Биодеградация резорбируемых магниевых сплавов, перспективных для разработки эндопротезов, in vitro

Введение

Актуальной задачей современной ортопедии и травматологии является поиск материалов для разработки биоразлагаемых имплантатов, которые подвергаются биодеградации в организме пациента в период ремоделирования поврежденной костной ткани и не требуют повторной операции для их извлечения [1–4]. Особый интерес представляют металлические материалы, позволяющие создавать погружные биодеградируемые имплантаты и крепежные элементы заданной прочности. Одними из наиболее перспективных материалов являются магниевые сплавы. Они обладают приемлемой биосовместимостью и механическими свойствами, сопоставимыми со свойствами кортикальной кости [5–6]. Однако, как известно, магний имеет достаточно высокую скорость биодеградации в водосодержащих средах. Биодеградация сопровождается интенсивным выделением водорода, что может негативно сказываться на жизнедеятельности клеток, участвую­щих в репаративных процессах [7–8].

Изучению процессов деградации медицинских магниевых сплавов посвящено большое количество работ [9–11]. Наиболее распространенными являются иммерсионные испытания в различных средах [12], потенциодинамические испытания [13], анализ скорости газовыделения [14] и другие. Чаще всего они проводятся в статичной (неподвижной) среде, что не соответствует реальным условиям функционирования имплантата в организме. Для более адекватного моделирования процессов, происходящих в организме, следует осуществлять коррозионные испытания в условиях тока жидкости, т.е. в динамической среде. Кроме того, магниевые сплавы по своей природе склонны к питтингообразованию — неравномерной биодеградации с образованием локальных участков коррозии, что может повлечь за собой анизотропию механических свойств, преждевременную потерю изделием эксплуатационных характеристик и разрушение [15–17]. В связи с этим кроме оценки скорости деградации целесообразным представляется исследование характера распространения коррозии, а также глубины питтинговых ямок.

Цель исследования — изучение скорости и характера биодеградации магниевых сплавов в биологической среде при инкубации в статическом и динамическом режимах.

Материалы и методы

Материалами исследования послужили магниевый сплав WE43 (Mg-Y-Nd-Zr), содержащий редкоземельные элементы Y и Nd, и сплав Mg-Zn-Ca. Оба сплава изучали в исходном крупнозернистом (гомогенизированном) и упрочненном мелкозернистом (после обработки методом равноканального углового прессования (РКУП)) состояниях. Технологию обработки материалов, а также их механические характеристики описаны нами ранее в работе [18] — для сплава WE43 и в работе [19] — для сплава Mg-Zn-Ca.

Исследование процессов деградации проводили на образцах сплавов, имеющих форму ¼ части цилиндра радиусом ~0,5 см и высотой ~0,14–0,16 см. Перед началом испытаний образцы стерилизовали путем погружения их в этанол (70%) на 18 ч, а затем высушивали в асептических условиях. Образцы инкубировали в фетальной телячьей сыворотке (ФТС) (HyClon, Thermo Fisher Scientific, Великобритания), имитирующей химический состав внутренней среды организма при температуре 37 °С в статическом и динамическом режимах в течение 7 и 3 сут соответственно. Для каждого типа материала исследования производили не менее чем на 3 образцах.

Статический режим предполагал индивидуальную инкубацию каждого образца в 2 мл ФТС без контакта с атмосферным воздухом. При динамическом режиме образцы сплавов инкубировали в проточной ячейке, являющейся частью замкнутого стерильного контура с ФТС, циркулирующей под действием перистальтического насоса (Biomark, Inc., США) со скоростью 3,5 об./мин. Установку, поддерживающую динамический режим инкубации, помещали в CO₂-инкубатор (NUAir, США) на весь срок эксперимента. Все исследования проводили в соответствии с правилами асептики и антисептики с использованием стерильных сред и расходных материалов. После окончания эксперимента образцы отмывали от продуктов коррозии и тщательно высушивали. Изменение массы определяли путем взвешивания на электронных весах Ohaus PA64 (Ohaus Corporation, США). Скорость деградации рассчитывали по формуле:

где m₀ — исходная масса, г; m_f — конечная масса, г.

