Противоспаечное действие композиционных пленочных материалов на основе модифицированной гликолурилом натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы

Введение

В результате травматических повреждений внутренних органов, в том числе хирургических, в 64–100% случаев развивается спаечная болезнь. Лечение ее проводится исключительно хирургическим путем. Однако профилактические меры принимаются уже на этапе оперативных вмешательств на органах брюшной полости. Они заключаются в создании барьера вокруг внутренних органов с целью предотвращения образования спаек в послеоперационном периоде [1]. При этом оптимального с точки зрения цены и качества решения этой проблемы абдоминальной хирургии и гинекологии до сих пор не найдено.

В настоящее время существует ряд антиадгезионных средств барьерного типа [2] на основе икодекстрина [3, 4], политетрафторэтилена [5], гиалуроновой кислоты [6] и целлюлозы [7], которые не обладают достаточной эффективностью [8] и имеют ряд ограничений по применению (низкая скорость биодеградации [2], невозможность использования при перитоните [9] и т.д.). Кроме того, имеющиеся на отечественном рынке антиадгезионные средства (Interceed, Seprafilm, Adept и другие) не производятся на территории Российской Федерации.

На сегодняшний день для профилактики спаек в абдоминальной хирургии применяют малоинвазивные хирургические техники в сочетании с антиадгезионными барьерными средствами в присутствии различных био­совместимых веществ. Наиболее подходящим пленкообразующим материалом является натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы (Na-КМЦ). Это разновидность полимерного эфира целлюлозы, полученного из натуральной целлюлозы путем химической обработки:

Na-KМЦ хорошо растворяется в воде, образуя гель, она не токсична, не канцерогенна, не оказывает эмбриотоксического эффекта, включена в Государственный реестр лекарственных средств России под номером 68/333/16, а также в фармакопеи США и Европы. Na-КМЦ упоминается с середины 80-х гг. в экспериментальных работах, изучавших спайкообразование [10]. Показана ее эффективность в борьбе со спайками при использовании 1–3% растворов, причем ряд исследователей отмечают более выраженные антиспаечные свойства Na-КМЦ по сравнению с другими препаратами этого ряда [11, 12].

В то же время известно, что карбамидсодержащие гетероциклические соединения, в том числе гликолурил (2,4,6,8-тетраазабицикло[3.3.0]октан-3,7-дион) и его производные, используются в фармацевтических и косметических продуктах. Они обладают антибактериальными и противовоспалительными свойствами, стимулируют процессы регенерации тканей и пред­отвращают образование тромбов [13, 14]. Некоторые производные этих соединений склонны к полимеризации и образованию пленок на поверхности из-за большого количества сшивающих функциональных групп. Такое сочетание биологической активности и химических свойств позволяет считать их перспективными компонентами противоспаечных составов.

Цель исследования — разработка композицион­ных пленочных материалов на основе модифицированной гликолурилом натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы и оценка эффективности их противоспаечного действия.

Материалы и методы

Получение пленочных материалов. Компо­зи­цион­ные пленочные материалы получали из водных растворов гликолурила чистотой не менее 99,0% и концентрацией 0,01 и 0,05 масс. % по следующей технологии. На первом этапе готовили 500 г 0,5% раствора путем внесения навески (2,5 г), взвешенной на аналитических весах A&D HR-250AZG (A&D Company, Япония), в мерную колбу на 500 мл и доводили до метки дистиллированной водой. Далее 0,5% водный раствор разбавляли до концентрации 0,01 и 0,05 масс. % в стеклянных бюксах КШ 34/12 объемом 45 мл для получения общей массы каждого раствора 40 г. На втором этапе к 0,2 г пленкообразующего соединения — Na-КМЦ со средней мол. массой 250 кДа и степенью замещения 0,9 (Acros Organics, Бельгия) — добавляли водный раствор гликолурила в концентрации 0,01 или 0,05 масс. % до общей массы раствора 10 г и проводили гомогенизацию при комнатной температуре в течение 30 мин с помощью магнитной мешалки IKA RCT basic (IKA-Werke, Германия), снабженной встроенным терморегулятором при температуре 25°C. Растворы переносили в чашки Петри ЧБН-2 (100×20 мм по ГОСТ 23932-90) и сушили в вакуумном сушильном шкафу LT-VO/50 (Labtex, Россия) в течение 8 ч при температуре не более 25°C и остаточном давлении не более 50 мбар с использованием вакуумного насоса Buchi V-710, снабженного вакуум-контроллером Buchi V-850 (Buchi AG, Швейцария).

Толщину полученных пленок определяли с помощью микрометра МКЦ-25 (Россия) путем измерения среднего значения толщины в 5 точках образца.

