Асинхронная репликация биаллельно экспрессирующихся генов в лимфоцитах периферической крови человека как прогностический признак онкологических заболеваний

Введение

Проблема ранней диагностики злокачественных ново­образований у человека является чрезвычайно актуальной. В Российской Федерации в 2018 г. рак был впервые выявлен у 624 709 человек. Выявление онкологического заболевания на I–II стадиях позволяет с вероятностью около 80% добиться выздоровления пациента. Однако в России только примерно 55% диагнозов устанавливаются на этих стадиях [1]. Онкологическое заболевание выявляется либо при обращении лиц за медицинской помощью при появлении симптомов, либо при проведении скрининговых обследований, направленных на обнаружение такой патологии. В связи с этим методам скрининга придается большое значение. Они должны обладать высокими уровнями чувствительности, специфичности и точности, приближающимися к 100%, однако на практике далеко не каждый метод имеет такие показатели.

В настоящее время наиболее эффективные скрининговые программы существуют для выявления рака молочной железы, рака шейки матки и колоректального рака. Все более широко используется низкодозная спиральная компьютерная томография. Она характеризуется высокой чувствительностью, что значительно повышает вероятность выявления даже небольших опухолевых образований, но имеет низкую специфичность. Кроме того, организм пациента подвергается воздействию ионизирующего излучения, что само по себе является фактором риска развития рака. Из инструментальных методов в ранней диагностике рака следует также отметить ультразвуковую диагностику, которая наиболее доступна, проста и не имеет противопоказаний. В последнее время накоплен опыт, который расширяет границы возможностей УЗИ и позволяет выявить рак органов брюшной полости и щитовидной железы.

На доклинической стадии онкологическое заболевание выявить достаточно сложно. Поэтому в последние десятилетия все более активно в выявлении таких патологий используют молекулярно-генетические и цитогенетические методы. Данные методы позволяют обнаружить характерные для онкозаболеваний нарушения экспрессии генов и метилирования ДНК, мутации, структурные аберрации ДНК, а также нарушения процессов репликации. Результаты исследований нарушения времени репликации [2–6] указывают на то, что асинхронная репликация биаллельно экспрессирующихся генов часто сопровождает развитие рака.

В одной из первых работ по изучению асинхронной репликации биаллельно экспрессирующихся генов [7], выполненной на лимфоцитах периферической крови больных хроническим лимфоцитарным лейкозом и здоровых людей, показано, что уровень лимфоцитов с асинхронной репликацией генов (АРГ) у здоровых людей не превышал 14% как для гена TP53, так и для локуса 21q22, тогда как в группе больных этот показатель был в два раза больше и для гена, и для локуса. Позже аналогичные результаты были получены и у больных солидными опухолями. В работе [8] авторы показали, что в группе больных почечно-клеточными карциномами уровень лимфоцитов с АРГ для гена TP53 и локуса 21q22 составил 36 и 44% соответственно, а в группе здоровых лиц — 12 и 14%. В дальнейшем такие исследования проводились для других генов как у здоровых лиц, так и у онкологических больных [9].

Нами впервые в мире был изучен уровень лимфоцитов с АРГ для гена AURKA у клинически здоровых людей, неонкологических и онкологических больных с различными нозологиями.

Цель исследования — изучить уровень лимфоцитов с асинхронной репликацией генов для генов AURKA и TP53 у неонкологических и онкологических больных с различными нозологиями и оценить их диагностические возможности.

Материалы и методы

Обследованные группы. В исследовании участвовали следующие группы: контрольная и группа пациентов с онкологическими заболеваниями различных нозологий. В контрольную группу вошли 40 клинически здоровых доноров и 30 пациентов с различными неонкологическими заболеваниями в анамнезе: гастритом (6), панкреатитом (2), хроническим калькулезным холециститом (11), бронхиальной астмой (1), язвенной болезнью (1), паховой грыжей (4), артрозом (1), миомой (1), гепатитом (1), эпилепсией (1), хроническим простатитом (2), хроническим тонзиллитом (3), аденомой прямой кишки (1). У части пациентов было более одного заболевания. Всего обследовано 34 мужчины и 36 женщин в возрасте от 21 до 77 лет (средний возраст — 42 года).

В группу пациентов с онкологическими заболеваниями вошли 219 человек (123 мужчины и 96 женщин) в возрасте от 21 до 88 лет (средний возраст — 61 год). У пациентов отмечали следующие нозологические формы: рак желудка (68), колоректальный рак (30), хронический лимфоцитарный лейкоз (52), лимфома Ходжкина (33) и полинеоплазии (41). В подгруппу больных с полинеоплазиями были включены лица с двумя и более синхронными или метахронными опухолями различных нозологий: меланомой, раком толстой, ободочной, сигмовидной или подвздошной кишки, раком желудка, гортани, пищевода, почки, легкого, яичников, молочной железы, шейки матки, простаты, мочевого пузыря и щитовидной железы. Стадии заболеваний в группе онкологических больных варьировали от IA до IV.

