Экспрессия маркеров апоптоза Всl-2 и Вах в сосудистой стенке

Э.А. Климентова, И.А. Сучков, А.В. Щулькин, А.П. Глазкова, Р.Е. Калинин

Ключевые слова: атеросклеротическая бляшка; белки апоптоза; белки Вах и Всl-2; атеросклероз артерий нижних конечностей; холестерин.

Цель исследования — оценить экспрессию белков Всl-2 и Вах, их соотношение и связь с уровнем холестерина сыворотки крови в гомогенате сосудистой стенки у пациентов с облитерирующим атеросклерозом артерий нижних конечностей (ОААНК) III–IV стадии.

Материалы и методы. В исследование вошли 32 пациента с ОААНК III–IV стадии. У пациентов забирали интраоперационный материал, представляющий собой все три слоя сосудистой стенки. Образцы артериальной стенки вместе с атеросклеротической бляшкой (АТБ) были взяты при выполнении первичных открытых операций на магистральных артериях нижних конечностей. В качестве контроля использовали образцы сосудистой стенки артерий без видимых признаков атеросклероза. На основании ультразвуковой характеристики структуры АТБ пациенты были разделены на две группы: со смешанной эхогенностью и с гиперэхогенными (кальцинированными) АТБ. Образцы сосудов измельчали и готовили гомогенаты сосудистой стенки. Измеряли уровни Всl-2, Вах и холестерина.

Результаты. В артериальной стенке без атеросклеротических изменений уровень антиапоптотического белка Всl-2 cоставил 1,25 нг/мг, проапоптотического белка Вах — 4,7 нг/мг. В стенке артерий с АТБ со смешанной эхогенностью экспрессия Всl-2 составила 1,8 нг/мг (р=0,143), Вах — 5,1 нг/мг (р=0,834) без статистически значимых отличий от уровня в неизмененном участке сосуда. В стенке артерий в области гетерогенной кальцинированной АТБ экспрессия Всl-2 составила 0,9 нг/мг (р=0,143), Вах — 6,8 нг/мг, при этом уровень белка Вах был статистически значимо (р=0,02) повышен в сравнении с его уровнем в стенке без видимых признаков атеросклероза. В АТБ с преобладанием гиперэхогенного компонента при сравнении с АТБ со смешанной эхогенностью экспрессия Всl-2 была статистически значимо (р=0,036) снижена, а экспрессия Вах — повышена (р=0,036). У пациентов с гиперэхогенной АТБ выявлена обратная корреляция между значениями Вах и Всl-2 (r=–0,315) и прямая взаимосвязь между экспрессией Вах и уровнем холестерина в сыворотке крови (r=0,617).

Заключение. В гиперэхогенных (кальцинированных) АТБ экспрессия антиапоптотического белка Всl-2 снижена, а проапоптотического белка Вах — повышена, что свидетельствует об активации системы апоптоза в прогрессирующих атеросклеротических поражениях. У пациентов с такими АТБ повышенный уровень холестерина прямо коррелирует с повышенной экспрессией проапоптотического белка Вах (r=0,617).

Введение

Большое количество людей в развитых странах мира страдают от атеросклеротического поражения коронарных, сонных и периферических артерий, а развитие атеротромботических осложнений остается основной причиной летальных исходов [1–4].

Важную роль в поддержании физиологического клеточного гомеостаза отводят системе апоптоза. Нарушение регуляции апоптоза связывают с инфекционными и онкологическими заболеваниями, а также с атеросклерозом [5]. Развитие атеросклероза вызывается накоплением окисленных липопротеинов низкой плотности (оЛПНП), воспалительных цитокинов в сосудистой стенке, а также может быть обусловлено апоптозом макрофагов, гладкомышечных клеток (ГМК) и эндотелиальных клеток [6]. N. Werner и соавт. [7] показали, что увеличение количества апоптотических микрочастиц приводит к развитию тяжелой эндотелиальной дисфункции вследствие повышенной проницаемости эндотелия с последующей миграцией воспалительных клеток и пролиферацией ГМК. Авторы [8] установили, что уменьшение уровня микроРНК-34a облегчает рост эндотелиальных клеток и ингибирует апоптоз клеток в атеросклеротической бляшке (АТБ) путем активации антиапоптотического белка Bcl-2 — это предполагает многообещающие возможности терапии атеросклероза.

