Разработка двухслойного пористого скаффолда на основе хряща перегородки носа свиньи для ортопедии

Введение

Наличие связанных с травмами или остеохондрозом глубоких остеохондральных дефектов в суставах является одной из наиболее распространенных проблем в лечении патологии опорно-двигательного аппарата. В последние два десятилетия развивается новый подход к восстановлению тканей, обусловливающий имплантацию тканеинженерных конструкций [1].

Для суставного хряща такая конструкция должна соответствовать определенным требованиям [2–5]: 1) быть неиммуногенной, биодеградируемой и биосовместимой; 2) обладать способностью к объемному заселению клетками; 3) сохранять дифференцировку хондроцитов или дифференцироваться в хондроциты при засевании скаффолда стволовыми клетками; 4) соответствовать остеохондральной структуре по своим упруго-механическим свойствам и гетерогенной многослойности.

По-видимому, идеальной следует признать конструкцию, сделанную из собственной ткани (аутографт), однако у такого подхода есть существенное ограничение: замещение глубокого остеохондрального дефекта приводит к созданию дефектов в других местах. Перспективной основой для создания скаффолдов хрящевой ткани является децеллюляризированный матрикс самой хрящевой ткани животных — ксенографт [3–13], который соответствует требованиям 1 и 3. Децеллюляризация является многостадийным процессом комплексной химико-механической обработки [4], после которой препарат хрящевой тканиперестает соответствовать требованию 4. Следует отметить, что без механического измельчения децеллюляризация — весьма трудозатратный процесс, кроме того, оставшийся коллагеновый матрикс оказывается слишком плотным, чтобы обеспечить выполнение требования 2 [7]. Создание материала с ориентированными волокнами коллагена и порами из порошка хряща, как правило, осуществляется в специальных пресс-формах с программируемым изменением температуры [8, 10, 11]. Другой интересный способ создания каналов в коллагеновой матрице был предложен в работе [9], где использовались иглы диаметром 400 мкм.

Одна из наиболее сложных проблем в создании конструкции, замещающей остеохондральный дефект, связана с многослойностью поврежденной ткани суставного хряща. Его верхняя часть представляет собой гиалиновый хрящ, образованный коллагеном типа II, а нижний слой — субхондральную костную ткань, сформированную на основе коллагена I типа. Предлагаются разные варианты изготовления механически единой и стабильной конструкции, удовлетворяющей требованию 4, однако большинство из них технически очень сложны в исполнении. К таким вариантам относятся пространственно-разделенная иммобилизация трансгенов, кодирующих разные факторы роста для хондрогенной или остеогенной дифференцировки стволовых клеток [14], и механическая комбинация децеллюляризированного размолотого хряща и минеральной (или полимерной) подсистемы [15–18].

Мы предлагаем использовать в качестве исходной заготовки для скаффолда часть перегородки носа, включающую гиалиновый хрящ (коллаген типа II) и элементы надхрящницы (коллаген типа I). После децеллюляризации, создания пор и восстановления механических свойств коллагенового каркаса за счет образования дополнительных поперечных связей возможно получение поддерживающей конструкции для замещения остеохондральных дефектов, удовлетворяющей требованиям 1–4. Отметим, что оптимальными для свободного заселения хондроцитами считаются отверстия с характерным размером ~100 мкм [9].

Цель исследования — получение конструкции на основе пластины хряща носовой перегородки, обеспечивающей нужную дифференцировку клеток в разных слоях, для замещения глубокого остеохондрального дефекта; разработка алгоритма последовательности химических и физических воздействий для создания неиммуногенной двухслойной пористой структуры с нужными упруго-механическими свойствами.

Материалы и методы

В качестве исходной системы использовали пластины размером 7×10 мм и толщиной 2 мм, вырезанные из носовой перегородки свиньи (не позднее 12 ч после забоя). Сверху пластины были покрыты тонким слоем надхрящницы, низ представлял собой гиалиновую часть хряща.

