Оценка прогностической значимости системного уровня моноаминов в развитии ретинопатии недоношенных в эксперименте

Введение

Ретинопатия недоношенных (РН) — тяжелая вазопролиферативная витреоретинальная патология глаз недоношенных детей, которая является одной из ведущих причин необратимого билатерального нарушения зрительных функций у них [1].

В основе клинических проявлений РН лежит нарушение нормального ангиогенеза сетчатки, который начинается на 16-й неделе внутриутробного развития и завершается лишь к моменту срочных родов. На глазном дне недоношенных детей в норме всегда выявляются аваскулярные зоны на периферии сетчатки, причем их протяженность тем больше, чем меньше гестационный возраст ребенка на момент осмотра. Наличие таких аваскулярных зон не является заболеванием, это лишь свидетельствует о недоразвитии сетчатки, незавершенности ее васкуляризации и, соответственно, о вероятности проявления РН в дальнейшем. Возможность прогнозирования ее развития именно на данном этапе имеет важное клиническое значение.

Течение РН принято разделять на две фазы — активную и регрессивную, или рубцовую. Согласно международной классификации [2], выделяют 5 стадий активной фазы РН:

1-я стадия — появление тонкой плоской демаркационной линии белого цвета на границе сосудистой и бессосудистой сетчатки;

2-я стадия — формирование вала (или гребня) на месте демаркационной линии (следует подчеркнуть, что в 70–80% случаев при 1–2-й стадиях РН возможен самопроизвольный регресс заболевания с минимальными остаточными изменениями на глазном дне);

3-я стадия — появление экстраретинальной фиброваскулярной пролиферации в области вала (при небольшой протяженности процесса (1–2 часовых меридиана), возможен самопроизвольный регресс, но дальнейшее прогрессирование заболевания требует врачебного вмешательства, поскольку продолженный рост экстраретинальной ткани ведет к необратимым последствиям и значительной потере зрительных функций);

4-я стадия — частичная отслойка сетчатки;

5-я стадия — полная или тотальная отслойка сетчатки.

«Золотым стандартом» лечения РН является лазеркоагуляция аваскулярной зоны сетчатки в так называемую пороговую стадию заболевания. Еще одним методом лечения, получившим распространение в последние годы, является интравитреальное введение антиангиогенных препаратов. Однако оба этих метода имеют определенные ограничения и недостаточную эффективность в лечении тяжелых атипичных форм РН, развивающихся у глубоко недоношенных детей. Частота данных форм заболевания в последние годы значительно возросла в связи с успехами современной неонатологии. Это делает крайне актуальным вопрос совершенствования системы скрининга и профилактики РН.

Поиск новых критериев прогнозирования развития РН неразрывно связан с углублением понимания патогенеза заболевания. Значимое место в изучении механизмов развития РН занимает экспериментальное моделирование. Наиболее широко применяются модели ретинальной неоваскуляризации на грызунах, в частности на крысятах, в силу довольно высокого сходства развивающейся у них экспериментальной РН с заболеванием у детей в клинике (патологическое развитие сосудов сетчатки у животных в динамике соответствует существованию аваскулярных зон, «преретинопатии» и I–III стадиям активной фазы РН с последующим самопроизвольным регрессом заболевания), а также целого ряда преимуществ работы с мелкими лабораторными животными [3, 4].

Следует отметить, что изучение содержания различных патогенетически значимых факторов во внутриглазных структурах животных имеет преимущественно фундаментально-патогенетическое значение. Такое изучение несет в себе основу для разработки новых подходов к лечению данной патологии, однако оценка местного уровня соответствующих факторов у детей в клинике имеет очевидные ограничения [5, 6]. В связи с этим более перспективным для использования в клинической практике представляется исследование их системного уровня.

Целью нашего исследования явилось изучение системного уровня L-ДОФА, дофамина и норадреналина и оценка их прогностической значимости в развитии ретинопатии недоношенных на экспериментальной модели заболевания.