Известно, что погибшие клетки являются основным компонентом АТБ и могут составлять до 80% от общей структуры. Разрыв фиброзной покрышки АТБ в области «некротического ядра» может быть причиной развития тромбоза, ведущего к ишемии органов и тканей. Основные исследования по изучению системы апоптоза клеток сосудистой стенки были проведены на животных. Доказано, что на ранних стадиях атеросклероза апоптоз клеток уравновешивает их пролиферацию. На поздних стадиях заболевания апоптоз ГМК и макрофагов начинает преобладать, приводя к увеличению богатых липидами некротических областей [9].

Семейство белков Вcl-2 является одним из основных участников системы апоптоза, регулирующих проницаемость мембран митохондрий. Все белки данного семейства разделяются на проапоптотические (Вах, Bak и др.) и антиапоптотические (Всl-2 и др.). От соотношения между ними будет зависеть, подвергнется клетка гибели или нет. После получения соответствующего сигнала белки Bax или Bak подвергаются конформационным изменениям и перемещаются в митохондриальную мембрану, где вызывают выделение цитохрома С в цитозоль [10, 11].

Существуют исследования поведения белков Вcl-2 и Bax в коронарных и сонных артериях животных. Работ, посвященных экспрессии данных белков в гомогенате сосудистой стенки у пациентов с облитерирующим атеросклерозом артерий нижних конечностей (ОААНК) и триггеров их активации, при поиске в известных базах данных мы не нашли. Однако изучение соотношения белков апоптоза у таких больных могло бы дать дополнительную информацию о патогенезе атеросклероза и его осложнений.

Цель исследования — оценить экспрессию белков Всl-2 и Вах, их соотношение и связь с уровнем холестерина сыворотки крови в гомогенате сосудистой стенки у пациентов с ОААНК III–IV стадии.

Материалы и методы

В исследование вошли 32 пациента мужского пола с ОААНК III–IV стадии, которые находились на лечении в отделении сосудистой хирургии Областной клинической больницы Рязани. Средний возраст их составил 63,4±7,9 года. Всем пациентам проводилась традиционная лабораторная и инструментальная диагностика (ангиография и ультразвуковое дуплексное исследование артерий нижних конечностей) при поступлении в стационар.

После подписания информированного согласия у пациентов при выполнении первичных открытых операций на магистральных артериях нижних конечностей забирали интраоперационный материал, представляющий собой все три слоя сосудистой стенки с АТБ. В качестве контроля (n=12) использовали образцы артерий (их сосудистой стенки), полученные во время эксплантации органов от посмертных доноров без ОААНК.

На основании ультразвуковой характеристики структуры АТБ пациенты были разделены на две группы: со смешанной эхогенностью (1-я группа, n=16) и с гиперэхогенными (кальцинированными) АТБ (2-я группа, n=16) (табл. 1).

Таблица 1. Характеристика исследуемых образцов

Образец сосуда измельчали и готовили гомогенат с помощью лизирующего буфера (Thermo Fisher Scientific, США) и роторного высокоскоростного гомогенизатора Diax 900, насадка 6G (Heidolph, Германия) со скоростью 24 000 об./мин в течение 60 с при температуре 2°C. Полученный гомогенат центрифугировали при 1000 g в течение 10 мин при температуре 2°C. В получившемся супернатанте методом иммуноферментного анализа определяли количество протеина Bcl-2 с помощью коммерческого набора Thermo Fisher Scientific и уровень Baх (Bcl-2 Associated X Protein) с помощью набора Cloud-Clone Corporation (Китай, США). Затем показатели пересчитывали на содержание белка, которое оценивали по методу Бредфорда с помощью набора Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit (Thermo Fisher Scientific).