При взятии образцов всем здоровым донорам и пациентам без онкологической патологии была дана подробная информация о проводимом исследовании с подписанием добровольного информированного согласия на участие в нем. Исследования у онкологических больных проводили в рамках клинических протоколов, утвержденных Министерством здравоохранения РФ и получивших соответствующее одобрение в Этическом комитете Медицинского радиологического научного центра им. А.Ф. Цыба — филиала Национального медицинского исследовательского центра радиологии Минздрава РФ.

Исследованные гены

Ген-супрессор TP53. Опухолевый ген-супрессор TP53, расположенный в локусе 13.1 p-плеча 17-й хромосомы, играет важную роль на многочисленных этапах злокачественной трансформации клеток. Он регулирует апоптоз, вовлечен в механизмы репарации ДНК и работает в качестве регулятора клеточного цикла в поздней G1-фазе. Нарушения гена TP53 являются одними из наиболее часто обнаруживаемых при раке у человека. Значимость гена TP53 при опухолевой супрессии подтверждена такими фактами, как высокая предрасположенность к развитию опухолей у TP53-дефицитных мышей и высокий риск ранних раков у людей, несущих наследственные мутации гена TP53 (синдром Ли–Фраумени). В половине всех спорадических ра­ков также отмечается инактивация данного гена. Более того, при раках, в которых ген TP53 остается интактным, его функция часто ослаблена. Ген TP53 играет фундаментальную роль в регулировании клеточных процессов, вовлеченных в управление пролиферацией, и в поддержании целостности и стабильности генома. Вследствие этого злокачественные новообразования человека содержат генетические или эпигенетические нарушения, которые ослабляют сигнальный путь с участием гена TP53 [10–12].

Онкоген AURKA. Ген AURKA, расположенный в локусе 13.2 q-плеча 20-й хромосомы, кодирует семейство киназ Aurora. Это семейство серин/треониновых киназ, необходимых для правильного протекания митотических и/или мейотических событий в клетках эукариот. Киназы Aurora играют критическую роль в регуляции таких митотических событий, как сборка веретена деления, цитокинез, функционирование центросом и цитоскелета. В частности, ген AURKA во время профазы экспрессируется в центросоме, обеспечивая ее разделение и созревание. Во время метафазы она локализуется в полярных микротрубочках и обеспечивает сборку веретена деления, при цитокинезе — локализуется в тельце Флеминга.

Ген AURKA является онкогеном. В экспериментах на животных было показано, что повышенная активность этого гена вызывает генетическую нестабильность и в дальнейшем — образование опухоли [13]. Кроме того, ген расположен в регионе, часто амплифицируемом при раке у человека, и его мутации увеличивают риск развития различных видов рака, таких как эзофагеальный рак, рак яичников, легких и рак молочной железы. Нарушение экспрессии AURKA также приводит к продвижению нарушений по митотическому циклу, вызывающих такие опухоли, как рак желудка, гепатоцеллюлярная карцинома и рак поджелудочной железы [14–16].

Метод интерфазной флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) на лимфоцитах периферической крови. Образцы венозной крови (4–6 мл) забирали при помощи вакуумной системы, содержащей Li-гепарин в концентрации 12–30 МЕ на 1 мл крови. Цельную кровь разбавляли (1:9) теплым раствором (37°C) KCl (550 мг + 110 мл) и помещали в термостат (37°C) на 30 мин. Затем проводили фиксацию клеток в смеси метанол:уксусная кислота (3:1). Клеточную суспензию (20–30 мкл) наносили на предварительно замороженные очищенные предметные стекла. В работе были использованы коммерческие наборы ДНК-зондов фирм Vysis (США) и Kreatech (Нидерланды) для генов AURKA и TP53. Пред- и постгибридизационные отмывки выполняли в соответствии с инструкцией производителя, прилагаемой к ДНК-зондам. Для денатурации и гибридизации использовали гибридайзер Thermobritе (StatSpin, США).

Анализ и статистическая обработка. Анализ препаратов проводили независимо друг от друга два исследователя на флуоресцентном микроскопе Axio Imager A-2 (Carl Zeiss, Германия) с набором фильтров DAPI, Orange/Green, Gold (Vysis). Для каждого образца крови анализировали 300–900 интерфазных клеток с четкими сигналами (рис. 1).

