушаются под воздействием гипертермии [42, 55].

У некоторых бактерий процесс прорастания имеет дополнительные особенности. Речь идет о микроорганизмах, способных к формированию экзоспориума — наружной оболочки спор, имеющей специфические морфофункциональные особенности.

Морфофункциональные особенности экзоспориума

Пространственная структура экзоспориума. Как уже указывалось, у некоторых эндоспор грамположительных бактерий в процессе споруляции образуется дополнительный наружный белковый слой — экзоспориум (экзоспорий, экзоспора), который служит барьером между эндоспором и окружающей средой [21, 63, 64].

Ни Роберт Кох, впервые описавший «шаровидную стеклянную массу» (цит. по [21]), окружающую спору, ни Карл Флюгге, предложивший название «экзоспориум» (цит. по [14]), не предполагали, что это «легкое узкое кольцо, окружающее споры» (Р. Кох), окажется настолько сложным и интересным объектом исследования с многовекторными функциями при изучении его с помощью современных методов молекулярной биологии.

Исследования экзоспориума в последние годы проводились в основном на изолятах трех основных близкородственных видов спорообразующих грамположительных бактерий (тип Firmicutes), входящих в группу B. cereus sensu lato: B. anthracis, B. cereus и B. thuringiensis (бактериальный инсектицид) [3, 64–67]. Кроме того, экзоспоры образуют некоторые виды Clostridium spp. [9, 32, 68–73].

Экзоспоровая архитектура бактерий, входящих в указанные группы, не сильно различается и имеет сходную морфологию [32, 69, 74]. Обычно она представляет собой гибкую, но прочную оболочку — тонкий непрерывный белковый базальный слой, который имеет наружный волосяной и внутренний кристаллический слои. Тонкие структуры экзоспориума могут изменяться в различных условиях роста и у разных видов бактерий [14, 66–68].

Применение современных методов молекулярной биологии позволило значительно расширить представления о биохимической структуре и пространственной организации экзоспориума. У бактерий семейства Bacillus spp. и Clostridium spp. экзоспориум представляет собой тонкую и гибкую оболочечную структуру, объем которой обычно значительно больше, чем находящейся внутри эндоспоры [5, 57, 67].

Как уже указывалось, основным структурным элементом экзоспор у разных видов бактерий является тонкий кристаллический базальный белковый слой [65, 70, 75–77]. Наружная поверхность базального слоя имеет ворсистое покрытие (hairy nap), представленное коллагеноподобными нитями у экзоспориума бактерий группы B. cereus sensu lato — протеином BclA [32, 78–82]. Оказалось, что этот гликопротеин играет значительную роль в защите спор от фагоцитоза [78, 83–85]. Кроме того, недавно было показано, что он опосредует механизм иммунного ингибирования, который способствует сохранению спор в легких мыши [80, 86, 87].

У бактерий группы B. cereus sensu lato основные элементы структуры экзоспориума оказались сходны [78, 81, 84]. Как правило, экзоспоры имеют неправильную баллоноподобную форму с многочисленными деформациями, складками и расположенной внутри эндоспорой.

Область между базальным слоем экзоспориума и внешней оболочкой эндоспоры называется промежуточным пространством [78, 80] и у B. anthracis составляет примерно 500 нм [77, 81]. В некоторых местах базальный слой располагается в непосредственной близости от внешнего слоя оболочки эндоспоры. Базальный слой экзоспориума имеет толщину приблизительно 12–16 нм (B. anthracis) и, по-видимому, состоит из двух подслоев толщиной примерно 5 нм [20, 67, 85].

Кроме того, базальный слой имеет кристаллическую структурную организацию с 6-кратной симметрией и периодическим интервалом 7 нм. Внешняя поверхность этой структуры состоит из серии шестиугольных вогнутых чашек в виде сот, с открытыми концами, ориентированными кнаружи [67, 84, 85]. Между чашками располагаются полупроницаемые каналы диаметром 20–34 нм [20, 67], чего достаточно для проникновения низкомолекулярных веществ, но слишком мало для диффузии крупномолекулярных белков. Такое строение каналов обеспечивает барьерные свойства экзоспориума [20, 67, 84].

Ворсовые нити экзоспоры, обычно состоящие из белка BclA, имеют длину 14–70 нм и покрывают всю поверхность внешней оболочки базального слоя [32, 84, 86–88]. Исследования [84, 88–91] показали, что в отличие от других бактерий группы B. cereus sensu lato у экзоспориума B. megaterium (штамм QM B1551) ворсовые нити локализовались только на одном полюсе и состояли из белков-ортологов BclA и BclB, а также белка BxpB (ExsFA).