Статистический анализ данных проводили с использованием пакета программ Statistica 10.0. В связи с отклонением от нормального распределения данных (использовался критерий Шапиро–Уилка, р<0,05) для дальнейшего анализа применяли непараметрические тесты: для сравнения двух зависимых групп — тест Вилкоксона, для сравнения двух независимых групп — U-критерий Манна–Уитни, в качестве корреляционного использовали тест Спирмена. Результаты считали статистически значимыми при р<0,05.

Результаты

Наше исследование показало, что в артериальной стенке без атеросклеротических изменений (контрольная группа) уровень Всl-2 cоставляет 1,25 нг/мг, Вах — 4,7 нг/мг, соотношение Всl-2 и Вах — 0,26. Уровень холестерина в сыворотке крови составил 4,2 ммоль/л.

В стенке артерий в области АТБ со смешанной эхогенностью количество антиапоптотического белка Всl-2 составило 1,8 нг/мг, Вах — 5,1 нг/мг, соотношение Всl-2 и Вах — 0,3. Уровень холестерина — 4,4 ммоль/л. Статистически значимых отличий от уровня холестерина и количества данных белков в артериальной стенке без признаков атеросклероза не отмечено.

В стенке артерий в области гетерогенной (кальцинированной) АТБ экспрессия Всl-2 составила 0,9 нг/мг, Вах — 6,8 нг/мг, соотношение Всl-2 и Вах — 0,13. Уровень холестерина составил 7,0 ммоль/л и был статистически значимо выше, чем у пациентов контрольной группы (р<0,05). Уровень белка Вах был статистически значимо (р<0,05) повышен в сравнении с его уровнем в артериальной стенке без видимых признаков атеросклероза (табл. 2).

Таблица 2. Уровни белков Всl-2, Вах в гомогенате сосудистой стенки и холестерина в сыворотке крови (Me [Q1; Q3])

В АТБ с преобладанием гиперэхогенного компонента экспрессия Всl-2 была статистически значимо (р<0,05) снижена, а экспрессия Вах (р<0,05) — повышена в сравнении с их экспрессией в АТБ со смешанной эхогенностью.

У пациентов с гиперэхогенной (кальцинированной) АТБ при проведении корреляционного анализа выявлена обратная корреляция между значениями Вах и Всl-2 (r=–0,315; рис. 1) и прямая взаимосвязь между экспрессией Вах и уровнем холестерина в сыворотке крови (r=0,617; рис. 2).

Рис. 1. Обратная корреляционная взаимосвязь между значениями Вcl-2 и Вах у пациентов с гиперэхогенной (кальцинированной) атеросклеротической бляшкой

Рис. 2. Корреляционная взаимосвязь между значениями Вах и уровнем холестерина у пациентов с гиперэхогенной (кальцинированной) атеросклеротической бляшкой

Обсуждение

В ходе нашего исследования было определено количество белков Всl-2 и Вах в неизмененной артериальной стенке периферических артерий человека. В норме клетки неповрежденного сосуда демонстрируют высокоэффективный клиренс апоптотических тел фагоцитами и соседними клетками без развития воспалительной реакции, что создает условия для нормального развития и функционирования [12].

При атеросклеротическом поражении уровни этих белков изменяются по-разному. В гиперэхогенной (кальцинированной) АТБ уровень Всl-2 снижен, а уровень белка Вах повышен в сравнении с их уровнем в АТБ со смешанной эхогенностью. Это связано с тем, что апоптоз клеток внутри АТБ приводит к ремоделированию сосудистой стенки, высвобождению IL-1 и IL-8, активации моноцит-хемоаттрактантных белков, повышению протромбогенного статуса путем активации тромбина. Полученные данные согласуются с результатами исследований на животных [13, 14], которые показали, что на ранних стадиях атеросклеротического поражения количество клеток, подвергающихся апоптозу, составляет около 10% и увеличивается по мере прогрессирования заболевания. Проапоптотические маркеры Fas, каспаза-3 были локализованы в эндотелии и ГМК медии ближе к внутреннему просвету сосуда. Антиапоптотический белок Bcl-2 был обнаружен в макрофагах и ГМК в более глубоких слоях сосудистой стенки.