Исследование характера деструкции поверхности образцов проводили с помощью светового микроскопа Axiovert (Carl Zeiss, Германия).

Поверхностную коррозию и внутреннюю структуру образцов сплавов изучали на компьютерном томографе Philips Brilliance 16 (Philips, Нидерланды) при напряжении 140 кВ, силе тока 30 мA и толщине среза 0,8 мм. Рентгеновскую плотность образцов определяли по стандартизованной шкале Хаунсфилда (HU).

Колонизацию образцов сплавов клетками in vitro исследовали с помощью анализатора xCELLigence RTCA Systems (ACEA Biosciences, Inc., США), позволяющего регистрировать в каждой лунке специализированных планшетов клеточный индекс (СI), пропорциональный электрическому сопротивлению. Изучали по четыре образца сплава WE43 в исходном состоянии и после РКУП в форме квадратных пластин толщиной 2 мм и длиной 4 мм. Образцы стерилизовали погружением в 70% этанол на 4 ч, а затем размещали по одному в лунки планшета E-plate 16 (ACEA Biosciences, Inc.), содержащие по 200 мкл питательной среды RPMI-1640 («ПанЭко», Россия), дополненной 10% ФТС (HyClone, Thermo Fisher Scientific), 4 мM L-глу­тамина («ПанЭко») и 1% пенициллинa/стрептомицина («ПанЭко»), и инкубировали в анализаторе в течение 24 ч при 37 °С и 5% углекислого газа для определения базового значения CI.

Через 15 мин после начала инкубации образцы промывали в питательной среде и возвращали в соответствующие лунки планшета E-plate 16, в пустые лунки которого вносили по 20 мкл суспензии клеток, а затем во все лунки осторожно добавляли по 200 мкл питательной среды.

После полного удаления среды извлекали по два образца каждого сплава и наносили на их поверхность по 20 мкл клеток почек эмбриона человека линии HEK 293 (коллекция Национального медицинского исследовательского центра онкологии им. Н.Н. Блохина Минздрава России), ресуспендированных в питательной среде на основе RPMI-1640 в концентрации 8,4·10⁶ кл./мл. Инкубацию клеток и сплавов осуществляли 72 ч в CO₂-инкубаторе. CI регистрировали через 24, 48 и 72 ч после начала инкубации в лунках коинкубации сплава с клетками (CI (alloy + cells)) и в лунках инкубации сплава в бесклеточной среде (CI alloy). Значения CI в лунках инкубации клеток без сплавов считали контрольными.

Проведение экспериментов с использованием клеточных культур было одобрено локальным этическим комитетом Национального медицинского исследовательского центра онкологии им. Н.Н. Блохина Минздрава России.

Статистическая обработка данных. Статисти­чес­кий анализ полученных результатов проводили с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.0 (StatSoft Inc., США). Проверку внутригрупповых данных на нормальность распределения выполняли с помощью W-теста Шапиро–Уилка, оценивая результат p>0,05 как доказательство того, что анализируемое распределение не отличается от нормального. Описательную статистику каждого изученного критерия в пределах одной группы с нормальным распределением данных представляли в виде M±SD, где M — среднее арифметическое, SD — стандартное отклонение. Для оценки каждого критерия в пределах одной группы в экспериментах использовали три образца сплавов одного типа, инкубировавшихся в аналогичных условиях, результат измерения признаков каждого образца сплава учитывали в триплетах. Для определения статистической значимости различий количественных признаков при межгрупповом сравнении двух выборок результатов изменения состояния сплава в сравнении с гомогенизированным использовали односторонний t-тест Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при р≤0,05.

Результаты и обсуждение

Обработка сплавов методом РКУП приводит к увеличению скорости их деградации. После инкубации в ФТС относительная потеря массы гомогенизированных образцов Mg-Zn-Ca составила 0,31±0,10%, а образцов, обработанных РКУП, — 3,29±1,83% (p<0,05; рис. 1, а). Потеря массы образцов сплава WE43 в исходном состоянии составила 0,32±0,14%, а после РКУП — 2,77±1,66% (p<0,05; рис. 1, б). В динамических условиях наблюдалась сходная кинетика биодеградации. Потеря массы сплава Mg-Zn-Ca в гомогенизированном состоянии — 0,37±0,08%, а в упрочненном — 3,36±1,66% (p<0,05; см. рис. 1, а). Для сплава WЕ43 эти параметры до и после механической обработки РКУП составили 0,82±0,41 и 2,49±1,58% соответственно (см. рис. 1, б).