Синтез экзоспориума и его биохимическая структура. Биохимическая структура экзоспориума, значительно отличающаяся от структуры эндоспор, была предметом многих исследований [14, 24, 88, 92]. Общий процесс его биосинтеза проиллюстрирован на концептуальной модели bottle cap («бутылочный колпачок») и применительно к B. anthracis включает два этапа [89–91]. Инициация синтеза происходит на центральном полюсе споры. Сначала в спорообразующей материнской клетке появляется зародыш будущей экзоспоры в виде маленькой слоистой структуры. Сборка экзоспоры происходит путем последующего осаждения белков: начинается от синтеза «колпачка» — области, расположенной вблизи центрального полюса материнской споры, включающей примерно 25% поверхности базального слоя, и заканчивается формированием оставшейся «неколпачковой» («бутылочной») части экзоспориума (около 75%). Завершается синтез на противоположном полюсе споры прикреплением базального слоя экзоспоры к внешней оболочке споры. Исследования, проведенные за последние годы на штаммах B. anthracis и B. cereus, показали, что в разных этапах биосинтеза отдельных областей экзоспориума принимают участие ряд белков, что в конечном итоге опосредует его сложную био­химическую структуру [60, 75, 92–94].

При исследовании мутантных изолятов B. anthracis J.A. Boydston с соавт. [74] и C. Steichen с соавт. [16] впервые обнаружили, что базальный слой экзоспориума не является биохимически однородной структурой: его «колпачковые» и «неколпачковые» области различаются по белковому составу. Так, CotY является белком, специфичным для «колпачка», тогда как протеины BclB, ExsY, ВхрВ (также известный как ExsFA), ExsFВ и BclA специфичны для остальной области экзоспориума [16, 74, 75, 92]. Из перечисленных белков CotY и ExsY участвуют в биосинтезе экзоспориума на начальных этапах формирования основы базального слоя, в то время как ExsFA и ExsFВ — на завершающих [74, 88]. При этом ExsFA (экзоспориевый белок массой 17 кДа) обнаруживается как в «колпачковой» области, так и вне ее, тогда как его аналог — BxpB — выявляется преимущественно в «неколпачковой» части экзоспориума [82, 90, 92]. Оба этих белка (некоторые авторы ставят между ними знак равенства) необходимы на этапе формирования филаментов ворсистого слоя [16, 67, 82, 90].

Среди белков, принимающих участие в биосинтезе экзоспориума, особого внимания заслуживает коллагеновый гликопротеин BclA. Экспериментальные исследования С. Steichen с соавт. [16] и T.N. Brahmbhatt с соавт. [76] на модели рекомбинантного гликозилированного белка BclA изолята B. anthracis обнаружили, что этот гликопротеин обеспечивает общую гидрофобность экзоспор, а также обладает иммунодоминантными свойствами [16, 76, 77, 92]. Это определяет потенциальную возможность использования BclA для разработки вакцины против сибирской язвы. В проведенных экспериментах специфический антиген rBclA повышал защиту мышей, зараженных спорами B. anthracis, и усиливал их фагоцитоз, одновременно снижая способность прорастания спор внутри макрофагов, что, как известно, является ключевым механизмом патогенеза сибирской язвы [77, 78, 88, 92].

В промежуточном пространстве между экзо- и эндоспорой обнаруживаются белковые молекулы CotY, ExsA, ExsB, ExsM, ExsY, которые взаимодействуют с протеином эндоспоры CotE. Эти белки обеспечивают прочное прикрепление экзоспоры [33, 57, 66, 74, 88] и определяют ее химическое строение [66, 93–95].

Во время синтеза экзоспориальной оболочки белковые молекулы включаются в процесс не одновременно. Через 4–5 ч от старта спорообразования формируются протеины BclA и ВхрВ. Они синтезируются в материнской клетке в виде сложной высокомолекулярной структуры. Затем белки делятся на мономеры, и через 60 мин после этого запускается процесс синтеза экзоспориума [89]. Интересным представляется факт, что белки BclA и ВхрВ соединяются между собой вследствие формирования ковалентных связей, после чего инициируется процесс гликозилирования [89, 90]. Сформировавшиеся связи между этими белками настолько прочны, что переносят кипячение в присутствии 8 М мочевины, 1% SDS и восстановителей [89, 91].

