Реконструкция периферического нерва при использовании биодеградируемого и бионедеградируемого кондуитов в эксперименте

Введение

Травма периферических нервов приводит к снижению или потере функций поврежденной конечности пациента и его нетрудоспособности, поэтому восстановление структуры нерва — одно из основных направлений в нейрохирургии и в нейрогистологических исследованиях [1]. Сшивание нервных стволов неизбежно сопровождается формированием соединительнотканного рубца, что обусловливает только частичное восстановление функций конечности [2–4]. Первичным методом микрохирургии при диастазе культей поврежденного нерва является его аутопластика участками других периферических нервов [5–13]. При данной операции нарушается кровоснабжение восстанавливающегося нерва, что снижает скорость его регенерации и способствует образованию соединительнотканных рубцов [14–20]. Кроме того, аутопластика сопровождается болезненностью донорских участков от дополнительных разрезов, нарушением чувствительности и формированием невром [21–24].

В экспериментальной нейрогистологии радикально новым подходом можно назвать тубулирование нервного ствола с помощью кондуитов — трубок, являющихся подложками для роста нервных волокон через область травмы [25, 26]. В условиях диастаза такая подложка также может быть резервуаром для наполнителя, стимулирующего процессы регенерации. Кроме того, кондуит препятствует врастанию окружающей соединительной ткани в область травмы, что ограничивает формирование соединительнотканного рубца, мешающего проведению растущих нервных отростков в дистальную культю [21, 27].

В настоящее время встречаются работы с пустыми бионедеградируемыми и биодеградируемыми трубками из разных материалов, которые используют при исследовании воздействия наполнителей на регенерацию нерва [5, 23, 24, 27–32]. Хорошие результаты получены при использовании биодеградируемых кондуитов, в том числе из фибринового клея — Тиссукола [27, 31, 32]. В нейрохирургии успешно применяется Реперен — бионедеградируемый биосовместимый материал, используемый при пластике твердой мозговой оболочки, сохраняющий структуры мозга в интактном состоянии и предотвращающий образование спаек с окружающими тканями [33]. Пластиной из Реперена была выполнена изоляция корешка тройничного нерва путем его обертывания с целью купировать приступы сильной боли в зонах иннервации при артериальной пульсации [34]. Однако в клинике при пластике периферических нервов трубки из бионедеградируемых материалов используются редко, а предпочтение отдается биодеградируемым.

В связи с этим целью исследования стало сравнительное исследование особенностей применения кондуитов в виде сплошной трубки из нерезорбируемого ма­териала Реперена и резорбируемого фибринового материала Тиссукола и их влияния на регенерацию седалищного нерва крысы в условиях диастаза его культей.

Материалы и методы

Эксперименты выполнены на белых нелинейных крысах-самцах репродуктивного возраста (n=14), массой 350–400 г, в соответствии со стандартами Good laboratory Practice (GLP). Содержание животных и проведение экспериментов осуществляли в соответствии с международными правилами «Guide for the Care and Use of Laboratory Animals» (National Research Council, 2011), а также с этическими принципами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (Страсбург, 2006). Работа одобрена Этическим комитетом Приволжского исследовательского медицинского университета.

Животные были разделены на 3 группы: 1-я (n=5) — интактные, исследована морфология седалищного нерва в области планируемой пластики; 2-я (n=4) — выполнена пластика нерва кондуитом из нерезорбируемого материала Реперена; 3-я (n=5) — пластика нерва кондуитом из резорбируемого материала Тиссукола.

Животных наркотизировали изофлураном с использованием наркозного аппарата Zoomed minor vet (Beijing Read Eagle Technology Co., Ltd., Китай) и концентратора кислорода Armed 7F-3L (Jiangsu Yuyue Medical Equipment and Supply Co., Ltd., Китай). Доступ к седалищному нерву правой задней конечности осуществлялся путем разрезания кожных покровов вдоль проекции бедренной кости и последующей тупой препаровки мышечных фасций. Выделенный нерв перерезали поперечно на уровне средней трети бедра, его культи вставляли в кондуит с внутренним диаметром 2 мм и длиной 10 мм, заполненный физиологическим раствором. Диастаз в 5 мм создавали путем разведения концов перерезанного нерва, погружения этих концов в кондуит на глубину 2,5 мм с обеих сторон и закрепления эпиневрия за края трубки узловыми швами с помощью полипропиленовой мононити 8/0.

В экспериментах использованы два вида кондуитов. Кондуиты из Реперена («Айкон Лаб», Россия) поставлялись в виде готовых трубок в стерильной упаковке, изготовление кондуитов с использованием набора Tissucol Kit (Baxter, Австрия) проводили согласно известной методике [23, 27, 28].