Рис. 1. Cкорость биодеградации сплавов Mg-Zn-Ca (а) и WE43 (б) в статическом режиме и в условиях тока жидкости; * — p<0,05

Повышение скорости биодеградации сплавов после РКУП, очевидно, связано с их структурными изме­нениями после механической обработки. Так, в работе [19] нами показано, что РКУП сплава Mg-Zn-Ca приводит к уменьшению размера зерна примерно в 10 раз. Однако структура магниевого сплава после деформации довольно неравномерна, что могло стать причиной ускорения процесса биокоррозии. Было высказано предположение, что сформировавшиеся частицы коррозионностойкой фазы Mg₄₁Nd₅ сплава WE43 могут действовать как микрокатоды, образуя многочисленные микрокоррозионные ячейки на поверхности материала, что приводит к более быстрой деградации менее коррозионностойкой матрицы, выступающей в качестве анода [20].

Как показано на рис. 1, значения потери массы исследуемых сплавов в обоих состояниях практически одинаковы при статических и динамических условиях. Однако стоит учитывать, что статические испытания проводились в течение 7 сут, в то время как динамические — только 3 сут. Ускорение процесса биодеградации при испытаниях в динамике может быть связано с тем, что поток жидкости препятствует образованию защитного слоя оксида и гидроксида магния на поверхности образцов [21].

На поверхностях образцов обоих сплавов после инкубации в ФТС наблюдалось неравномерное распространение биокоррозии. Однако исходный сплав WE43 отличался более равномерной биодеградацией и в статических, и в динамических условиях. При этом оба сплава после РКУП характеризовались большей степенью неравномерного повреждения поверхности (рис. 2). Осмотр образцов показал, что деградация во всех случаях носила краевой характер, т.е. преимущественно локализовывалась на краях образцов. При этом с увеличением времени инкубации от 3 до 7 сут процесс деградации охватывал все новые участки поверхности, а не распространялся вглубь. Такая деградация в целом не приводит к анизотропии прочности материала, что свидетельствует о перспективности использования магниевых сплавов для создания эндопротезов. Локальные участки глубокой коррозии с одиночными или множественными «питтинговыми ямками» способны вызывать анизотропию механических характеристик материала. Анизотропия прочности сплава может стать причиной поломки эндопротеза (имплантата или крепежного элемента) до этапа ремоделирования дефектов костной ткани. Обработка склонных к питтингообразованию магниевых сплавов методом РКУП способствует увеличению срока службы готового изделия. Улучшенные механические характеристики позволяют ультрамелкозернистому сплаву сохранять эксплуатационные свойства эндопротеза более длительное время в сравнении с гомогенизированными образцами, так как уменьшение толщины изделия в процессе коррозии не так критично сказывается на его прочности.

Рис. 2. Деградация образцов сплавов Mg-Zn-Ca и WE43 после инкубации в ФТС в статическом и динамическом режимах Фотографии получены методом световой микроскопии. Стрелками показана локальная коррозия сплава

Краевой характер деградации, отражающий изменение поверхности образцов и общего объема сплавов, был исследован на основании оценки рентгеновской плотности материалов (интактные образцы) до и после инкубации в ФТС (рис. 3, 4). Инкубация обоих сплавов не приводила к изменению их плотности, что может свидетельствовать о том, что в процессе деградации не происходит каких-либо изменений в объеме материалов. При этом образование «питтинговых ямок» отмечено только для сплава Mg-Zn-Ca после РКУП, инкубированного в статическом режиме.

Рис. 3. Рентгеновская плотность магниевых сплавов Mg-Zn-Ca и WE43 до и после инкубации в ФТС в статических и динамических условиях * — статистически значимые различия значений относительно исходного уровня CI интактных образцов (p<0,05); + — статистически значимые различия сплавов WE43 и Mg-Zn-Ca (p<0,05)

Рис. 4. Рентгеновские снимки образцов до и пос­ле де­градации

Отличия в рентгеновской плотности сплавов Mg-Zn-Ca и WE43 могут быть частично связаны с различными показателями их плотности (1,75 и 1,84 г/см³ для сплавов Mg-Zn-Ca и WE43 соответственно).