Результаты исследований J. Manetsberger с коллегами [18, 54] показали, что закодированные генами cotW и cotX одноименные протеины являются основным компонентом базального слоя экзоспоры B. megaterium аналогично белкам CotY и ExsY в структуре B. cereus и B. anthracis [18, 54, 74, 88, 95]. В спорах бактерий вида B. subtilis эти белковые молекулы входят в состав плотной наружной оболочки, которая, по-видимому, представляет собой рудимент экзоспоры [62, 96].

Существуют также работы, раскрывающие более тонкую молекулярную структуру экзоспор. В исследованиях В.М. Thompson с соавт. [90, 91] показано разделение базальной части оболочки на два (а возможно, и более) подслоя: внутреннего с гликопротеинами CotY и его паралогом ExsY и наружного, включающего белки ВхрВ и ExsFВ.

Расположение определенных белковых молекул в той или иной части клетки напрямую влияет на ее свойства [42]. Например, локализующийся в самых наружных структурах белок BclA обусловливает защиту клетки от фагоцитов [84, 87] и иммунных агентов [86, 97]. Экзоспориальные ферменты инозин-гидролаза и аланиновая рацемаза [85, 88, 94] ингибируют несвоевременное прорастание споры [98, 99].

Одним из кандидатов на роль ключевого белкового компонента, определяющего строение и физиологию экзоспориума, является ExsY. Это подтверждают научные труды S. Jiang с соавт. [26] и С. Terry с соавт. [63]. Исследователи пришли к выводу, что за счет белка ExsY экзоспориум имеет шестигранное, сотовое, строение. По мнению авторов, это становится возможным благодаря формированию дисульфидных связей между цистеином белковой цепи и его субъединицами [21, 26, 63]. Эти связи придают оболочке Bacillus spp. и Clostridium spp. гибкость и вместе с тем высокую устойчивость к внешним воздействиям, а также дают возможность формировать складки, обеспечивая прочное прилипание к поверхности окружающих объектов [74, 88]. Способность к адгезии, как известно, является одним из ключевых факторов вирулентности у этих видов бактерий [8, 9, 20].

Однако в отношении бактерий рода Clostridium не все так однозначно. Интересные исследования структуры экзоспор C. difficile — ведущего возбудителя нозокомиальной инфекции — провели P. Calderón-Romero с соавт. [10]. Они наблюдали у эндоспор этих представителей рода Clostridium два морфотипа экзоспориума, различающихся по толщине [9, 10, 69, 70, 74]. При этом наружные ворсинки присутствовали у штаммов C. difficile в любом случае [9, 10, 69]. Анализируя причины подобного явления, авторы предположили, что штаммы с разной толщиной экзоспоры выполняют различные функции при развитии инфекционного заболевания [10, 69, 70].

Эта же группа исследователей, используя безгелевый подход для анализа экзоспориевого слоя и комбинированные методы экстракции, выявила присутствие 184 белков в слое экзоспория [10, 70]. Некоторые из идентифицированных белков оказались иммуногенными (BclA, CdeC, CdeM, CotA, CotCB и CotE), они были определены в качестве потенциальных антигенных субстанций для создания вакцин [65, 70, 99–101]. В этой группе белков особое внимание было уделено коллагеноподобным экзоспориевым протеинам BclA, которые формируют волосяные филаментные структуры [69, 70, 73]. Геномы C. difficile кодируют три коллагеноподобных паралога BclA (BclA1, BclA2 и BclA3) [65], которые локализуются исключительно в экзоспориуме спор C. difficile [70, 73]. Учитывая тот факт, что BclA2 и BclA3 широко представлены в большинстве штаммов C. difficile, можно предположить, что вакцины на их основе смогут обеспечить иммунную защиту против клинически значимых изолятов.

Важным компонентом экзоспориума клостридий являются протеины CdeC и CdeM, богатые цистеином [10, 30, 64]. CdeM встречается исключительно у вида C. difficile [10], а CdeC выявлен и у других представителей семейства Peptostreptococcaceae [30]. В условиях отсутствия этих белков патогенность бактерии снижается [10].

Эксперименты доказали иммуногенность перечисленных структурных экзоспориевых белков [30, 64, 102, 103]. В организме мышей, которым был введен белок CdeM, активно вырабатывались IgG-антитела и развивался иммунный ответ [103]. Поствакцинальная защита после контаминации C. difficile достигала 90%. Вакцинация хомяков была проведена белком CdeM, выделенным из рекомбинантного штамма 630 C. difficile. Ее эффективность составила 80% [102–104]. Исследования в данном направлении продолжаются, учитывая уникальность белка CdeM для C. difficile. В частности, изучается эффективность конструированной вакцины с добавлением адъювантов, призванных повысить скорость и продолжительность ее действия [102, 105–109].

