Новый метод обработки, окрашивания и визуализации тканей, содержащих металлические имплантаты и очаги внескелетной минерализации

Введение

Несмотря на активное развитие гистологических и иммуногистохимических методов, совершенствование методов визуализации, а также на разработку новых моделей световых, флуоресцентных и электронных микроскопов [1–3], до настоящего времени отсутствуют эффективные способы гистологического анализа тканей, содержащих цельнометаллические имплантаты и эктопические кальцификаты [4].

Наиболее часто используемыми металлическими имплантатами являются стенты [5, 6] и металлические пластины [7, 8]. Изучение биосовместимости перспективных сплавов металлов (к примеру, никелида титана) требует имплантации изготовляемых из них прототипов медицинских изделий лабораторным животным с последующей оценкой формирования соединительнотканной капсулы, инфильтрации иммунокомпетентными клетками и неоваскуляризации [9, 10]. В то же время при резке на микротоме или криотоме вследствие несовпадения плотности тканей неизбежно происходит отделение металлических конструкций от окружающих тканей, что вызывает разрыв ткани и необратимо нарушает ее целостность. Подобная проблема также наблюдается при наличии в тканях очагов внескелетной минерализации, которая характерна, к примеру, для атеросклероза [11], медиальной кальцификации сосудов [12] или кальцификации нативных [13] и протезных [14] клапанов сердца.

С другой стороны, рутинное гистологическое или иммуногистохимическое окрашивание требует визуализации посредством световой микроскопии, ограниченное разрешение которой не позволяет получать изображения высокого качества при увеличении более чем в 400 раз. Эта проблема не решается даже при использовании конфокальной микроскопии, которая, во-первых, не позволяет адекватно оценить структуру ткани, а во-вторых, как правило, также ограничена увеличением в 630 раз. Адекватная оценка нео­васкуляризации, являющейся суррогатным маркером воспаления при имплантации прототипов медицинских изделий, при таком спектре увеличений достаточно затруднительна; кроме того, новообразованные сосуды малого калибра на практике далеко не всегда окрашиваются антителами к классическим эндотелиальным маркерам.

Таким образом, существует потребность в принципиально новом методе обработки, окрашивания и визуализации тканей, содержащих металлические имплантаты или очаги эктопической минерализации. Ранее нашей группой был разработан оригинальный метод длительного осмирования фиксированных в формалине тканей с их последующим обезвоживанием, окрашиванием уранилацетатом, заливкой в эпоксидную смолу, шлифовкой, полировкой и контрастированием цитратом свинца с дальнейшим использованием сканирующей электронной микроскопии в обратно-рассеянных электронах [15]. Предлагаемый метод в силу применения красителей для просвечивающей электронной микроскопии и соблюдения принципов визуализации при сканирующей электронной микроскопии в режиме обратно-рассеянных электронов позволяет получать изображения, аналогичные просвечивающей электронной микроскопии, но с более низким разрешением (достаточным, однако, для адекватного гистологического анализа) [15].

Цель исследования — оценить эффективность использования оригинального метода обработки, окрашивания и визуализации тканей, содержащих цельнометаллические медицинские изделия или их прототипы, а также очаги внескелетной минерализации, для их последующего изучения с помощью сканирующей электронной микроскопии в обратно-рассеянных электронах.

Материалы и методы

В качестве эталонных объектов исследования были выбраны: 1) пластина (10×10×1 мм) из никелида титана с окружающими тканями, извлеченная через 2 мес после подкожной имплантации крысе линии Wistar; 2) перфорированные пластины из оригинального запатентованного титанового сплава, извлеченные через 1 и 2 мес после ортотопической имплантации новозеландским белым кроликам в процессе краниопластики; 3) каротидная атеросклеротическая бляшка, полученная в результате эндартерэктомии вместе с небольшим количеством интактной ткани внутренней сонной артерии у мужчины 60 лет вследствие гемодинамически значимой хронической ишемии головного мозга; 4) фрагмент стентированной внутренней сонной артерии, эксплантированный у мужчины 57 лет в результате повторной каротидной эндартерэктомии вследствие рестеноза, также вызвавшего гемодинамически значимую хроническую ишемию головного мозга.