Проведенное исследование показало, что повышенный уровень проапоптотического белка Вах связан с отложением кальция в бляшках. Это обусловлено тем, что матричные везикулоподобные структуры в бляшках являются апоптотическими остатками, которые должны быть быстро очищены соседними фагоцитами. В преимущественно бесклеточном липидном ядре АТБ фагоцитоз апоптотических клеток может быть нарушен из-за присутствия оЛПНП, которые конкурируют с ними за связывание с фагоцитами. Нефагоцитозированные апоптотические клетки могут подвергнуться вторичному некрозу, который в последующем кальцинируется.

Нужно отметить, что сами апоптотические тельца могут концентрировать и связывать кальций. В современной литературе мы встретили только одно исследование по данной проблеме. D. Proudfoot и соавт. [15] в эксперименте in vitro показали, что применение ингибитора каспаз может уменьшать кальцификацию клеток в АТБ.

Полученная корреляционная связь между уровнями Вах и холестерина показывает, что повышенное количество холестерина играет важную роль в запуске митохондриального пути апоптоза. Холестерин входит в состав клеточной мембраны и при повышенных количествах изменяет ее проницаемость, способствуя также дестабилизации и разрыву лизосом, что в свою очередь вызывает гибель клеток. Кроме того, проапоптотическое действие холестерина может быть обусловлено снижением антиоксидантных ферментов (супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы) при повышении генерации активных форм кислорода. Согласно данным исследования [16], оЛПНП приводят к активации рецепторного пути апоптоза c последующей активацией каспаз и проапоптотического белка р53. Наше исследование доказало, что повышенный уровень холестерина в сыворотке крови пациентов с ОААНК способствует активации маркеров митохондриального пути гибели клеток, а именно белков семейства Bcl-2.

Для повышения точности и надежности прогнозирования прогрессирования атеросклеротического поражения в сосудистой стенке и поиска возможных медикаментозных способов коррекции необходимы дальнейшие исследования белков апоптоза и их взаимосвязи с уровнем холестерина в сыворотке крови.

Заключение

Экспрессия антиапоптотического белка Всl-2 снижена, а проапоптотического белка Вах — повышена в гиперэхогенных (кальцинированных) АТБ, что свидетельствует об активации системы апоптоза в прогрессирующих атеросклеротических поражениях.

Повышенное количество холестерина в сыворотке крови пациентов с облитерирующим атеросклерозом артерий нижних конечностей связано с активацией митохондриального пути апоптоза в кальцинированных атеросклеротических бляшках.

Финансирование исследования. Работа не получала финансовой поддержки.

Конфликты интересов, связанные с данным исследованием, отсутствуют.