Помимо CdeM для иммунизации лабораторных животных используется и другой белок C. difficile — CdeC. Активация гуморального иммунитета с выработкой IgG была достигнута после трехкратной вакцинации [103]. Следовательно, этот протеин также является иммуногенным [3, 64]. Защита от инфицирования C. difficile (штаммы 630, UK1) после вакцинации и выживаемость иммунизированных особей достигали 100% [9, 69].

Роль экзоспориума в патологическом процессе. Основным объектом исследования роли экзоспориума в инфекционном процессе является антропозоонозный возбудитель сибирской язвы B. anthracis, способный образовывать споры в аэробных условиях [14, 84, 89–94].

Начальный этап инфицирования организма в значительной степени происходит при активном участии экзоспориума, а именно при взаимодействии его поверхностного коллагенового гликопротеина BclA с интегрином Мас-1 (CR3) [26, 60, 110]. При попадании спор возбудителя в организм хозяина они поглощаются макрофагами и дендритными клетками, которые инициируют клинические проявления и форму заболевания (легочную, кожную или желудочно-кишечную) [89, 90, 100, 111, 112]. При любой форме заболевания фагоциты мигрируют по лимфе, генерируя процесс. Споры прорастают внутри фагоцитов и дендритных клеток, размножаются и продуцируют токсины. В лимфатических узлах происходит лизис клеток и высвобождение вегетативных форм бактерий с последующей инвазией в кровоток, активным размножением и выработкой токсина, опосредующего клинические проявления инфекции и приводящего к летальному исходу. Дальнейший этап образования спор происходит только в почве, в условиях достаточного доступа кислорода, который является индуктором споруляции [78, 79, 110].

Таким образом, ключевым звеном в инфекционном процессе являются связывание споры возбудителя с интегрином и их фагоцитоз. С.R. Oliva с соавт. [110] и J. Bozue с соавт. [78] показали, что споры B. anthracis, лишенные белка BclA, не связываются с интегрином. Было показано, что рамноза, входящая в состав BclA, связывается с СD14 и действует в качестве корецептора при взаимодействии с интегрином Мас-1, способствуя фагоцитозу. Приведенные данные свидетельствуют о ведущей роли гликопротеина BclA экзоспориума в патогенезе сибирской язвы.

Несмотря на то, что в последние годы достигнут значительный прогресс в выяснении структуры и функций экзоспор, наше понимание состава, механизмов образования и роли этой внешней структуры бактериальных спор остается недостаточным [10, 14, 33, 113]. Очевидно, что исследования, начатые в XIX в. Р. Кохом, стоит продолжить и еще многое предстоит раскрыть в отношении биологии экзоспор.

Использование в исследовании этих структур современных аналитических инструментов из арсенала изучения микробиологии одиночных клеток (атомно-силовой микроскопии, рамановской спектроскопии, генетики) может стать ключом к более полному пониманию морфологической, наномеханической и биохимической характеристики экзоспориума [12, 113, 114].

Современные технологии выявления и изучения спор

Атомно-силовая микроскопия: от визуализации до атомной манипуляции. Сканирующая зондовая микроскопия — одна из наиболее динамично развивающихся и активно использующихся в современных научных исследованиях аналитических технологий. Одним из наиболее известных инструментов является атомно-силовой микроскоп, изобретенный в 1986 г. как сканирующий туннельный профилометр [28]. С 90-х гг. прошлого века атомно-силовая микроскопия (АСМ) стала наиболее активно использоваться в биомедицинских исследованиях благодаря простой процедуре пробоподготовки и возможности субмикронной визуализации объектов [28, 115–118]. В течение короткого времени АСМ как метод трехмерной визуализации и исследования локальных микромеханических свойств завоевала лидирующие позиции во многих областях науки, включая микробиологические исследования [28, 116, 119]. Этот аналитический инструмент дополнил и расширил возможности главного для микробиологов метода визуализации — световой микроскопии, выйдя за пределы ее технического разрешения, а также электронной микроскопии, главным недостатком которой является сложность приготовления препаратов и необходимость проведения исследований в условиях высокого вакуума [116, 120, 121].

Привлекательность применения АСМ в микробио­логии связана с некоторыми специфическими техническими особенностями этого диагностического метода, основанного не на свойствах линз, а на использовании специального зонда (сенсора), анализирующего поверхность образца с помощью иглы на тонкой и гибкой упругой консоли (кантилевера), установленной в держателе.

