Биосовместимость и костная интеграция титановых имплантатов различной пористости с кальций-фосфатным покрытием и без покрытия

Введение

Производство имплантатов суставов с использованием аддитивных технологий позволяет формировать индивидуальные изделия сложной формы, сочетающие высокие физико-механические и медико-биологические свойства. Развитие аддитивных технологий открывает практикующим ортопедам и травматологам широкие возможности для восстановления функции поврежденной костной ткани [1].

Титан обладает высокой прочностью и хорошей био­логической совместимостью с тканями при имплантации [2, 3]. Индивидуальные имплантаты, изготовленные из титана и его сплавов методом 3D-печати, позволяют замещать сложные костные дефекты, в том числе благодаря возможности регулирования размера и формы пор при их производстве, а также общей открытой пористости [2–6].

При экспериментальном замещении монокортикального диафизарного дефекта бедра животных отмечены высокие остеокондуктивные свойства 3D-пористого материала на основе фосфата кальция и его способность к биодеградации [7]. Однако изделия, полностью изготовленные из материала на основе трикальциевого фосфата, не обладают достаточными прочностными свойствами и не подходят в качестве имплантатов суставов.

Известно, что кальций-фосфатные покрытия, сформированные методом микродугового оксидирования (МДО) на поверхности титановых имплантатов, существенно улучшают остеоиндуктивные свойства изделий, используемых для накостного и чрескостного остеосинтеза [8, 9]. В то же время применение таких имплантатов, полученных методом 3D-печати, в широкой клинической практике ограничено. Установлено, что процесс интеграции имплантата с костной тканью, а также его остеоиндуктивные и остеокондуктивные свойства во многом определяются размером пор и химическим составом поверхности имплантата [10–13]. Благодаря регуляции этих параметров можно управлять процессом гистогенеза тканей. Однако открытыми остаются вопросы влияния размера пор и кальций-фосфатного покрытия в индивидуальных титановых имплантатах на способность интеграции с костной тканью. Ответы на них помогут определить характеристики материала для производства имплантатов с наиболее оптимальными свойствами, что позволит достичь прочной первичной и в последующем — вторичной фиксации.

Цель данной работы — изучить влияние размера пор и наличия биологически активного кальций-фосфатного покрытия в пористых титановых имплантатах на процесс интеграции с костной тканью.

Материалы и методы

Образцы имплантатов цилиндрической формы с тремя различными диаметрами пор (100, 200 и 400 мкм) получали на 3D-принтере Arcam (Швеция) по технологии электронно-лучевой плавки (electron beam melting) из титанового порошка. Все образцы имели упорядоченную гексагональную структуру с расположением наружных страт вдоль оси имплантата. Чтобы исключить scratch-fit-эффект при фиксации имплантатов, их создавали без агрессивного шероховатого покрытия на поверхности. Кальций-фосфатное покрытие толщиной 20±4 мкм наносили на часть образцов методом МДО [8] на опытной установке в Национальном исследовательском Томском политехническом университете. Далее проводили стерилизацию влажным паром при температуре 134°С в течение 5 мин по ГОСТ Р ИСО 17665-1 с последующей укладкой образцов в тройную стерильную упаковку. Цитотоксичность изучали по ГОСТ Р ИСО 10993.5 на модели in vitro (тестовая культура — диплоидые фибробласты человека).

Исследования in vivo проведены в отделении экспериментальной медицины с виварием Приволжского исследовательского медицинского университета (Н. Новгород) на 36 самцах кроликов породы советская шиншилла в возрасте 6±1 мес с массой тела 4675±258 г. Эксперимент был одобрен Этическим комитетом Приволжского исследовательского медицинского университета.

Животные были разделены на 6 групп в соответствии с образцами костных имплантатов (табл. 1). Диаметр основания образцов — 3,2 мм, высота — 8 мм.