Испытания пленок на растяжение проводили с использованием универсальной электромеханической машины Instron 3369 (Instron, Великобритания), оснащенной климатической камерой (300–523 K) и усовершенствованным видеоэкстензометром. Изучали образцы в форме прямоугольника шириной от 10 до 25 мм, длиной не менее 150 мм. Предельные отклонения по ширине образца не превышали ±0,2 мм. Образец помещали в захваты, обращая особое внимание на отсутствие перекосов между образцом и захватами (для выполнения условия соосности деформации) и проводили растяжение (не менее 3 повторений на каждый образец). Результаты измерений обрабатывали с помощью программного обеспечения Instron Bluehill и выводили в координатах «время, нагрузка, удлинение» с указанием условий проведения испытаний.

Исследование цитотоксичности пленочных ма­те­риалов. Оценку цитотоксичности образцов про­водили в соответствии с требованиями ГОСТ ISO 10993-5-2011 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 5. Исследования на цитотоксичность: методы in vitro» путем инкубации клеточной культуры мышиных фибробластов 3T3-L1 непосредственно с экстрактами из исследуемых пленок с использованием колориметрического теста, основанного на эндоцитозе прижизненного красителя нейтрального красного, находящегося в прямой зависимости от лизосомальной функции живых клеток [15].

Для приготовления экстрактов пленку размером 1,5×1,5 см в асептических условиях помещали в предварительно простерилизованный пенициллиновый флакон с 4 мл полной питательной среды (ППС — DMEM/F-12, 292 мг/л L-глутамин, 50 мг/л гентамицин, 10% FBS) и инкубировали в течение 24 ч при температуре 37°С (100% экстракт); 50% и 25% экстракты получали последовательным двукратным разведением 100% экстракта в ППС.

После пересева клеток на 96-луночный планшет в количестве 10 000 на лунку и достижения ими 80–90% конфлюентности среду удаляли, заменяли на экстракты (100 мкл) и помещали в CO₂-инкубатор на 24 ч. К контрольным клеткам вносили эквивалентный объем ППС. В качестве неспецифического положительного контроля в соответствующие лунки добавляли по 10 мкл 0,1% раствора детергента Тритон Х-100.

После инкубации экстракты из лунок удаляли, клетки отмывали однократно 200 мкл 1Х PBS и в каждую лунку вносили по 100 мкл ППС с нейтральным красным (40 мкг/мл). Планшеты помещали в термостат на 2 ч при 37°С. Затем инкубационную среду с красителем аккуратно удаляли, клетки однократно отмывали 200 мкл 1X PBS и в каждую лунку вносили по 150 мкл смеси 96% этанола, воды деионизованной и ледяной уксусной кислоты (50:49:1) для экстракции связавшегося красителя. Измерение оптической плотности проводили на спектрофотометре Tecan Sunrise (Tecan Group Ltd., Швейцария) при рабочей длине волны 540 нм (референс — 620 нм).

Жизнеспособность клеток рассчитывали как отношение живых клеток после инкубации с экстрактами к живым клеткам в контроле и представляли как процент жизнеспособных клеток.

Имплантация пленочных материалов. Экспе­ри­менты выполнены на 40 крысах-самках линии Wistar массой 240±20 г. Эксперименты на животных проводили в центре доклинических исследований Центральной научно-исследовательской лаборатории на базе Сибирского государственного медицинского университета (Томск) в полном соответствии с международными правилами «Guide for the Care and Use of Laboratory Animals» (National Research Council, 2011). Протоколы исследования составлены с соблюдением Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (Страсбург, 2006), и одобрены этическим комитетом Сибирского государственного медицинского университета.

Оперативные вмешательства на животных осуществляли под общей анестезией, включающей подкожное введение 0,1% раствора атропина сульфата (Московский эндокринный завод, Россия) в дозе 0,2 мг/кг и внутримышечное введение Золетила 100 (Virbac, Франция) в дозе 50 мг/кг.

Всем животным в стерильных условиях выполняли срединную лапаротомию (разрез длиной приблизительно 3 см) и моделировали плоскую спайку путем скарификации висцеральной брюшины на слепой кишке до появления «кровавой росы» и десерозирования левой вентральной стенки площадью 1 см², анатомически напротив расположения зоны скарифицирования слепой кишки [16, 17]. Для активизации спаечного процесса на десерозированную поверхность брюшной стенки подшивали две петли монофиламентной полипропиленовой нитью (ООО «Линтекс», Россия). У животных конт­рольной группы (n=10) поврежденную слепую кишку помещали обратно в брюшную полость вблизи ее поврежденной стенки без предварительной обработки. Животным трех опытных групп (n=10 в каждой) между поврежденными поверхностями прокладывали полученные пленки (3.4_0.05_ГУГК или 3.4_0.01_ГУГК) или референтный образец (Seprafilm, США) размером 1,5×1,5 см. В брюшную полость вводили 2 мл изотонического раствора хлорида натрия и послойно ушивали непрерывным швом монофиламентной полипропиленовой нитью (ООО «Линтекс») условным размером 5/0. Поверхность раны обрабатывали антисептиком и помещали животных в индивидуальные клетки. Общая продолжительность оперативного вмешательства составляла 50 мин.

На 8-е сутки после моделирования плоской спайки экспериментальных животных подвергали асфиксии СО₂. При некропсии вскрывали брюшную полость, визуально оценивали наличие спайки между брюшной стенкой и слепой кишкой. Процесс сопровождали фотофиксацией.