Этот инструмент визуализации сочетает микроскопию в привычном понимании с наномолекулярной детекцией механических, иммунохимических, адгезивных и электростатических свойств объекта (бактерий). Эти возможности сделали АСМ чрезвычайно полезным и незаменимым инструментом молекулярной микробиологии, а клетки прокариот, благодаря своим размерам и свойствам, стали благоприятным объектом для исследования [116, 122, 123]. В результате сканирования АСМ представляет цифровое трехмерное топографическое изображение поверхности микроорганизмов в нанометровом латеральном и пространственном разрешении в любой среде и при различной температуре [121, 123].

За короткий период времени АСМ превратилась из метода топографической визуализации в инструмент манипуляции отдельными атомами и исследования межмолекулярных взаимодействий. Рассмотрим возможности АСМ в изучении бактериальных спор.

Периодические атомно-силовые наблюдения за бактериальными эндоспорами позволяют отслеживать динамические процессы, связанные со споруляцией или прорастанием в вегетативные клетки. Для микробиологических исследований дормантных клеточных форм бактерий существенным является возможность проведения АСМ в нескольких режимах. В топографическом режиме («постоянном усилии») отклонение консоли поддерживается постоянным с помощью контура обратной связи. При этом сила взаимодействия иглы с поверхностью образца значительно зависит от расстояния между ними и определяется адгезией, а также ван-дер-ваальсовыми и капиллярными взаимодействиями. Позиция Z консоли отражает топографию (высоту) образца по типу географической карты, где цвет изображения соответствует высоте рельефа [116, 118, 123].

Будучи методом силового зондирования, АСМ позволяет не только получать изображение топографии поверхности и многослойной архитектуры спор, но и определять их наномеханические характеристики, такие как упругость, вязкость и адгезия [12, 121–123]. Одновременно можно получать информацию о топографии поверхности образца с помощью модуля Юнга (модуля упругости) и адгезии в виде изображения с высоким разрешением [115, 118, 124]. Например, в исследованиях R. Giorno с соавт. [24, 60] и R.L. Brunsing с соавт. [27], выполненных с помощью АСМ в водных растворах, выявлено, что поверхность спор Bacillus spp. имеет ряд круглых ребристых нанометровых выступов на внешней оболочке, ориентированных вдоль продольной оси, а R.A. Zolock с соавт. [125] показали, что на основании этих морфологических особенностей можно дифференцировать четыре близкородственных видов спор Bacillus.

Визуализация спор в жидкости открывает широкие перспективы для мониторинга динамических процессов, таких как споруляция и прорастание дормантных клеточных форм. Интересными недавними примерами являются исследования динамики прорастания спор Bacillus spp. в вегетативные клетки. После 30 мин инкубации при комнатной температуре наблюдалось увеличение размеров (набухание) спор, а спустя 5–6 ч все споры проросли в вегетативные клетки, которые сразу же сформировали биопленку [121, 123].

Современные возможности использования АСМ при изучении наномеханических свойств внутренних структур спор B. anthracis продемонстрировали A.G. Li с соавт. [12] и T. Morisaku с соавт. [123]. На основе термозондовой АСМ (thermal scanning microscopy, SThM) они разработали метод нанохирургического разрезания споры с помощью жесткого алмазного наконечника, а мягкий зонд использовали для визуализации и характеристики ее внутренних структур в нанометровом масштабе. Выявлено, что показатели упругости и адгезии при повышенных температурах значительно варьируют в разных областях сечения спор [123], а также обнаружена ранее неизвестная пептидогликановая ультраструктура коры спор B. anthracis, состоящая из стержнеобразных структур нанометрового размера, ориентированных в поперечном направлении относительно продольной оси споры [12, 123].

За почти 30-летнюю историю использования в молекулярной микробиологии силовая микроскопия стала мощным исследовательским инструментом в изучении спор, эффективно дополняя световую микроскопию, генетику и биохимические методы, традиционно применяемые для анализа структуры клеточной стенки дормантных форм бактерий. Однако потенциальное использование этого метода в изучении бактериальных дормантных клеточных форм до сих пор иногда недооценивается и ограничивается лишь некоторыми из его функциональных возможностей [114, 126]. Дальнейшее применение АСМ связано с использованием динамических (многочастотных, мультигармонических, бимодальных) методов, которые позволяют получать более быстрые количественные наномеханические характеристики сложной многослойной структуры спор в более высоком разрешении [123, 127].

Интересной и перспективной является разработка и применение АСМ-биосенсоров для количественной визуализации отдельных молекул структурных белков эндоспор и экзоспориума с использованием G-квадруплекса ДНК-технологий либо функционализированных зондов с иммобилизованными на них отдельными химическими группами или единичными молекулами, особенно в сочетании с другими аналитическими инструментами, такими как рамановская спектроскопия (РС) комбинационного рассеяния [126–128].