Литература

Марченко А.В., Вронский А.С., Мялюк П.А., Каменских М.С. Исторические аспекты и современное состояние проблемы лечения сочетанного атеросклеротического поражения коронарных и сонных артерий. Комплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний 2020; 9(1): 74–81.
Стрельникова Е.А., Трушкина П.Ю., Суров И.Ю., Короткова Н.В., Мжаванадзе Н.Д., Деев Р.В. Эндотелий in vivo и in vitro. Часть 1: гистогенез, структура, цитофизиология и ключевые маркеры. Наука молодых (Eruditio Juvenium) 2019; 7(3): 450–465, https://doi.org/10.23888/hmj201973450-465.
Калинин Р.Е., Сучков И.А., Мжаванадзе Н.Д., Демихов В.Г., Журина О.Н., Климентова Э.А. Показатели гемостаза у пациентов с атеросклерозом периферических артерий при реконструктивно-восстановительных операциях. Хирургия. Журнал им. Н.И. Пирогова 2018; 8: 46–49, https://doi.org/10.17116/hirurgia2018846.
Пшенников А.С., Деев Р.В. Морфологическая иллюстрация изменений артериального эндотелия на фоне ишемического и реперфузионного повреждений. Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова 2018; 26(2): 184–194.
Paone S., Baxter A.A., Hulett M.D., Poon I.K.H. Endothelial cell apoptosis and the role of endothelial cell-derived extracellular vesicles in the progression of atherosclerosis. Cell Mol Life Sci 2019; 76(6): 1093–1106, https://doi.org/10.1007/s00018-018-2983-9.
Gonzalez L., Trigatti B.L. Macrophage apoptosis and necrotic core development in atherosclerosis: a rapidly advancing field with clinical relevance to imaging and therapy. Can J Cardiol 2017; 33(3): 303–312, https://doi.org/10.1016/j.cjca.2016.12.010.
Werner N., Wassmann S., Ahlers P., Kosiol S., Nickenig G. Circulatin CD31+/annexin V+ apoptotic microparticles correlate with coronary endothelial function in patients with coronary artery disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2006; 26(1): 112–116, https://doi.org/10.1161/01.atv.0000191634.13057.15.
Su G., Sun G., Liu H., Shu L., Liang Z. Downregulation of miR-34a promotes endothelial cell growth and suppresses apoptosis in atherosclerosis by regulating Bcl-2. Heart Vessels 2018; 33(10): 1185–1194, https://doi.org/10.1007/s00380-018-1169-6.
Garratt K.N., Edwards W.D., Kaufmann U.P., Vlietstra R.E., Holmes D.R. Jr. Differential histopathology of primary atherosclerotic and restenotic lesions in coronary arteries and saphenous vein bypass grafts: analysis of tissue obtained from 73 patients by directional atherectomy. J Am Coll Cardiol 1991; 17(2): 442–448, https://doi.org/10.1016/s0735-1097(10)80113-5.
Калинин Р.Е., Сучков И.А., Климентова Э.А., Егоров А.А., Поваров В.О. Апоптоз в сосудистой патологии: настоящее и будущее. Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова 2020; 28(1): 79–87.
Singh R., Letai A., Sarosiek K. Regulation of apoptosis in health and disease: the balancing act of BCL-2 family proteins. Nat Rev Mol Cell Biol 2019; 20(3): 175–193, https://doi.org/10.1038/s41580-018-0089-8.
Clarke M.C., Figg N., Maguire J.J., Davenport A.P., Goddard M., Littlewood T.D., Bennett M.R. Apoptosis of vascular smooth muscle cells induces features of plaque vulnerability in atherosclerosis. Nat Med 2006; 12(9): 1075–1080, https://doi.org/10.1038/nm1459.
Norata G.D., Tonti L., Roma P., Catapano A.L. Apoptosis and proliferation of endothelial cells in early atherosclerotic lesions: possible role of oxidised LDL. Nutr Metab Cardiovasc Dis 2002; 12(5): 297–305.
Akishima Y., Akasaka Y., Ishikawa Y., Lijun Z., Kiguchi H., Ito K., Itabe H., Ishii T. Role of macrophage and smooth muscle cell apoptosis in association with oxidized low-density lipoprotein in the atherosclerotic development. Mod Pathol 2005; 18(3): 365–373, https://doi.org/10.1038/modpathol.3800249.
Proudfoot D., Skepper J.N., Hegyi L., Bennett M.R., Shanahan C.M., Weissberg P.L. Apoptosis regulates human vascular calcification in vitro: evidence for initiation of vascular calcification by apoptotic bodies. Circ Res 2000; 87(11): 1055–1062, https://doi.org/10.1161/01.res.87.11.1055.
Chen Y., Zhou H., He C., Wang T., Zhang G., Zhang P., Wang R., Wu Q., Yao Y. The oxLDL/β2GPI/anti-β2GPI antibody complex induces apoptosis of human umbilical vein endothelial cells by promoting the production of reactive oxygen species. Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi 2019; 35(3): 223–229.