Предварительная обработка состояла в заморозке пластин в течение 6 сут при температуре –18°С и последующем выдерживании в течение 24 ч при 37°С в гипотоническом растворе солей (0,1 M NaCl с добавлением 0,01 М трис-HCl и 0,005 M MgCl₂).

Ферментативная обработка заключалась в выдерживании пластин в течение 24 ч при 37°С в 0,15 М растворе NaCl, содержащем 1 мг/мл трипсина. Такую обработку проводили дважды: до ИК-лазерного воздействия и после него.

Обработка сшивающими агентами состояла в выдерживании пластин в течение заданного времени (24, 48 или 120 ч) при 24°С в 0,15 М растворе NaCl — с добавлением HCl до концентрации 0,32 мМ (pН=3,5), содержащем сшивающий агент. В качестве сшивающего агента выступал глицериновый альдегид, образующийся in situ из его прекурсора — ди­этил­ацеталя глицеринового альдегида в кислой среде. Прекурсор добавляли в раствор так, чтоб его концентрация составляла 0,02 М. Был также протестирован сшивающий агент рибоза с концентрацией 0,02 М. Такие обработки проводили после ИК-ла­зерного воздействия.

После каждой обработки (ферментативной и сшивающим агентом) образцы промывали в 300 мл 0,15 М раствора NaCl на воронке с фильтрующим дном под вакуумом водоструйного насоса. Время отмывки каждого образца составляло около 1 ч.

Для создания полостей в материале использовали излучение допированного эрбием волоконного лазера с длиной волны 1,56 мкм. Излучение подавали с помощью кварцевого оптического волокна с диаметром сердцевины 400 мкм. Воздействие осуществляли контактно, диаметр облучаемой зоны соответствовал диаметру волокна. Обработку излучением пластины конструкции проводили с двух сторон рядами лазерных пятен, расстояние между рядами и двумя соседними пятнами составляло около 2 мм. При таком расстоянии между точками контакта изменение матрикса в каждой зоне воздействия обусловлено непосредственно действием лазерного излучения в месте контакта волокна с материалом и не зависит от облучения в соседних точках.

Термическую стабильность коллагена в образцах определяли на дифференциальном сканирующем калориметре (модель DSC 204 F1; Netzsch, Германия). Образцы массой 5–8 мг герметично закрывали в стандартных алюминиевых чашках объе­мом 20 мкл. Начальная, конечная температура составляли 20 и 90°С, скорость нагрева — 10 K/мин соответственно.

Механические испытания проводили на универсальной настольной испытательной машине EZ Test (модель EZ-SX; Shimadzu, Япония) при комнатной температуре в условиях одноосного сжатия в направлении, перпендикулярном поверхности пластины. Вертикальную нагрузку (до 20 Н) определяли при помощи датчиков силы, скорость перемещения сжимающей пластины составляла 0,5 мкм/с. Из регистрированных автоматически данных «сила–перемещение» получали зависимости «напряжение (σ)–деформация (ε)», которые в дальнейшем аппроксимировали экспоненциальной функцией σ=A·exp(Bε) с двумя подгоночными параметрами (А, В). Значение первой производной аппроксимационной функции при ε=10% принимали за модуль Юнга (Е).

Для морфологических исследований образцы фиксировали в 10% нейтральном формалине и готовили парафиновые среды толщиной 4 и 16 мкм. Более тонкие срезы, окрашенные гематоксилином и эозином и пикросириусом красным по стандартной методике, анализировали на универсальном оптическом микроскопе Leica DM4000 B LED (Leica Microsystems, Швейцария) в режимах световой, фазово-контрастной и поляризационной микроскопии. Микрофотографии получали с помощью цифровой видеокамеры Leica DFC7000 T с программным обеспечением LAS V4.8. На срезах толщиной 16 мкм проводили визуализацию в режиме генерации второй гармоники (ГВГ). Их анализировали с помощью лазерного сканирующего микроскопа LSM 510 META (Carl Zeiss, Германия). Возбуждение осуществляли импульсным фемтосекундным излучением Ti:Sa-лазера (Mai Tai HP; Spectra-Physics, США) на длине волны 800 нм с длительностью импульсов 100 фс и частотой их повторения 80 MГц. Сигнал ГВГ выделяли с помощью дихроичного фильтра видимого излучения HFT KP 650 (Carl Zeiss) и узкополосного фильтра (400/10 нм).