Исследование было выполнено в соответствии со стандартами надлежащей клинической практики (Good Clinical Practice), принципами Хельсинкской декларации (2013) и с соблюдением этических принципов Европейской конвенции по защите позвоночных животных. Протокол исследования был одобрен локальным этическим комитетом Научно-исследовательского института комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний. До включения в работу от всех пациентов было получено письменное информированное согласие.

После извлечения образцы тканей помещали в забуференный (рН=7,4) 10% водный раствор формалина («БиоВитрум», Россия). После суточной фиксации в формалине (смена раствора формалина через 12 ч) биоматериал постфиксировали 1% тетраоксидом осмия в 0,1 M фосфатном буфере в течение 12 ч, затем окрашивали 2% тетраоксидом осмия в бидистиллированной воде в течение 48 ч. Далее образцы обезвоживали в серии спиртов возрастающей концентрации (50, 60, 70, 80 и 95% этанол, все по две смены, каждая смена по 15 мин), окрашивали 2% уранилацетатом (Electron Microscopy Sciences, Швейцария) в 95% этаноле (5 ч), обезвоживали 99,7% изопропанолом («БиоВитрум») в течение 5 ч и ацетоном («Реахим», Россия) в течение 1 ч, пропитывали смесью ацетона с эпоксидной смолой Epon (Electron Microscopy Sciences) в соотношении 1:1 (6 ч), после чего переносили в свежую порцию эпоксидной смолы (на 24 ч) и далее проводили полимеризацию в емкостях FixiForm (Electron Microscopy Sciences) при 60°С. После этого образцы в эпоксидных блоках подвергали шлифовке и полировке на установке TegraPol-11 (Struers, Дания). Контрастирование цитратом свинца выполняли по Рейнольдсу в течение 7 мин путем нанесения раствора на поверхность шлифованного образца с последующей его отмывкой бидистиллированной водой. Далее проводили напыление на полированную поверхность эпоксидных блоков углерода (толщина покрытия — 10–15 нм) с помощью вакуумного напылительного поста (EM ACE200; Leica Biosystems, Германия). Визуализацию структуры образцов при помощи сканирующей электронной микроскопии в обратно-рассеянных электронах выполняли на электронном микроскопе S-3400N (Hitachi, Япония) в режиме BSECOMP при ускоряющем напряжении 10 кВ.

Для оценки элементного состава исследуемых образцов использовали метод рентгеноспектрального микроанализа, осуществленного с помощью энергодисперсионного спектрометра XFlash 4010 (Bruker Daltonics, Германия), входящего в состав сканирующего электронного микроскопа S-3400N (Hitachi). Элементный анализ был осуществлен в условиях низкого вакуума (давление в камере микроскопа 20 Па) и при ускоряющем напряжении 15 кВ в режиме сканирующей электронной микроскопии в обратно-рассеянных электронах без использования стандартных образцов. На цифровых микрофотографиях исследовали локализацию электронно-плотных включений (металлоконструкций и очагов минерализации), оценивали структурные особенности биологических тканей в составе исследуемых образцов, идентифицировали эндотелиальные клетки, клетки мезенхимального ряда (гладкомышечные клетки, фибробласты) и иммунокомпетентные клетки.