Рис. 1. Асинхронная репликация гена TP53 в лимфоцитах периферической крови человека: а — нормальный лимфоцит (два одинарных сигнала); б — лимфоцит с нарушением синхронности репликации гена (один одинарный и один сдвоенный сигнал); ×1000

Статистическую обработку данных выполняли с помощью стандартных методов статистического анализа с использованием программ SPSS Statistics v. 23 и Microsoft Office Excel (2007). Полученные данные были объединены в вариационные ряды, для которых рассчитывали среднее арифметическое, стандартное отклонение, 95% доверительный интервал (95% confidence interval, CI). Проверку распределения на нормальность осуществляли с помощью одновыборочного критерия Колмогорова–Смирнова. Cовокупности были однородными. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение (M±σ). Оценку значимости различий среднегрупповых показателей проводили с помощью однофакторного дисперсионного анализа и двустороннего t-критерия Стьюдента с поправкой Ньюмена–Кейлса для множественных сравнений. Различия считали статистически значимыми при уровне значимости p<0,05. Для оценки информативности и разрешающей способности теста проводили расчет чувствительности, специфичности и точности. Специфичность метода определяли как долю людей, не имеющих онкологического заболевания среди «отрицательных» анализов; чувствительность — как долю людей, имеющих подтвержденное онкологическое заболевание среди «положительных» анализов. Точность рассчитывали как долю «правильно сработавших анализов» среди всех обследованных людей.

Результаты

Результаты исследования частоты встречаемости лимфоцитов с АРГ для генов AURKA и TP53 в обследованных группах и подгруппах (табл. 1) показали, что для онкологических больных характерно высокое значение среднегрупповой частоты лимфоцитов с АРГ по обоим исследованным генам.

Таблица 1. Частота встречаемости лимфоцитов с асинхронной репликацией генов AURKA и TP53 в обследованных группах

Среднегрупповая частота этих лимфоцитов для гена AURKA в подгруппах онкологических больных с различными нозологиями статистически значимо отличается от такого же параметра в контрольной группе пациентов с неонкологическими заболеваниями и здоровых доноров (p<0,05). Сравнение онкопациентов с различными нозологиями показало, что различия между подгруппами больных с раком желудка и с полинеоплазиями были статистически значимы (p=0,023). Между подгруппами больных ра­ком желудка и колоректальным раком, а также хроническим лимфоцитарным лейкозом и лимфомой Ходжкина различия не были статистически значимы (p=0,57 и p=0,91 соответственно). Поэтому подгруппы онкобольных с различными нозологиями были объединены в подгруппы больных с солидными опухолями и с онкогематологией. Между этими подгруппами также не наблюдалось статистически значимых различий (p=0,274), поэтому в дальнейшем эти подгруппы были объединены в одну группу онкологических больных.

Для гена TP53 среднегрупповая частота лимфоцитов с АРГ в подгруппах больных «рак желудка + колоректальный рак» и «полинеоплазии» отличалась статистически значимо и была выше, чем в конт­рольной группе (p=0,01 и p=0,0001 соответственно). Наблюдалось также статистически значимое различие по частоте лимфоцитов с АРГ между подгруппами пациентов с раком желудка и с множественными опухолями (p=0,043).

Сравнение среднегрупповых частот лимфоцитов с АРГ для генов AURKA и TP53 в контрольной группе и объединенной группе онкологических больных (рис. 2) показало, что среднегрупповые показатели у онкобольных по обоим генам (36,8±4,8 и 28,4±5,1% соответственно) статистически значимо превышают конт­рольный уровень (22,0±3,4 и 18,0±3,2 соответственно) (p=0,0001). Наблюдается также статистически значимое различие среднегрупповых показателей между двумя исследованными генами: частота лимфоцитов с АРГ для гена AURKA выше, чем для гена TP53 как в группе онкологических больных (p=0,001), так и в контрольной группе (p=0,03).

Рис. 2. Сравнение среднегрупповых частот встречаемости лимфоцитов с асинхронной репликацией генов AURKA и TP53 в контрольной группе и у онкологичес­ких больных. Двусторонний критерий Стьюдента; M±σ; p<0,05

В качестве точки отсечения, отделяющей контрольную группу от группы пациентов с онкологическими заболеваниями, была взята верхняя граница 95% CI контрольной группы. Для гена AURKA в контрольной группе ее значение составило 28,7%. В этой группе не было ни одного человека, у которого частота лимфоцитов с АРГ для гена AURKA превысила бы этот уровень. В группе онкологических больных данный показатель превышал этот уровень у 214 человек и у 5 человек он был ниже точки отсечения.