Морфологический анализ осуществляли на полутонких (0,5 мкм) поперечных срезах седалищного нер­ва, изготовленных на ультрамикротоме Leica EM UC7 (Leica, Германия) и окрашенных метиленовым синим и фуксином. Исследовали формирующийся нерв в области его диастаза и дистальную культю в 1 мм от кондуита. Материал фиксировали в 2,5% растворе глутарового альдегида на фосфатном буфере (рН=7,4) и постфиксировали в 1% растворе четырехокиси осмия с последующим заключением в смесь смол «Эпон–Аралдит». Фоторегистрацию срезов проводили на световом микроскопе Nikon Eclipse 80i (камера Nikon DS-Fi1) (Nikon, Япония) при увеличении окуляра ×10 и объективов — ×10 и ×20.

Морфометрический анализ поперечных срезов регенерировавшего нерва выполняли в программе NIS-Elements BR 4.0. Проводили: 1) тотальный подсчет общего количества регенерировавших миелиновых нервных волокон и их оценку в размерных группах, исходя из диаметра нервного волокна по классификации [35], по которой выделялись мелкие (менее 4 мкм в диаметре), средние (4–7 мкм) и крупные (более 7 мкм) волокна; 2) анализ общей площади поперечного среза нерва, площади пучков нервных волокон, площади эпиневрия.

Статистическую обработку полученных данных выполняли в программе Statistiсa 10.0 с применением набора базовой и непараметрической статистики. Статистическую значимость различий значений между сравниваемыми величинами оценивали с помощью критерия Манна–Уитни при р<0,05.

Результаты

Морфология интактного седалищного нерва. В норме изучаемый участок седалищного нерва состоит в среднем из 4 нервных пучков, каждый из которых окружен периневрием. Эпиневральная оболочка — тонкая, с умеренным развитием жировой ткани (рис. 1, а). Общая площадь седалищного нерва крысы в норме составляет 1 365 632,0±180 727,5 мкм². В нашем случае площадь нерва без эпиневрия — 782 832,3±160 703,0 мкм², а площадь эпиневрия — 582 799,5±110 457,5 мкм².

---

Рис. 1. Поперечный срез седалищного нерва крысы: а — интактного животного; б — регенерировавшего в кондуите из Реперена к концу 14-й недели эксперимента; в — регенерировавшего в кондуите из Тиссукола к концу 14-й недели эксперимента; А — нервные волокна, Б — периневрий, В — эпиневрий; окраска метиленовым синим и фуксином

---

Анализ размерных групп миелиновых нервных волокон показал, что наиболее многочисленными являются крупные волокна (d>7 мкм), их количество составило 57,7%, на долю средних волокон (4<d<7 мкм) приходилось 37,3%, а мелких (d<4 мкм) — 5,7% от общего числа.

Морфология формирующегося седалищного нерва в области тубулирования. На 14-й неделе эксперимента область травмы при использовании кондуитов из Реперена и Тиссукола, заполненных физио­логическим раствором, имела существенные морфологические отличия.

В случае применения Реперена формирующийся нерв был тоньше по сравнению с его дистальным участком и интактным нервом. Регенерирующий нервный ствол располагался внутри целой нерезорбируемой трубки и не примыкал к ее внутренней поверхности (рис. 2, а). Он содержал один пучок нервных волокон (рис. 1, б). Средняя площадь поперечного среза нерва с эпиневрием была в 1,7 раза меньше, чем в норме, без эпиневрия — в 2,1 раза меньше нормы. Площадь поперечного среза эпиневрия — в 1,37 раза меньше интактных показателей. Среди размерных групп преобладали средние миелиновые нервные волокна, составившие 53,7% от общего числа (см. таблицу). Доля мелких волокон — 35,1%, крупных — 11,2%. При этом количество миелиновых нервных волокон во всех размерных группах статистически значимо отличалось от показателей нормы.

---

Рис. 2. Седалищный нерв крысы через 14 нед эксперимента, регенерировавший в кондуите: а — из Реперена; б — из Тиссукола (указан скобкой)

---

Количество миелиновых нервных волокон в седалищном нерве при использовании бионедеградируемого и биодеградируемого кондуитов

---

Кондуит из Тиссукола через 14 нед после операции полностью резорбировался. Регенерировавший участок (рис. 2, б) по толщине значительно превышал нерв в кондуите из Реперена. Периневрий не определялся, а нервные волокна были представлены в виде одного пучка (рис. 1, в). Эпиневрий был сильно утолщен, имел рыхлую структуру. В связи с этим значительно увеличивалась общая площадь нерва, которая превосходила интактные показатели в 2,68 раза. При этом средняя площадь эпиневрия почти в 4,0 раза превысила норму. Показатели средней площади нерва без эпиневрия — в 1,76 раза больше интактных.