Результаты экспериментов по инкубации образцов сплавов с клеточной культурой в условиях in vitro показали, что характер деградации сплавов магния стимулирует быструю адгезию клеток к поверхности образцов с последующей их колонизацией. В частности, было установлено, что в результате 15-минутной коинкубации суспензии клеток со сплавами (alloy + + cells) на основе WE43 наблюдается фиксация на поверхности образцов количества клеток, достаточного для обеспечения достоверных отличий от базового уровня CI сплава в бесклеточной среде, на протяжении всего эксперимента (рис. 5). Учитывая описанные нами выше результаты, можно предположить, что клеточной адгезии способствует краевой характер деградации образцов в процессе 24-часовой преинкубации сплавов в питательной среде на основе RPMI-1640, предшествовавшей контакту с клетками. После обработки методом РКУП сплав WE43 стимулировал колонизацию своей поверхности клетками более интенсивно, чем в гомогенизированном состоянии: после 72 ч инкубации регистрировали CI 1,5±0,3 и 0,4±0,2 соответственно (p<0,05). Вероятно, это обусловлено ускоренной биодеградацией, придавшей микрорельефу поверхности образца WЕ43 после РКУП морфологию, более благоприятную для колонизации клетками, чем в случае гомогенизированного сплава.

Рис. 5. Колонизация клетками линии HEK 293 поверхности образцов сплава WE43 в гомогенизированном состоянии и после РКУП в сравнении с контролем (интактными клетками) Приведены результаты учета клеточного индекса в лунках коинкубации клеток со сплавами (CI (alloy + cells)) против значений в лунках инкубации образцов аналогичных сплавов в бесклеточной среде (CI (alloy)); * — статистически значимые различия значений относительно исходного уровня CI — контроля (p<0,05); + — статистически значимые различия значений сплавов WE43 после РКУП в сравнении с WE43 в гомогенизированном состоянии (p<0,05)

Таким образом, упрочнение магниевых сплавов Mg-Zn-Ca и WE43 методом РКУП приводит к ускорению процесса биодеградации. В динамическом режиме, имитирующем пребывание сплава в кровотоке, процесс биодеградации сплавов как в исходном состоянии, так и после РКУП ускоряется более чем в 2 раза в сравнении с эффектом инкубации в статическом режиме. Процесс деградации исследованных магниевых сплавов сопровождался формированием локальных очагов коррозии краевого характера. Считается, что краевая деградация не приводит к анизотропии прочностных характеристик сплавов [22], поэтому выявленная нами ускоренная биодеградация ультрамелкозернистых сплавов не является препятствием для их использования в ортопедии. Однако мы полагаем, что для более полной картины следует увеличить продолжительность коррозионных испытаний, чтобы уточнить характер биодеградации на более поздних стадиях инкубации. Повышенные в сравнении с гомогенизированными образцами прочностные характеристики позволяют рассматривать магниевые сплавы как перспективные материалы для создания эндопротезов. Этот вывод подтверждается результатами коинкубации сплавов на основе WE43 с клетками, демонстрирующими преимущественную стимуляцию клеточной адгезии и колонизации поверхности образцов WE43 после РКУП в сравнении с WE43 в исходном состоянии.

Заключение

Полученные данные о скорости и характере биодеградации магниевых сплавов Mg-Zn-Ca и WE43 (как в исходном гомогенизированном состоянии, так и после механической обработки посредством РКУП для получения ультрамелкозернистой структуры) свидетельствуют о перспективах использования этих материалов для создания биорезорбируемых ортопедических имплантатов и крепежных элементов. Результаты настоящей работы и ранее опубликованные исследования о биосовместимости сплавов магния позволяют перейти к экспериментальным испытаниям на лабораторных животных, чтобы выявить характер био­де­г­радации этих сплавов в условиях in vivo.

Финансирование исследования. Исследование проведено при финансовой поддержке гранта Российского научного фонда 18-45-06010.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.