Материалы и методы

Исследование выполнено на 36 крысятах линии Wistar в соответствии с ГОСТ 53434-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики GLP», постановлением главного государственного врача РФ №51 от 29.08.2014 «Об утверждении СП 2.2.1.3218-14 “Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)”», Федеральным законом №61-ФЗ от 12.04.2010 «Об обращении лекарственных средств». Протокол исследования был утвержден Этическим комитетом Национального медицинского исследовательского центра глазных болезней им. Гельмгольца.

С целью воспроизведения экспериментальной РН новорожденных крысят (n=17) на 14 сут помещали в инкубатор вместе с родившими их самками (возраст самок — 6–8 мес). Каждые 12 ч концентрация кислорода в инкубаторе изменялась от 60 до 15%. Затем крысят помещали в условия с нормальным содержанием кислорода (21%). На протяжении эксперимента в помещении поддерживали постоянный температурный (26°С) и световой (12 ч — день, 12 ч — ночь) режимы. Данная экспериментальная модель РН разработана и описана нами ранее [7], подтверждена иммуногистохимическими и гистологическими исследованиями, выявляющими характерные признаки заболевания, соответствующие 1–3-й стадиям активной фазы РН у детей.

Контрольную группу составили новорожденные крысята (n=19), находившиеся с момента рождения в условиях с нормальным содержанием кислорода (21%).

Животных обеих групп выводили из эксперимента на 14-, 21–23- и 28–30-е сутки жизни и проводили забор крови из сердца. Выбор указанных сроков обусловлен соответствием их ключевым этапам развития РН в эксперименте [7].

Для определения катехоламинов кровь собирали в пробирку с 30 мкл 5% раствора этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (Sigma-Aldrich, США) и 10 мкл 10% раствора метабисульфита натрия (Sigma-Aldrich). Затем отделяли плазму от форменных элементов центрифугированием при 1350 g в течение 10 мин и добавляли в нее 50 пмоль 3,4-дигидроксибензиламина (ДГБА) (Sigma-Aldrich) в 0,1 Н HClO4. Для освобождения от высокомолекулярных белков плазму центрифугировали при 16 500 g 20 мин. Перед определением катехоламинов пробы экстрагировали осаждением на оксиде алюминия. Затем в плазме каждого образца методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией определяли содержание L-ДОФА, дофамина и норадреналина. Разделение осуществляли на обратно-фазовой колонке ReproSil-Pur, ODS-3, 4×100 мм с диаметром пор 3 мкм (Dr. A. Marsch Ammerbuch-Entringen, Германия) при температуре 30°С и скорости подвижной фазы 1 мл/мин, которую поддерживает жидкостный хроматограф LC-20ADsp (Shimadzu, Япония) при потенциале 850 мВ.

Статистическую обработку результатов выполняли с использованием пакета программ Statistica 10.0. Исследуемые выборки были проверены на соответствие нормальному распределению с помощью критерия Шапиро–Уилка. Для определения статистической значимости полученных результатов был использован непараметрический U-критерий Манна–Уитни (U-тест). Различия считали статистически значимыми при p<0,05. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (M±SE).

Результаты

Выбранный срок — 14-е сутки эксперимента — соответствует индукции патологической неоваскуляризации при экспериментальной РН, согласно проведенным нами ранее гистологическим исследованиям [7], и доклинической фазе развития РН у детей. На этом этапе средний уровень L-ДОФА в плазме крови крысят опытной группы (0,31 нг/мл) был статистически значимо снижен по сравнению с данным показателем (0,42 нг/мл) в группе контроля (р≤0,01) (см. рисунок).

---

Уровень L-ДОФА в плазме крови крысят опытной и конт­роль­ной групп: а — на 14-е сутки эксперимента; б — на 21–23-и сутки эксперимента

---

На 21–23-и сутки эксперимента (срок соответствует активному развитию патологической экстраретинальной неоваскуляризации в применяемой модели [7] и III стадии развития РН у детей в клинике) системный уровень L-ДОФА по-прежнему был статистически значимо снижен в опытной группе (0,87 нг/мл) по сравнению с контрольной (1,53 нг/мл) (р≤0,01), при этом степень снижения была больше, чем на 14-е сутки.