Общая схема эксперимента, включающая приготовление образцов и методы их анализа, представлена на рис. 1.

---

Рис. 1. Блок-схема эксперимента: 1 — надхрящница; 2 — гиалиновый хрящ

---

Результаты

Морфологический анализ образцов после предварительной подготовки (тип I) показал, что для значительной части хондроцитов характерны деформация ядер и кариорексис, при этом структура коллагенового матрикса ткани сохраняется и в гиалиновой части, и в надхрящнице (рис. 2).

---

Рис. 2. Микрофотографии срезов образцов типа I: а — гиалиновый хрящ, окраска гематоксилином и эозином, фазово-контрастная микроскопия; б — гиалиновый хрящ; в — надхрящница; ГВГ-изображения. Бар — 50 мкм

---

Термический анализ подтвердил, что коллаген в обеих частях сохранил термостабильность: в гиалиновой части коллаген не денатурирует вплоть до 95°С, а в надхрящнице денатурация происходит при температуре 63,5±0,5°С.

Механические свойства образцов типа I практически не изменились по сравнению с интактными: модуль Юнга (Е) составил 0,65±0,15 МПа, что близко к величине Е=0,70±0,10 МПа, характерной для интактных образцов.

Для создания несквозных отверстий образцы типа I на первом этапе подвергали ферментативной обработке с отмыванием продуктов протеолиза, включая цепи гликозаминогликанов. После такой процедуры термическая стабильность коллагена надхрящницы не изменилась, но коллаген в гиалиновой части оказался способным денатурировать полностью при 61,8±0,5°С.

Для локальной денатурации необходимо, чтобы, с одной стороны, время лазерного нагрева было су­щес­твенно меньше времени тепловой релаксации (~0,1 c в радиальном направлении [19]) и, с другой стороны, температура в облучаемом объеме составляла не менее 61°С. Соответственно были выбраны время однократного воздействия (50 и 100 мс) и мощность лазерного излучения 2–4 Вт [20]. После точечной лазерной обработки образцы повторно трипсинизировали и отмывали от продуктов протеолиза.

Геометрические характеристики полученных отверстий измеряли на лабораторном микроскопе с точностью около 10 мкм. Оказалось, что при мощности 2 Вт и длительности импульса 100 мс или мощности 3 Вт и длительности импульса 50 с получаются круглые отверстия диаметром от 90 до 120 мкм, что близко к целевому размеру. Так получали образцы типа II.

На микрофотографиях продольных и поперечных срезов образцов типа II видно, что в матрице действительно образуются неполнослойные отверстия с диаметром, близким к целевым значениям ~100 мкм (рис. 3).

---

Рис. 3. Лазерные отверстия на поперечном (а) и продольном (б) срезах образцов типа II: а — окраска гематоксилином и эозином, фазово-контрастная микро­скопия; б — ГВГ-изображение. Бар — 50 мкм

---

В образцах типа II происходили и существенные морфологические изменения по сравнению с образцами типа I. На микрофотографиях видно, что большая часть лакун оказались пустыми, без клеточных ядер (кариолизис), лишь в незначительной части содержатся фрагменты ядер (кариорексис). Коллагеновые волокна сохранялись и в надхрящнице, и в гиалиновой части, но волокнистая структура гиалиновой части была повреждена (рис. 4). В обычно гомогенном матриксе проявляется тонкая волокнистость, а анизотропия коллагена при поляризационной микроскопии наблюдается не везде.