Общее число миелиновых волокон в области травмы увеличилось по сравнению с нормой в 3,6 раза (см. таблицу). Среди размерных групп преобладали мелкие миелиновые волокна, составлявшие 65,3% от общего числа. Количество средних волокон — 29,6%, что статистически значимо не отличалось от нормы, процент крупных волокон — лишь 5,1%.

Кроме того, при использовании названных кондуитов были выявлены существенные отличия. В конце эксперимента вокруг Реперена не наблюдалось спаечного процесса. Кондуит был покрыт слоем тонкой соединительной ткани и легко отделялся от окружающих тканей. При использовании Тиссукола у всех животных участок новообразованного нерва после резорбции кондуита с трудом отделялся от окружающих тканей из-за выраженного спаечного процесса.

Морфология дистального участка седалищного нерва. Морфология дистальной культи нерва при использовании обоих видов кондуитов имела существенные различия.

К концу эксперимента (на 14-й неделе) после тубулирования Репереном поврежденного нерва морфологический анализ его дистального участка на 1 мм от края трубки показал сохранение многопучковости, характерной для интактного нерва (рис. 3, а). Однако общая площадь поперечного сечения нервного ствола превышала интактные показатели в 2–3 раза за счет разрастания эпиневрия. Средняя площадь пучков нерва уменьшилась по сравнению с нормой. При этом число мелких миелиновых волокон составило 71,0% от общего количества, средних — 26,5%, крупных — 1,8%.

---

Рис. 3. Регенерировавший седалищный нерв крысы на 1 мм дистальнее кондуита к концу 14-й недели эксперимента: а — при использовании Реперена; б — при использовании Тиссукола; А — нервные волокна, В — эпиневрий; окраска метиленовым синим и фуксином

---

После тубулирования Тиссуко­лом в дистальной культе к концу эксперимента наблюдался один пучок нервных волокон, окруженный широким рыхлым эпиневрием. Периневральная оболочка не выражена. Общая площадь нерва в дистальном участке также превосходила площадь интактного нерва за счет разросшегося эпиневрия. Общее количество миелиновых нервных волокон было почти в 2 раза больше, чем в интактном нерве. Количество крупных миелиновых волокон составляло 4,1%, средних — 30,8%, мелких — 65,0%.

Клинические показатели восстановления поврежденной конечности. В норме у животных угол клиренса стопы в области голеностопного сустава составляет 180° [36]. При повреждении седалищного нерва клиренс голеностопного сустава может количественно характеризовать его контрактуру.

Контрольными клиническими показателями состояния поврежденной правой задней конечности явились: 1) угол клиренса стопы; 2) постановка конечности; 3) воспаление голеностопного сустава с появлением трофических язв; 4) количество пальцев. Использование обоих видов кондуитов при регенерации нерва показало к концу эксперимента близкие результаты. Угол разгибания голеностопного сустава составил в среднем 170°, воспаления и утолщения сустава не наблюдалось. При ходьбе животные опирались на стопу, расправляя пальцы поврежденной конечности (рис. 4).

---

Рис. 4. Постановка правой задней конечности крыс через 14 нед от начала эксперимента: а — группа с кондуитом из материала Реперена; б — группа с кондуитом из материала Тиссукола

---

Обсуждение

В эксперименте были изучены морфологические характеристики седалищного нерва, включая подсчет тотального количества миелиновых нервных волокон и распределение их по трем размерным группам, а также выполнена оценка общей площади поперечного среза седалищного нерва, площади среза без эпиневрия и самого эпиневрия. Полученное процентное соотношение размерных групп миелиновых нервных волокон отличается от результатов авторов [35], проводивших подсчет нервных волокон по площадям.

В обеих экспериментальных группах через 14 нед после операции в области тубулирования отмечалось значительное увеличение общего количества нервных волокон по сравнению с нормой. По мнению авторов [37, 38], подобный факт может быть связан с мультипликацией регенерирующих нервных волокон при переходе из проксимальной культи в область травмы. Обнаружена также тенденция к измельчению миелиновых нервных волокон при преодолении проксимальной пограничной зоны в области тубулирования, на это же указывали в своих экспериментах авторы [39], используя другие виды кондуитов и проводя тотальный подсчет нервных волокон через 8 нед после операции. Однако в кондуите из фибрина (Тиссукол) обнаружено большее количество мелких миелиновых нервных волокон, что в итоге и отразилось на общем количестве проводников.

Отличия, выявленные в формировании регенерирующего нерва при разных видах тубулирования, обусловлены принципиальной разницей в структуре кондуитов. В состав фибринового клея входят фибриноген, фибронектин, которые являются компонентами межклеточного матрикса и способны стимулировать пролиферацию компонентов соединительной ткани [40, 41]. По-видимому, выраженное разрастание эпиневрия в эксперименте с Тиссуколом связано с выполнением фибриновым кондуитом функции ацеллюлярного матрикса для формирующегося эпиневрия, который впоследствии занимал толщину фибриновой трубки. Кроме того, отмечен спаечный процесс между кондуитом и окружающими тканями, что препятствовало естественной подвижности нерва в его ложе (туннельный синдром) и могло оказывать негативное влияние на формирование нерва.