На 28–30-е сутки эксперимента (срок соответствует регрессу новообразованных сосудов в применяемой модели [7] и фазе самопроизвольного регресса РН у детей в клинике) уровень данного показателя в плазме крови в опытной группе (0,33 нг/мл) имел лишь статистически не значимую тенденцию к повышению относительно контроля (0,21 нг/мл).

Средний системный уровень дофамина не имел значимых отличий в опытной и контрольной группах на всех этапах эксперимента (табл. 1).

---

Таблица 1. Средний уровень дофамина в плазме крови крысят опытной и контрольной групп в течение эксперимента, нг/мл (M±SE)

---

Аналогично дофамину средний уровень норадреналина в плазме крови крысят не имел различий в исследуемых группах животных на всех сроках наблюдения (табл. 2).

---

Таблица 2. Средний уровень норадреналина в плазме крови крысят опытной и контрольной групп в течение эксперимента, нг/мл (M±SE)

---

Обсуждение

Современная система скрининга РН предусматривает необходимость офтальмологического обследования всех недоношенных детей, рожденных на сроке беременности менее 35 нед и с массой тела при рождении менее 2000 г [8]. Дальнейший мониторинг предполагает наблюдение детей раз в две недели, раз в неделю или раз в 3 дня в зависимости от клинической картины до достижения полной васкуляризации сетчатки, самопроизвольного или индуцированного регресса РН. Проведение многократных осмотров оказывает стрессовое действие на детей и сопряжено с рядом возможных осложнений в связи с развитием окулокардиальных и окулопульмональных рефлексов, особенно у глубоко недоношенных детей [9].

В последние годы предпринимаются попытки совершенствования существующего протокола скрининга РН. При этом активно развиваются два основных направления оптимизации: телемедицинские технологии и поиск дополнительных клинических и, в особенности, лабораторных прогностических критериев, позволяющих выявлять детей с высоким риском развития РН — для планирования ведения на этапах выхаживания, а также детей без риска или с низким риском развития РН — для сокращения числа лишних осмотров [10].

В настоящее время предметом активного изучения являются ангиогенные свойства моноаминов и их роль в развитии различной вазопролиферативной ретинальной патологии. Однако данные, касающиеся их участия в патогенезе РН, на сегодняшний день немногочисленны и весьма противоречивы [11–13]. В проведенном нами ранее исследовании [6] было изучено содержание дофамина, его предшественника L-ДОФА и норадреналина в сетчатке крысят с экспериментальной РН на разных сроках развития патологии и получены данные, свидетельствующие о конкретном участии L-ДОФА и норадреналина в регуляции ангиогенеза при РН.

Целью настоящего исследования стало изучение системного уровня моноаминов при развитии РН. Это позволяет проводить параллель между данными эксперимента и клиники, поскольку, как уже упоминалось ранее, оценка системного уровня различных факторов у недоношен­ных детей гораздо более перспективна по сравнению с их определением во внутриглазных структурах. Особый интерес представляют результаты, полученные в отношении L-ДОФА, поскольку уровень данного фактора имел статистически значимую разницу между изучаемыми группами животных в разные сроки, что свидетельствует о его патогенетической, а также прогностической роли в развитии РН.

Полученные нами данные, бесспорно, позволяют рассматривать низкий уровень данного моноамина в плазме крови крысят на 14-е сутки эксперимента, т.е. на сроке, соответствующем началу патологического ангиогенеза сетчатки или преретинопатии у детей в клинике, в качестве прогностического признака развития экстраретинальной вазопролиферации при экспериментальной РН и могут служить основой для проведения клинических исследований с целью определения прогностического значения уровня L-ДОФА в сыворотке крови недоношенных детей как потенциально нового лабораторного критерия скрининга РН.

Заключение

Низкий системный уровень L-ДОФА на доклинической стадии экспериментальной РН следует рассматривать в качестве лабораторного прогностического критерия развития патологического процесса, что позволит использовать данный крите­рий при разработке мер по оптимизации существующей системы скрининга заболевания у детей в клинике.

Источник финансирования. Работу проводили при поддержке государственного задания по темам НИР и НИОКТР (номера государственной регистрации — 0108–2019–0006 и АААА-А18–118032390091–7).

Конфликт интересов. Авторы заявили об отсутствии конфликта интересов.