---

Таблица 1. Характеристика образцов имплантатов

---

Согласно общепринятым этическим нормам («Guide for the Care and Use of Laboratory Animals» (National Research Council, 2011), а также в соответствии с этическими принципами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (Страсбург, 2006), все болезненные манипуляции осуществляли под общим и местным обезболиванием.

После обработки операционного поля антисептическими средствами выполняли разрез кожных покровов в проекции наружного мыщелка бедренной кости и разведение мягких тканей. При помощи дрели и сверла диаметром 3 мм перпендикулярно оси бедра формировали стандартизированный костный дефект цилиндрической формы, соответствующий размеру образца имплантата. В образовавшийся дефект имплантировали костный образец, после чего операционную рану санировали и послойно ушивали. Проводили рентгеноконтроль с использованием C-дуги (установка рентгенодиагностическая хирургическая передвижная РТС-612 v. 4.2, Россия). В послеоперационном периоде в течение 10 дней выполняли перевязки и осуществляли контроль операционной раны. Через 90 и 180 сут после имплантации животных выводили из эксперимента с забором участков бедренных костей в зоне непосредственного контакта с образцами имплантатов.

Дальнейшую подготовку экспериментального материала для исследований осуществляли с использованием оборудования производства компании Thermo Fisher Scientific (США). После фиксации участков бедренных костей в 10% формалине и декальцинации образцы имплантатов осторожно удаляли из костной ткани и отправляли на электронную микроскопию, а костную ткань — в стандартную гистологическую проводку на аппарате Excelsior ES. Далее осуществляли заливку в парафиновые блоки с использованием заливочной станции HistoStar. Серийные срезы толщиной 4–6 микрон получали на микротоме Microm HM 325. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином при помощи станции для окраски Gemini AS.

Для морфометрической обработки использовали микроскоп Leica 2500 (Leica Microsystems, Германия). При гистологическом исследовании оценивали морфологические изменения костной ткани.

Электронно-микроскопические исследования об­раз­цов имплантатов были выполнены в центре коллективного пользования «Новые материалы и ресурсосберегающие технологии» Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского на сканирующем электронном микроскопе JSM-IT300LV (JEOL, Япония) в режиме высокого вакуума и при низких значениях тока зонда (<0,1 нА), чтобы уменьшить воздействие электронного пучка на исследуемые образцы (диаметр электронного зонда до 3 нм). Фотодокументирование осуществляли на увеличениях от 27–30 (для обзорных изображений) до 2500–3700 (для оценки поверхности имплантатов с покрытием и без покрытия, а также пор и отдельных информативных включений в структуре поверхности исследуемых образцов).

При микроскопическом исследовании образцов имплантатов проводили полуколичественную морфометрическую оценку изменений костной ткани с использованием четырехбалльной оценочной шкалы. При оценке воспалительной реакции препарату присуждали баллы от 0 (нет признаков воспаления) до 3 (выраженное воспаление); при оценке васкуляризации — от 0 (нет признаков) до 3 (выраженная васкуляризация); при оценке интенсивности остеогенеза — от 0 (нет признаков остеогенеза) до 3 (интенсивно выраженный остеогенез, большая площадь занята зрелой костной тканью); при оценке склерозирования — от 0 (нет признаков) до 3 (выраженное склерозирование). Глубину прорастания костной ткани в поры имплантата выражали в относительных единицах: 0 — прорастание отсутствует, 1 — слабое прорастание, 2 — умеренное прорастание, 3 — выраженное прорастание.

Статистический анализ. Ста­тис­ти­ческую обработку данных проводили c использованием программного обеспечения Microsoft Office Excel и Statistica 6.1. Результаты исследования обрабатывали методами непараметрической статистики: при парных сравнениях использовали критерий Манна–Уитни, при множественных сравнениях — критерий Краскела–Уоллиса. Различия между сравниваемыми группами считали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты и обсуждение

На модели in vitro установлено отсутствие цитотоксического действия материала, используемого для изготовления образцов. Результаты исследований in vivo показали, что у основной части экспериментальных животных все изучаемые параметры, включая общее состояние (вес, шерсть, кожный покров и т.д.), гематологические и биохимические показатели, на 90-е и 180-е сутки после имплантации образцов находились в пределах нормы.