Результаты

Одним из широко используемых приложений для применения предлагаемого метода может быть исследование взаимодействия тканей лабораторных животных с металлическими имплантатами, в частности на классической модели подкожной имплантации прототипов медицинских изделий. К примеру, вследствие значительной толщины пластин из никелида титана (1 мм) практически невозможно получать срезы извлеченных образцов с окружающими тканями. Последовательное использование шлифовки и полировки позволяет получить высокую сохранность биологических тканей без повреждения имплантата (рис. 1, а, б). По мере возрастания увеличения улучшалась детализация тонких структур образца. В частности, при увеличении в 1000 раз (рис. 1, в) появляется возможность оценить особенности строения тканей и структуры клеток, прилегающих к металлу. Непосредственно в месте контакта отмечали наличие небольшого щелевидного пространства, содержащего мелкие электронно-плотные гранулы. Вероятно, что образование щели и гранул является артефактом, связанным с процессами забора и обработки материала. Далее по направлению от имплантата уверенно идентифицировался слой плотной соединительной ткани, представленной фиброцитами, имеющими типичную структуру ядер и цитоплазмы. Характерной особенностью этого участка образца было отсутствие иммунокомпетентных клеток реципиента. К моменту забора образцов материал демонстрировал полную биосовместимость.

Рис. 1. Пластина из никелида титана, извлеченная через 2 мес после подкожной имплантации крысе Wistar Визуализация барьера между пластиной и тканями (а — ×500; б — ×1000) и новообразованных сосудов (в, г — ×2500)

За слоем плотной соединительной ткани отмечали наличие обильной рыхлой соединительной ткани, причем переход между ними был резким. Следует отметить, что в слое рыхлой соединительной ткани, в отличие от плотной, присутствовали крупные кровеносные сосуды (см. рис. 1, в). Как правило, максимальное количество сосудов регистрировали вблизи контакта рыхлой и плотной соединительной ткани, а по мере удаления от имплантата плотность расположения сосудов снижалась. Крупные кровеносные сосуды имели типичную структуру (рис. 1, г) и демонстрировали от­личия в структуре оболочек. Во всех сосудах отмечено наличие слоя эндотелия, однако у части сосудов за ним следовали несколько слоев округлых клеток с цитоплазмой, имеющей повышенную электронную плотность. Дальнейшее повышение увеличения позволяет детализировать структуру цитоплазмы и ядер, что дает возможность увеличить достоверность морфологической идентификации клеток.

Сходный с представленным результат наблюдали при исследовании эксплантированных мини-пластин из титанового сплава, использовавшихся в качестве краниальных заплат в экспериментах на лабораторных крысах. Через 2 мес после выполнения краниопластики наблюдали образование слоя соединительной ткани вокруг структурных элементов пластин. На малых увеличениях (рис. 2, а, б) отмечали наличие слоя соединительной ткани, образованной удлиненными клетками, расположенными параллельно поверхности пластины. При больших увеличениях (рис. 2, в, г) в составе ткани различали наличие двух слоев. В слое, непосредственно прилегающем к пластине, отмечали рыхлое расположение клеток с большими прозрачными округлыми межклетниками, а за этим слоем следовал слой вытянутых клеток с удлиненными ядрами и цитоплазмой умеренной плотности. Переход между слоями был постепенным. На представленном участке образца наблюда­ли плотное прилегание клеток к материалу заплаты. При­легающие клетки были различной формы (с преобладанием округлой) и содержали в цитоплазме мелкие гранулы.

Рис. 2. Перфорированная пластина из оригинального запатентованного титанового сплава, извлеченная через 2 мес после внутричерепной имплантации новозеландским белым кроликам Визуализация барьера между пластиной и тканями (а — ×250; б — ×500) и разграничение соединительной ткани на два слоя: в — нижележащий плотный, содержащий вытянутые клетки с удлиненными ядрами, ×1000; г — прилежащий к пластине, рыхлый с округлыми межклетниками, ×2500

В продолжение представленных экспериментов было изучено взаимодействие краниальных заплат с окружающими тканями на ранних сроках имплантации. Создание оболочки заплаты происходило неравномерно: вначале слой фиброзной ткани образовывался вдоль длинной поверхности заплаты, в то время как торцевая часть поверхности оставалась свободной. В этой области наблюдали обширное свободное пространство, не содержащее в своем составе структурных элементов и окруженное тонким слоем соединительной ткани, соединенной с отстоящим от торцевой поверхности тканевым массивом (рис. 3, а). В этой ткани отмечали присутствие кровеносных сосудов и различных типов клеток (рис. 3, б, в), в особенности макрофагов (рис. 3, г–е). Макрофаги имели типичное строение и содержали вакуоли с прозрачным содержимым (см. рис. 3, д, е). По всей вероятности, наличие макрофагов указывает на процессы продуктивного воспаления, вызванного имплантацией искусственного биоматериала.