Рамановская спектроскопия: новые возможности старого метода. Разработка высокочувствительных и быстрых методов обнаружения бактериальных спор является актуальной проблемой для медицинской диагностики, эпидемиологии, а также для решения задач биобезопасности.

Общественный резонанс, вызванный биотеррористической атакой в 2001 г., в которой использовались споры B. anthracis, обострил проблему их длительной детекции и идентификации. Материал было необходимо проращивать в питательных средах до вегетативных клеточных форм, накопления биомассы и, наконец, проводить молекулярно-генетические исследования с целью выявления гена 16S рРНК, специфичного для этого вида патогена. Кроме того, требовалось выполнять аналогичные многочасовые исследования с другими подозрительными порошками для выяснения масштабов нападения [79, 129, 130]. В итоге пришло осознание необходимости поиска новых информативных и значительно более быстрых методов детекции. Ранняя информация по идентификации патогена смогла бы ускорить начало проведения специфической профилактики, этиопатогенетического лечения и свести к минимуму трагические последствия теракта, обусловленные количеством инфицированных и погибших людей [27, 131, 132].

Проблема быстрой идентификации осложняется рядом аспектов, связанных с минимальным количеством исследуемого материала, — вдыхание всего 10⁴ эндоспор B. anthracis (100 нг порошка) является смертельной дозой для 50% зараженных людей, а также с необходимостью дифференцировать патогенный биосубстрат от похожего, но безвредного для ликвидации панического страха, сопровождающего эпидемические вспышки опасных инфекций [99, 129, 133]. Следовательно, новый метод индикации должен быть не только быстрым, но и высокоспецифичным, надежно дифференцирующим опасные бактериальные эндоспоры от других биологических объектов в любых объектах окружающей среды.

Этим критериям соответствует спектроскопия комбинационного рассеяния (рамановская спектроскопия, РС) — метод, известный уже более 80 лет, давно и широко используемый в качестве аналитического и прикладного инструмента в химических и технических отраслях [52, 86, 117]. Низкая интенсивность сигнала, получаемого от живых объектов, долгое время служила препятствием для применения РС в биомедицинских исследованиях. Однако после появления в последние 10–20 лет нескольких усовершенствований этой технологии (в первую очередь — соединение РС с конфокальным микроскопом, а также различные способы усиления сигнала комбинационного рассеяния) метод стал широко использоваться в биомедицинских исследованиях без затрат времени на этапы подготовки образцов и без необходимости особой маркировки или окрашивания [117]. В частности, этот мощный аналитический инструмент в последние годы стал активно использоваться для быстрого, недорогого и эффективного решения задач молекулярной микробиологии [52].

Привлекательность РС связана с неинвазивностью (возможностью исследовать бактерии, не разрушая их), минимальной пробоподготовкой, отсутствием необходимости использования меток и зондов и скоростью получения результата. Исследуемый образец помещается в фокус лазера возбуждения и измеряется. Молекулярная информация, полученная с помощью РС, позволяет однозначно идентифицировать микроорганизм по специфическому спектру входящих в его состав химических и биохимических веществ [129, 131, 132]. Кроме того, возможность получения данных о молекулярной структуре бактериальных клеток, находящихся в разных фазах жизненного цикла, а также изучения динамики некоторых клеточных процессов сделали этот метод мощным аналитическим инструментом для исследования спор (рис. 3).

---

Рис. 3. Поверхностно-усиленная спектроскопия комбинационного рассеяния (SERS) является наиболее перспективным аналитическим инструментом для индикации спор: а — нанесение пробы на обработанную лазером SERS-активную подложку из золота или серебра; б — обработка пробы возбуждающим лазерным лучом с определенной длиной волны; в — рассеяние рамановских лучей; г — регистрация рамановского спектра с помощью рамановского конфокального микроскопа (фото и рисунок — авторов)

---

Значительные различия в спектрах комбинационного рассеяния вегетативных и споровых клеточных форм бактерий были обнаружены достаточно давно при исследовании Bacillus spp. Эти различия связаны с преобладанием в резонансных спектрах бактериальных эндоспор дипиколината кальция, мажорные пики которого выявлялись на частотах колебаний 1015–1017 см^–1 при длине волны возбуждения 244 нм [22, 43, 44, 47, 133]. Как указывалось выше, содержание этого биомаркера составляет в среднем 10% сухой массы спор и варьирует в зависимости от вида, штамма споро­образующих бактерий и условий споруляции [37, 40, 43, 47]. Полученные рамановские спектры спор B. cereus, B. anthracis и B. subtilis оказались очень похожими, и дипиколинат кальция был предложен в качестве чувствительного биомаркера для быстрого обнаружения спор Bacillus spp. [134–136].