При микроскопическом исследовании образцов имплантатов проводили полуколичественную морфометрическую оценку изменений костной ткани, результаты которой представлены в табл. 2.

---

Таблица 2. Полуколичественная морфометрическая оценка изменений костной ткани на разных сроках после установки образцов имплантатов, в баллах

---

Гистологическое исследование показало, что после имплантации образцов признаков воспаления периимплантатных тканей не обнаружено ни в одном случае. В группах 5 и 6 по периферии области внедрения имплантатов наблюдались зрелые костные трабекулы, распространенность которых была больше, чем при использовании изделий 1–4 (p<0,05). Склерозирование менее выражено при имплантации образцов 1, 2 и совсем не выражено у образцов 5, 6 (p<0,001) (рис. 1).

---

Рис. 1. Гистологическая картина периимплантатных тканей через 180 сут после установки образцов имплантатов Окраска гематоксилином и эозином, ×200

---

При электронно-микроскопическом исследовании образцов, изъятых через 90 сут после имплантации, отмечено, что в группах 1 и 2 поры заполнены по всей площади костными структурами различной степени зрелости, однако глубина их заполнения несколько ниже, чем в группах 3–6. В области внедрения имплантатов в группах 5, 6 по сравнению с другими группами зрелые трабекулы с четко выраженным остеоцитарным строением, присущим зрелой структуре, занимали бόльшую площадь (p<0,001). На сроке исследования 180 сут, площадь, занимаемая ново­образованной зрелой костной тканью в порах имплантатов, увеличилась: в группах 5, 6 увеличение площади было больше по сравнению с имплантатами из групп 1–4 (p<0,001). Обзорные электронно-микроскопические изображения и поверхность образцов имплантатов представлены на рис. 2.

---

Рис. 2. Обзорный вид образцов имплантатов через 180 сут после установки Наличие массивного слоя новообразованной кости на поверхности имплантата; электронная микроскопия, ×30

---

При сравнительной характеристике имплантатов установлено, что у образцов с диаметром пор 100 и 200 мкм наличие или отсутствие покрытия не имеет значения, так как различий в гистологической структуре, интенсивности васкуляризации на ранних сроках и костеобразования на поздних сроках не выявлено. Образцы с диаметром пор 100 и 200 мкм на всех сроках исследования достаточно легко извлекались из костной ткани, так как глубина прорастания кости в поры имплантата была ниже, чем у образцов 5 и 6 (p<0,001). При диаметре пор 400 мкм отмечено различие между образцами 5 и 6 на различных сроках исследования, которое выражалось в более интенсивной остеоинтеграции в пользу образца номер 5, имеющего покрытие (p<0,001 и p<0,05 через 90 и 180 сут после имплантации соответственно).

Мнения различных авторов от­носительно биоразлагаемых каль­ций-фосфатных покрытий титановых имплантатов сходятся: покрытия существенно улучшают их остеоиндук­тивные свойства и способствуют остеогенезу [6, 8, 9, 14]. S.G. Kalinichenko и соавт. [14] изучали влияние на остеогенез биоразлагаемого покрытия из фосфата кальция и гидроксиапатита, нанесенного на титановые имплантаты методом плазменного электролитического оксидирования, при моделировании закрытого перелома бедренной кости крысы. Установлено, что био­разлагаемые покрытия имплантатов способствуют пролиферации и экспрессии генов BMP-2, VEGF и TGF-β2 и усиливают регуляторные эффекты факторов роста на разных стадиях репаративного остеогенеза. Авторы также заключили, что в условиях биомеханических нагрузок рельефная поверхность имплантата способствует прикреплению и удержанию на ней остеобластов. Фосфаты кальция являются источником биологически активных ионов, которые создают благоприятную химическую среду для остеогенных клеток и обеспечивают стабильность пролиферации клеток новообразованной костной ткани.