Рис. 3. Перфорированная пластина из оригинального запатентованного титанового сплава, извлеченная через 1 мес после внутричерепной имплантации новозеландским белым кроликам Процесс образования соединительнотканной капсулы вокруг пластины: а — общий вид пластины в сочетании с окружающими тканями, ×100; кровеносные сосуды и множественные клетки в окружающей ткани: б — ×250; в — ×1000; многочисленные макрофаги в очаге продуктивного воспаления: г — ×1000; д — ×2500; е — ×5000

Исследование гистологического материала, содержащего крупные минеральные включения, также представляет серьезные методические трудности. Очаги минерализации обладают высокой твердостью, механической прочностью и зачастую гетерогенны, что препятствует качественной резке. Замена резки процедурой шлифовки и полировки позволяет решить эту проблему. На рис. 4 показаны результаты исследования минерализованного участка атеросклеротической бляшки. Минеральные отложения, визуализированные в этом участке, представляли собой крупные электронно-плотные включения внутри неоинтимы с неоднородной структурой (рис. 4, а). Очаг кальцификации окружен слоем слабоструктурированного вакуо­лизированного материала, обладающего умеренной электронной плотностью. Далее следуют несколько слоев гладкомышечных клеток.

Рис. 4. Структура, клеточное окружение и химический состав очага минерализации в составе атеросклеротической бляшки: а — кальцификат с окружающими тканями, ×500; белыми прямоугольниками с цифрами 1, 2, 3 показаны области, в которых определяли элементный состав (участок 1 — непосредственно кальцификат; участок 2 — прилежащая к кальцификату плотная соединительная ткань; участок 3 — рыхлая соединительная ткань, обильно содержащая фосфолипиды); б — элементный состав отмеченных на микрофотографии участков; в — график рентгеновского микроанализа участка 1 (кальцификат)

Другим важным достоинством предлагаемого метода является возможность проведения элементного анализа с целью определения фазы фосфата кальция или иного другого минерала, что имеет значение для оценки зрелости минерала, давности формирования очага кальцификации и может влиять на стабильность атеросклеротической бляшки. Изучение результатов элементного анализа трех участков (рис. 4, б, в) показало, что в них присутствуют кальций, фосфор, кислород, натрий, магний и осмий.

В очаге минерализации (участок 1) преобладали кислород, кальций и фосфор, что указывает на его фосфатно-кальциевую природу. Стоит отметить, что постфиксация ткани осмием не приводила к артефактной контаминации им кальциевых включений и, соответственно, к смещению результатов элементного анализа.

В прилежащей к очагу кальцификации соеди­ни­тельной ткани (участок 2) количество кальция и фосфора составляло около 0,5%, что является высоким показателем для биологической ткани и, возможно, отражает активно идущий метаболизм этих элементов в гладкомышечных клетках. Кроме того, в данном участке регистрировалось определенное содержание осмия (около 4%).

В рыхлой соединительной ткани (участок 3), также обладающей высокой электронной плотностью, содержание кальция по сравнению с прилежащей к очагу минерализации соединительной тканью было в 8 раз меньше, однако количество фосфора и осмия было выше в 4 раза. Большое содержание этих элементов позволяет предположить, что в данном случае высокая электронная плотность участка является признаком наличия значительного количества характерных для атеросклеротической бляшки фосфолипидов, так как они обладают высокой осмиофильностью и в их состав входит фосфор, но не кальций.