Исследования бактериальных спор в последние годы проводятся с применением усовершенствованных модификаций РС, усиливающих сигнал (использование резонансной частоты возбуждения, лазерного оптического пинцета, наночастиц серебра и золота или когерентного антистоксового рассеяния света) [135]. Так, S. Wang c соавт. [1, 137] изучали кинетику и уровни накопления алкалоида берберина в спорах Bacillus spp. и Clostridium spp., его влияние на их прорастание. Целью исследования был поиск средств минимизации потенциальной опасности проросших спор и способов уничтожения их после или во время прорастания. В этом исследовании лазерный пинцет РС в сочетании с флуоресцентной и дифференциальной интерференционной микроскопией были использованы для анализа локализации, уровня и кинетики поглощения берберина в отдельной покоящейся и прорастающей споре.

Для исследования бактериальных спор очень перспективным представляется сочетание методов АСМ и РС. Такие интегрированные аналитические системы стали использоваться в молекулярной микробиологии в последние годы [48, 117]. Информация о структурно-топографических и наномеханических свойствах дополняется данными о субмикронном молекулярном профиле, что дает довольно полную картину и лучшее понимание дормантных систем [117]. Например, в исследовании R. Boitor c коллегами [138] была проведена количественная оценка РНК, ДНК и белков бактериальных клеточных форм путем записи рамановских спектров и калибровочных моделей для каждого структурного компонента и корректировки фокусных эффектов с помощью топографического изображения AСM.

Одно из последних усовершенствований метода — сочетание РС с конфокальной микроскопией — способствовало появлению мощного инструмента для исследования бактериальных спор, микрорамановской спектроскопии (микроРС). Этот перспективный метод предоставляет уникальную возможность для исследования отдельных клеток и клеточных элементов. В частности, недавние исследования бактериальных спор видов рода Bacillus с помощью микроРС [137–139] дали возможность получить интересные результаты по их фенотипической гетерогенности, связанной с параметрами окружающей среды, а также проводить индивидуальное тестирование методов инактивации этих клеточных форм. На уровне отдельных спор была оценена спорицидная способность нескольких физических и химических методов, в конечном итоге обработка 20% формальдегидом оказалась наиболее эффективной [138]. Кроме того, была показана высокая эффективность и перспективность холодной атмосферной плазмы для инактивации спор в медицинской и пищевой промышленности [137, 139].

В последние годы при исследовании бактериальных спор спектроскопические методы особенно привлекали внимание в качестве основного элемента для комбинации с другими аналитическими инструментами [52, 117, 139]. Такой междисциплинарный подход отражает новую современную тенденцию и является незаменимой исследовательской технологией многопараметрического исследования гетерогенности одиночных клеток в микробиологии (парадигма одноклеточной микробиологии), включая бактериальные споры. И в этом смысле АСМ и РС служат примерами новых аналитических инструментов и методов, которые предоставляют уникальную возможность наблюдать дискретные микробиологические явления, недоступные с использованием традиционных подходов.

Плазмохимические технологии и бактериальные споры

Бактериальные споры известны со времени возникновения микробиологии как науки. Долгие годы они рассматривались с точки зрения их эпидемиологической и патогенетической важности для возникновения инфекций. Как уже указывалось выше, чрезвычайная устойчивость во внешней среде сделала бактериальные споры серьезной проблемой здравоохранения. Существующие методы стерилизации (сухой и влажный пар, хлорсодержащие вещества, γ-облучение и др.) недостаточно эффективны, особенно при деконтаминации хирургических инструментов, медицинского оборудования или лекарственных препаратов. Поэтому поиск средств и методов уничтожения бактериальных спор был и остается актуальной научной задачей, на решение которой направлены многочисленные междисциплинарные исследования.