Реперен — это пространственно сшитый полимер из олигомеров метакрилового ряда, в котором отсутствуют микропоры. Он обладает высокой степенью биосовместимости, биостабильности и инертности для организма, благодаря чему не подвергается старению и не вызывает спаечного процесса. Известно, что на его поверхности фибробласты пролиферируют монослоем, а это препятствует разрастанию соединительной ткани в 3D-формации и служит основой для предотвращения образования спаек [33]. Реперен также препятствует проникновению активно делящейся соединительной ткани сквозь его структуру в область травмы.

После тубулирования кондуитом из Тиссукола через 14 нед в дистальной культе наблюдается пучок нервных волокон, не имеющий четких границ, окруженный широким рыхлым эпиневрием. Периневральная оболочка не выражена. Подобное строение дистального участка восстановленного нерва крысы отмечали и авторы работы [27] при его тубулировании фибриновым кондуитом, но с диастазом в 1 см.

В обеих экспериментальных группах выявлено измельчение нервных волокон при переходе из области травмы в дистальную культю, что выражается в уменьшении количества крупных и средних нервных волокон. Кроме того, в случае применения фибрина выражена редукция общего количества нервных волокон при переходе их в дистальный отрезок из области тубулирования. Уменьшение общего количества нервных волокон при переходе из области тубулирования через 8 нед после операции отмечено и в работе [39]. Авторы тоже проводили тотальный подсчет нервных волокон.

Появление большого количества мелких нервных волокон в области тубулирования при использовании тиссуколового кондуита можно объяснить избыточным разрастанием эпиневрия и его васкуляризацией. При этом мелкие нервные волокна привлекаются для иннервации структур эпиневрия и остаются в пределах области травмы, сформировав там свои связи с новыми мишенями. Это может быть причиной дальнейшей редукции их количества при переходе в дистальную культю. Подобные наблюдения отмечены в работе [37].

Увеличение общего количества нервных волокон в дистальном отрезке по сравнению с нормой происходит в обеих экспериментальных группах. Однако общее количество миелиновых нервных волокон не изменяется при переходе из зоны тубулирования в дистальный отрезок при применении Реперена и уменьшается в случае использования Тиссукола. Это указывает на отсутствие мультипликации проводников при преодолении дистальной пограничной зоны в отличие от проксимальной.

При сравнительном анализе результатов применения Реперена и Тиссукола установлена зависимость клинических показателей поврежденной конечности в основном от морфологии дистальной части регенерировавшего седалищного нерва, а не от области его тубулирования. Структура нерва в области тубулирования имела существенные отличия и не коррелировала с клинической картиной оперированной конечности. Однако одинаковые количественные показатели нервных проводников в дистальной части нерва при использовании обоих видов кондуитов проявляются в схожих клинических показателях поврежденной конечности. Литературных данных по этому вопросу не обнаружено. В ряде работ, исследующих применение кондуитов на периферическом нерве [27, 39], также оценивалось морфологическое состояние дистальной части поврежденного нерва, но не обсуждалась корреляция морфологии поврежденного нервного ствола и клинических показателей конечности.

Заключение

Применение Реперена и Тиссукола для пластики периферических нервов показало различные принципы формирования нервных проводников и оболочек нерва. Структура восстановленного нерва в области травмы существенно отличается от нормы в обоих экспериментах. Однако количественные показатели дистальной части практически одинаковы при использовании обоих кондуитов на фоне стереотипной клинической картины, приближенной к норме. Вместе с тем оба материала отличаются существенными преимуществами и недостатками. Так, фибриновый кондуит резорбируется, но при этом формируется участок с выраженным спаечным процессом, что может приводить к развитию «туннельного синдрома». Кондуит из Реперена не резорбируется, но ограничивает спаечный процесс в области тубулирования и обеспечивает достаточную подвижность восстановленного нерва в своем ложе. Ограничением в использовании этого кондуита является только растущий организм. Следует отметить, что в экстренных случаях при разрыве нерва применение Реперена — более быстрый и безопасный способ, поскольку трубки из этого материала имеются разных диаметров, в стерильной упаковке. Тиссуколовый кондуит нужно изготовлять непосредственно перед операцией, что требует значительного количества времени и определенного оборудования.

Полученные результаты позволяют считать кондуит из нерезорбируемого материала Реперена перспективным для нейропластики периферических нервов наряду с резорбируемым кондуитом из Тиссукола.

Финансирование исследования. Работа не финансировалась какими-либо источниками.

Конфликт интересов. Авторы подтверждают отсутствие конфликтов интересов, о которых необходимо сообщить.