Статистическая обработка данных. Обра­бот­ку данных экспериментов in vitro проводили с использованием пакетов программ GraphPad Prism7 (GraphPad Software Inc., США) и SPSS 17.0 (IBM, США). Для всех данных применяли описательную статистику. Рассчитаны среднее значение и стандартное отклонение. На нормальность распределения данные проверяли с помощью теста Шапиро–Уилка. Для выявления достоверности различий при множественном сравнении был использован однофакторный дисперсионный анализ (one-way ANOVA) для группового сравнения, далее — критерий Даннета для попарных сравнений с контрольными значениями. Полученные результаты считали достоверными при уровне значимости p<0,05.

Результаты

В таблице представлены сводные данные по физико-механическим характеристикам полученных образцов композиционных пленочных материалов на основе Na-КМЦ, модифицированных гликолурилом, предназначенных для биологических исследований.

Характеристики композиционных пленочных материалов на основе Na-КМЦ, модифицированных гликолурилом, и коммерческого образца Seprafilm (США)

Установлено, что экстракты, полученные из пленочных материалов 3.4_0.01_ГУГК и 3.4_0.05_ГУГК, в концентрациях 100, 50 и 25% не оказывают цитотоксического действия на клеточную культуру мышиных фибробластов 3T3-L1 (рис. 1). Сопоставимое по влиянию на жизнеспособность клеточной культуры фибробластов действие изготовленных нами пленочных материалов с референтным образцом Seprafilm позволяет использовать их для оценки профилактики образования плоской спайки в экспериментах in vivo.

Рис. 1. Влияние пленочных материалов, модифицированных карбамидсодержащим гетероциклическим соединением (гликолурилом), и образца сравнения Seprafilm (США) на жизнеспособность клеточной культуры фиб­робластов 3T3-L1; р<0,05 при сравнении с Seprafilm

В экспериментах in vivo при тестировании противоспаечного средства барьерного типа у 8 из 10 животных контрольной группы зарегистрирован спаечный процесс и выявлено наличие плоской спайки между участком скарификации слепой кишки и десерозированной поверхностью брюшной стенки с подшитыми нитью петлями (рис. 2, а). При использовании пленки Seprafilm (рис. 2, б) плоские спайки в 100% случаев не регистрировались. При размещении в брюшной полости между поврежденными участками исследуемой пленки 3.4_0.01_ГУГК также не наблюдалось образования плоских спаек, при использовании пленки 3.4_0.05_ГУГК — в одном случае из десяти (рис. 2, в, г).

Рис. 2. Фотографии брюшной полости на 8-е сутки после моделирования плоской спайки между участком скарификации слепой кишки и десерозированной поверхностью брюшной стенки с подшитыми нитью петлями: а — контроль (стрелкой обозначена плоская спайка); б — имплантация образца сравнения Seprafilm; в — имплантация образца 3.4_0.01_ГУГК; г — имплантация образца 3.4_0.05_ГУГК; б–г — обведены места скарификации слепой кишки и десерозирования брюшной стенки с подшитыми нитями

Обсуждение

Брюшинные спайки — одна из сложнейших и до конца не решенных проблем абдоминальной хирургии [2, 18, 19], что обусловливает необходимость разработки и внедрения в практику новых методов профилактики спаечной болезни. Одним из способов уменьшения спаек является разделение участков поврежденной брюшины, предотвращение их соприкосновения с помощью мембран [2]. В последние десятилетия интерес исследователей вызывают так называемые противоспаечные «барьеры» на основе Na-КМЦ, применяемые для предотвращения образования соединительной ткани между поврежденными органами. Они создают гидрофлотацию или, фиксируясь на поврежденные поверхности, разделяют их и предотвращают образование спаек между ними [20]. При этом для достижения противоспаечного действия Na-КМЦ модифицируют различными соединениями [12, 21].

В нашем исследовании в качестве модификатора Na-КМЦ было использовано карбамидсодержащее гетероциклическое соединение — гликолурил, которое позволило придать целевым пленкам улучшенные физико-механические характеристики и обеспечить противоспаечное действие, сопоставимое с эффектом референтной пленки Seprafilm, применяемой в клинической практике, в том числе для интраперитонеального размещения. При этом наша модификация не приводила к цитотоксичности.

Заключение

Модификация Na-КМЦ гликолурилом позволила создать пленки 3.4_0.01_ГУГК и 3.4_0.05_ГУГК, которые обладают подходящими физико-механическими свойствами, не оказывают цитотоксического действия и препятствуют образованию плоской спайки при экспериментальном моделировании спаечного процесса в брюшной полости. Полученные пленки перспективны для профилактики спаек как средства барьерного типа.

Финансирование исследования. Исследование выполнено при финансовой поддержке Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014–2020 гг.» (соглашение №05.604.21.0251, уникальный идентификатор работ (проекта) RFMEFI60419X0251).

Конфликт интересов отсутствует.