Для гена TP53 верхняя граница 95% CI частоты лимфоцитов с АРГ в контрольной группе составила 24,2%. Превышение этого уровня наблюдалось у 1 человека, у 64 человек частота оставалась в границах 95% CI. В группе онкологических больных у 88 человек данный показатель превышал контрольный уровень и у 24 человек был ниже точки отсечения.

Информативность и разрешающая способность использования асинхронной репликации генов AURKA и TP53 в качестве диагностического метода представлены в табл. 2.

Таблица 2. Оценка чувствительности, специфичности и точности метода, % (M±σ)

Обсуждение

Одной из характеристик злокачественной трансформации клеток является их неконтролируемый рост, причиной которого часто служит накопление генетических нарушений, вызванных повышенным мутагенезом и нестабильностью генома [17]. По этой причине правильная репликация важна для нормального клеточного деления как гарантия, что генетическая информация в неизмененном виде перейдет в следующее клеточное поколение. Репликация ДНК является строго регулируемым процессом, в результате которого большая часть гомологичных локусов в геноме реплицируется синхронно и только малая их часть имеет асинхронную репликацию [3, 18]. Нарушения во времени репликации, в том числе и асинхронная репликация тех генов, которые должны реплицироваться синхронно, влияют на экспрессию генов, на увеличение частоты структурных перестроек и вызывают изменения в эпигенетических модификациях. Это в свою очередь обусловливает повышенную дестабилизацию генома и в конечном итоге может приводить к развитию рака [5, 19]. Авторами работы [6] было показано, что две трети мутаций, связанных с развитием рака, возникают в результате нарушений репликации ДНК. Анализ взаимосвязи нестабильности генома, рака и нарушения программы репликации [2] показал, что аберрантная репликация является ранним событием в канцерогенезе.

С использованием метода интерфазной флуоресцентной in situ гибридизации рядом зарубежных авторов были проведены исследования лимфоцитов периферической крови с АРГ генов TP53, HER-2/neu, C-MYC, RB1, AML1 у человека и получены следующие результаты:

1) у клинически здоровых лиц частота лимфоцитов с АРГ для изученных генов изменяется в пределах 10–21% [7, 8, 20–24];

2) у онкологических больных (лимфомы [24, 25], хронический лимфоцитарный лейкоз [7], хронический миелоидный лейкоз [25], почечно-клеточные карциномы [8], рак простаты [26], рак молочной железы [21] и др.) данный показатель изменяется в пределах 28–41%;

3) как у онкогематологических больных, так и у больных с солидными опухолями АРГ наблюдается в лимфоцитах периферической крови [7, 8];

4) частота лимфоцитов с АРГ увеличивается по мере озлокачествления заболеваний [23, 24];

5) потеря синхронности репликации генов у онкологических больных — это обратимый эпигенетический феномен, связанный в том числе и с аномальным метилированием [20, 22].

Проведенное нами исследование частоты лимфоцитов с АРГ для гена TP53 как у доноров без онкологических заболеваний, так и у больных солидными опухолями показало хорошее совпадение с основными результатами зарубежных исследований [8, 24, 27]. Таким образом, результаты работ, направленных на изучение нарушения времени репликации биаллельно экспрессирующихся генов в лимфоцитах периферической крови у онкологических больных [9], а также данные наших исследований [28] позволяют сделать предположение, что АРГ может служить неспецифическим опухолевым маркером.

Как известно, злокачественное новообразование у человека — это результат либо активации онкогена, либо нарушения работы генов-супрессоров опухолей. Для нашего исследования мы выбрали ген AURKA, являющийся онкогеном, и ген TP53, являющийся геном-супрессором. Полученные данные показали, что частота встречаемости лимфоцитов с АРГ для гена AURKA как в контрольной группе, так и у онкологических больных достоверно превышает этот показатель для гена TP53. Предполагая, что частота лимфоцитов с асинхронной репликацией биаллельно экспрессирующихся генов является неспецифическим опухолевым маркером, мы оценили этот показатель как возможный молекулярно-цитогенетический тест для выявления людей с онкологическими новообразованиями. В табл. 2 показаны чувствительность, специфичность и точность данного теста: наиболее информативным является тест с использованием частоты лимфоцитов с АРГ для гена AURKA: у него все показатели превышают 98%.

Заключение

Результаты пилотного исследования частоты встречаемости лимфоцитов с асинхронной репликацией гена AURKA в периферической крови могут служить базой для разработки новой молекулярно-цитогенетической технологии выявления злокачественных новообразований у человека. Безусловно, для создания такой технологии требуются дальнейшие углубленные исследования, в частности зависимости результатов от пола, возраста, приверженности к курению и от других факторов с учетом различных нозологий у онкологических больных.

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии дополнительных источников финансирования при проведении исследования.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.