Таким образом, предлагаемый метод показал свою эффективность в исследовании биологических образцов с минеральными включениями, позволяя оценивать не только морфологические характеристики, но и элементный состав включений и окружающих их тканей. В случаях, когда нет необходимости изучать элементный состав образцов, можно идентифицировать минеральные включения, основываясь исключительно на морфологических признаках. При исследованиях на малых увеличениях (рис. 5, а, б) хорошо видна общая структура объекта и окружающих его тканей, а также локализация кровеносных сосудов. При повышении увеличения (рис. 5, в, г) происходит детализация окружения очага кальцификации, его гетерогенной структуры, окружающей его соединительнотканной капсулы, а также строения окружающих его клеток.

Рис. 5. Очаги минерализации с окружающими тканями в составе атеросклеротических бляшек: а — общий вид кальцификатов и их локализация в структуре бляшки, ×100; б — локализация крупного новообразованного кровеносного сосуда вблизи кальцификата, ×250; в — соединительнотканная капсула вокруг кальцификата, ×500; г — множественные клетки различной структуры вблизи кальцификата, ×1000

Особый интерес представляет использование данного метода для исследования образцов, содержащих одновременно металлические и минеральные включения. В частности, таким примером могут служить атеросклеротические бляшки, развившиеся после стентирования, с признаками рестеноза, содержащие минеральные включения (рис. 6, а, б). При тщательном заборе материала отмечали высокую сохранность слоев бляшки. Хорошо визуализировались стойки стента, окруженные слоем плотной соединительной ткани. В периферийном от просвета сосуда направлении наблюдался слой плотной соединительной ткани, представляющей собой остатки слоя медии сосуда, присутствовавшей в его структуре до стентирования (см. рис. 6, а). Между элементами стента отмечали крупные кровеносные сосуды с тонкими стенками. Глубже стента, в направлении просвета сосуда был виден толстый слой неоинтимы, имеющий различную электронную плотность в радиальном направлении (см. рис. 6, б). На приведенных рисунках наблюдаются области с высокой электронной плотностью, которые на основании морфологических признаков можно идентифицировать как кальцифицированные участки.

Рис. 6. Строение атеросклеротической бляшки, развившейся в сонной артерии после стентирования и развития рестеноза: а, б — общий вид структуры удаленной бляшки, содержащей стент и очаги минерализации, ×50; в — частично дезинтегрированная плотная соединительная ткань с соединительнотканными и иммунокомпетентными клетками, ×1000; г — сохранные эндотелиальные клетки с локализованными под ними пенистыми клетками, ×2500; д — слой пенистых клеток и нижележащая плотная соединительная ткань с щелевидными пространствами, ×1000; е — новообразованный кровеносный сосуд в неоинтиме с расположенными вокруг множественными клетками, ×2000

При больших увеличениях хорошо визуализировались клетки, присутствующие в структуре образцов. В частности, на рисунках 6, в и г представлены два различных участка бляшки, непосредственно контактирующие с кровеносным руслом и имеющие сохранные слои эндотелия. Эндотелиальные клетки отличались сходным строением, однако нижележащие клетки и ткани были различны. Так, в представленном на рис. 6, в сегменте под эндотелием наблюдали слой соединительной ткани, состоящий из плотных волокон, между которыми находились клетки, которые на основании морфологических признаков относили к гладкомышечным клеткам и макрофагам, при этом макрофаги содержали мелкие светлые вакуоли и лизосомы. По всей вероятности, в этом участке происходил процесс постепенного разрушения структуры плотной соединительной ткани. В варианте, представленном на рис. 6, г, под слоем эндотелия находили рыхлую ткань с крупными межклеточными пространствами. Клетки, прилегающие к эндотелию, имели округлую форму, а также круглые ядра с тонким слоем хроматина, прилегающим к ядерной мембране и диффузно расположенным в центральной части ядра. Эти клетки имели морфологическое сходство с пенистыми клетками.