Нами показано, что наличие кальций-фосфатного покрытия не всегда улучшает остеогенез: у имплантатов с диаметром пор 100 и 200 мкм наличие или отсутствие покрытия не имеет значения. В свою очередь при диаметре пор 400 мкм наличие покрытия способствует более интенсивной остеоинтеграции.

Существуют разные мнения исследователей относительно оптимального размера пор для лучшей остеоинтеграции. Р.М. Тихилов с соавт. [5] исследовали костную и мягкотканную интеграцию пористых титановых имплантатов с размером пор 100–200 мкм. Такие изделия способствовали прорастанию кости на глубину 2–3 мм и обеспечивали хорошую фиксацию имплантата. Авторы считают данный диаметр пор оптимальным для интеграции как костной ткани, так и мягких тканей.

Другой группой исследователей [15] было установлено, что среди изучаемых ими пористых титановых имплантатов, изготовленных методом 3D-печати, показатели остеогенеза имплантатов с фактическим размером пор около 600 мкм превосходили показатели двух других групп с размерами пор 400 и 800 мкм.

Некоторые авторы делают выводы, что чем больше размер пор, тем лучше происходит остеоинтеграция. D. Zhao и соавт. [16] установили, что полилактидные скаффолды с крупными размерами пор показывают лучший результат регенерации костной ткани. Большой размер пор (2 мм) более благоприятен для обмена клетками и цитокинами между надкостницей и кортикальной костью. Кроме того, остеогенез и ангиогенез — два взаимосвязанных процесса, и жизнеспособность образованной костной ткани зависит от регенерации новых сосудов. Авторами показано, что васкуляризация новой кости усиливается с увеличением размеров пор. Однако механические свойства скаффолдов из полилактида постепенно снижались с увеличением диаметра пор. В нашем случае использование имплантатов из титанового сплава лишает их такого недостатка, как низкая прочность.

В исследовании A. Ilea и соавт. [17] титановые скаффолды с порами диаметром 800 нм показали лучшую остеоинтеграцию, чем скаффолды с порами размером 1000 нм. Сходные результаты были получены в работе F. Liu [18] с соавт. Авторы изучали остео­генез костных скаффолдов, изготовленных методом 3D-печати из фосфата кальция, обладающих пористостью 70% и крупными размерами пор — 0,8; 1,2 и 1,6 мм. Скаффолды имплантировали в дефект размером 8 мм, созданный в своде черепа новозеландских кроликов, и изучали через 4 и 8 нед после установки. Все скаффолды демонстрировали отличные механические свойства и обладали лучшей костеобразующей способностью, чем контроль, как через 4, так и через 8 нед. Среди них скаффолд с размером пор 800 мкм превосходил остальные по всем показателям косте­образования.

Вероятной причиной того, что результаты исследований относительно оптимального для остеоинтеграции размера пор разнятся, является то, что авторы представляют усредненный размер пор, не учитывая их взаимосвязь, общую пористость. В связи с этим консенсус относительно наиболее оптимальных поверхностных характеристик материалов для производства костных имплантатов не достигнут.

Заключение

Высокопористые титановые имплантаты, изготовленные методом аддитивных технологий, являются перспективными для восстановительной и ревизионной хирургии при замещении костных дефектов. Исследуемые образцы имплантатов обладают высокой биосовместимостью, цитотоксическое действие отсутствует. Наиболее оптимальными поверхностными характеристиками материала образцов имплантатов, стимулирующими остеоинтеграцию, являются диаметр пор 400 мкм и наличие кальций-фосфатного покрытия.

Финансирование исследования. Исследование проведено при финансовой поддержке ООО «ОСТЕОМЕД-М» (договор на выполнение научно-исследовательской работы №2246/2018).

Конфликт интересов. ООО «ОСТЕОМЕД-М» (Москва) занимается разработкой и производством имплантатов и инструментов для травматологии, ортопедии, эндопротезирования и спинальной хирургии. Влияния на результаты исследования ООО «ОСТЕОМЕД-М» не оказывало.