С этой целью в последнее время активно исследуется возможность применения нетепловой (холодной) плазмы, которая имеет температуру окружающей среды, может использоваться для обработки термочувствительных объектов и рассматривается как потенциальная альтернатива традиционным методам стерилизации [137, 139, 140]. Такая плазма генерируется воздействием на газ (например, какой-либо из инертных) электрического или электромагнитного полей. Энергия поля вызывает ускорение свободных электронов и ионизирует атомы и молекулы газа. Возбужденные атомы и молекулы, возвращаясь к более стабильному состоянию, выделяют избыточную энергию в виде электромагнитного и ультрафиолетового излучения, а также в виде генерированных активных форм кислорода и азота с широким, в том числе мощным антимикробным, спектром действия [141–143]. Наиболее изученными приложениями этой технологии в области биологии и медицины являются стерилизация продуктов, деконтаминация медицинского оборудования, хирургических имплантатов и обработка раневых поверхностей [142, 144–146].

Возможность быстрого (секунды–минуты) и эффективного воздействия холодной плазмой на дормантные и вегетативные клеточные формы патогенных грам­отрицательных и грамположительных бактерий, в том числе споры Bacillus spp. и Clostridium spp., вызвала значительный интерес у микробиологов [145, 147, 148]. Он сфокусирован прежде всего на изучении и характеристике антимикробной эффективности плазмы, а также механизмов микробной инактивации и спороцидного действия, которые в настоящее время изучаются очень активно [141, 149, 150].

Заключение

Бактериальные споры представляют собой уникальную и чрезвычайно инертную биологическую систему, механизмы противостояния которой экстремальным условиям до конца не изучены. Понимание механизмов устойчивости этих дормантных форм имеет важное биомедицинское значение и потенциально может привести к разработке новых методов профилактики и стерилизации, которые будут направлены на уязвимые структуры эндо- и экзоспор.

Многолетняя история изучения эндоспор позволила сделать детальный анализ и описание процесса споруляции и прорастания у отдельных модельных организмов, создать прочную основу для понимания клеточных процессов, ведущих к образованию этих дормантных форм, частично познать многообразные механизмы их устойчивости. Результатом исследований стало концептуальное убеждение в том, что высокая устойчивость бактериальных спор может иметь значение и непосредственное применение в самых разных областях биотехнологии.

В настоящее время исследования спор продолжаются на новом, наноструктурном уровне. В частности, споры представляют научный интерес как биологическая модель для изучения механизмов образования сложных надмолекулярных структур и становятся мишенью для современных биотехнологий по принципу «учиться у природы» [150–152]. Например, очень перспективными являются разработки по использованию моделей природной архитектоники эндоспор для создания самоорганизующихся надмолекулярных структур, используемых в качестве наноразмерных подложек для упаковки и адресной доставки ферментов, нуклеиновых кислот, антигенов и лекарственных средств к определенным тканям, клеткам и даже внутриклеточным органеллам [153–155]. Эти поверхности можно использовать в качестве биопокрытий или молекулярных переключателей, приводимых в действие химическими веществами, электронами или светом [156, 157].

Рассматривается и прямое использование эндоспор, однако существует значительный риск, связанный с прорастанием и вегетативным ростом бактерий до достижения ткани-мишени. Тем не менее N.J. Roberts с соавт. [154] в эксперименте использовали эндоспоры C. histolyticum и C. novyi и выявили, что при прорастании и вегетативном росте эти виды вызывают лизис опухолевых клеток или регрессию опухоли.

Другим направлением, связанным с использованием спор при лечении раковых опухолей, является селективная экспрессия специфических ферментов при преимущественном прорастании дормантов в гипоксических опухолях [155].

С начала XXI в. проводятся исследования по использованию рекомбинантных бактериальных спор для создания термостабильных вакцин [149, 151, 158–160]. В 2007 г. N.Q. Uyen с коллегами [153] провели успешный эксперимент по защите мышей от столбняка при оральном или назальном введении вакцин, сконструированных на основе антигена C. tetani TTFC на поверхности спор В. subtilis. О перспективности этих биотехнологий свидетельствуют проведенные пилотные исследования [156, 157, 161].

В недавних публикациях [10, 36, 152, 162] высказано предположение, что споры и спорообразующие бактерии могут играть важную роль в развитии и распространении резистентности к антибиотикам благодаря их биологическим свойствам, способности к рассеиванию и тем самым — к распространению генов устойчивости к антимикробным веществам в состоянии метаболического покоя (10, 36, 152].

Уникальные свойства бактериальных спор в ближайшее время могут найти применение в других экосистемных технологиях, например при палеоэкологических зондированиях, в качестве биофунгицидов и биоинсектицидов в сельском хозяйстве, а также при биоремедиации и биоминерализации (биологически индуцированные и контролируемые процессы минерализации, которые происходят в природе).

Вклад авторов. Все авторы принимали равное участие в работе над обзором.

Источники финансирования. Работа не поддерживалась никакими финансовыми источниками.

Конфликт интересов отсутствует.