В направлении к периферии сосуда слой пенистых клеток примыкал к относительно сохраненному слою плотной соединительной ткани, в составе которой наблюдали присутствие клеток и щелевидных пространств (рис. 6, д). Внутренняя часть неоинтимы была неоднородной. В одной части ее пространства наблюдали отсутствие клеточных структур, в других частях отмечали наличие новообразованных кровеносных сосудов (так называемых vasa plaquorum), макрофагов, гладкомышечных клеток (рис. 6, е).

Обсуждение

Разработанный в данной работе оригинальный метод подготовки позволяет в значительной мере решить проблему исследования образцов, содержащих затрудняющие резку структурные элементы (к примеру, металлические или минеральные компоненты). Принципиальными в предлагаемом методе являются два аспекта: замена процедуры резки образца шлифовкой после его заливки в эпоксидную смолу и визуализация структуры образца не просвечивающей, а сканирующей электронной микроскопией в обратно-рассеянных электронах. При этом изображения имеют практически полное визуальное сходство с получаемыми при помощи просвечивающей электронной микроскопии.

Несмотря на некоторую сложность понимания сути процесса, сам метод является достаточно простым и хорошо воспроизводимым. Для него не требуется специальных модификаций оборудования, высокого качества изображения удается достичь с применением серийных приборов (стандартных моделей растровых электронных микроскопов). В ходе процедур длительного осмирования, выдерживания в спиртовом растворе уранилацетата и контрастирования цитратом свинца удается получить более качественное изображение с высоким контрастом.

При использовании для пропитки изучаемых объектов низковязких эпоксидных смол (Эпон, смола Спурра) возможно исследовать образцы большого размера. В частности, в представленной работе использовались образцы, имеющие толщину свыше 5–7 мм. При соблюдении этого условия длина и ширина образца не имеют принципиального значения. Стоит отметить, что линейные размеры образца не влияют на качество шлифовки и полировки.

Благодаря этим особенностям предлагаемый метод предоставляет возможность детального исследования биологических структур, имеющих массивные, препятствующие резке твердые включения. Это позволяет изучить структуру не только окружающих тканей, но и самих включений, что бывает необходимо, если заранее неизвестна природа объектов или они специально получены в качестве имплантата оригинальным методом (например, спеканием или 3D-печатью) и их структура определяет взаимодействие с биологическими тканями.

Приведенные результаты показали, что анализ полученных изображений позволяет удовлетворительно идентифицировать сами клетки и некоторые внутриклеточные структуры, в частности ядра, цитоплазму и вакуоли. Исходя из этих характеристик, а также формы и локализации клеток, можно идентифицировать не только их тип, но и образованные ими ткани, а также физиологическое состояние.

Ограничением рассматриваемого метода является относительно низкое разрешение: изображения высокого качества удается получить на предельном увеличении в пять тысяч раз, что на порядок уступает возможностям просвечивающих электронных микроскопов аналогичного класса. Это обусловлено тем, что изображение зависит от глубины слоя, на который проникают электроны. При отражении от глубоких слоев траектория рассеянных электронов отклоняется, что приводит к «смазыванию» изображения. Возможными вариантами решения этой проблемы могут быть совершенствование методов контрастирования образцов и оптимизация режимов визуализации.

Заключение

Представленный оригинальный метод обработки, окрашивания и электронно-микроскопической визуализации позволяет удовлетворительно исследовать структуру образцов, для которых невозможна или значительно затруднена резка. При этом качество полученного изображения на порядок превышает получаемое при световой микроскопии.

Финансирование исследования. Работа выполнена при поддержке комплексной программы фундаментальных научных исследований Сибирского отделения РАН в рамках фундаментальной темы Научно-исследовательского института комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний №0546-2019-0002 «Патогенетическое обоснование разработки имплантатов для сердечно-сосудистой хирургии на основе биосовместимых материалов, с реализацией пациент-ориентированного подхода с использованием математического моделирования, тканевой инженерии и геномных предикторов».

Конфликт интересов. Авторы не имеют конфликта интересов.