---

Рис. 4. Микрофотографии срезов образцов типа II: а — ГВГ-изображение; б — окраска гематоксилином и эозином; в — окраска пикросириусом красным, поляризационная микроскопия. Бар — 50 мкм

---

По данным термического анализа, стабильность коллагена надхрящницы образцов типа II мало изменялась в отличие от коллагена гиалиновой части, где его денатурация происходила в интервале 48–61°C с максимумом пика на эндотерме ~55°C. Модуль Юнга уменьшился до 0,15±0,10 МПа.

Укрепление коллагенового каркаса конструкции осуществляли с помощью обработки сшивающими агентами (глицериновым альдегидом и рибозой), в результате чего получали образцы типа III. Эти образцы характеризовались практически полным отсутствием клеточных ядер при сохранности коллагенового каркаса и лазерных отверстий (рис. 5). Архитектоника коллагенового каркаса гиалиновой части существенно изменилась: структура стала более плотной и волокна собрались в пучки. В надхрящнице волокна сохранили ориентацию, параллельную поверхности.

---

Рис. 5. Микрофотографии срезов образцов типа III после воздействия глицериновым альдегидом в течение 48 ч: а — ГВГ-изображение; б — окраска гематоксилином и эозином, фазово-контрастная микроскопия; в — окраска пикросириусом красным, поляризационная микроскопия. Бар — 50 мкм (а, б) и 500 мкм (в)

---

Термическая стабильность коллагена в образцах типа III возросла. Увеличение времени сшивания образцов приводило к увеличению температуры денатурации. Глицериновый альдегид как сшивающий агент оказался активнее, чем рибоза. Данные термического анализа образцов типа III приведены в таблице.

---

Термические и механические характеристики образцов в ходе приготовления скаффолда

---

Механическая устойчивость конструкций в образцах типа III увеличилась, модуль Юнга оказался близок к величине Е для интактной хрящевой ткани. Как и в случае с температурой денатурации, обработка глицериновым альдегидом привела к большему увеличению E в отличие от рибозы, даже при меньшем времени воздействия. Увеличение времени сшивания с помощью глицеринового альдегида приводило к росту Е. Значения Е для образцов типа III также приведены в таблице.

Обсуждение

Подготовительная обработка хрящевой пластины оказала влияние главным образом на состояние клеток. Действительно, замораживание–оттаивание и обработка гипотоническим раствором инициируют разрушение клеточных мембран. Таким образом, в образцах типа I прошел первый этап деструкции клеток. Первая трипсинизация образцов типа I обеспечивает возможность денатурации коллагена гиалиновой части хряща при ИК-лазерном нагреве [21]. В результате после локального воздействия и повторной трипсинизации, запускающей в свою очередь протеолиз денатурированного коллагена, в препаратах образуются полости. Радиус и длина полости зависят от совокупности параметров лазерного воздействия. Так, длина волны излучения λ определяет глубину проникновения излучения, диаметр волокна — площадь воздействия. Длительность импульса t и мощность Р обусловливают максимальную температуру, их вариации позволяют корректировать область изменений в ткани [22]. Для создания полостей радиусом 100 мкм и длиной ~1 мм мы выбрали λ=1,56 мкм и подходящий диаметр волокна для контактного воздействия. Другие необходимые характеристики (Р и t) определяли экспериментально, предварительно оценив их диапазон на основе более ранних работ [20]. Таким образом, меняя параметры ИК-лазерного воздействия, можно варьировать геометрические характеристики полостей в коллагеновом каркасе конструкции в достаточно широких пределах.

Важно отметить, что двойная протеолитическая ферментативная обработка, приводящая к деструкции всех белков (включая внутриклеточные), и двойная отмывка продуктов протеолиза дает практически полную децеллюляризацию матрикса. Видимо, разрушение мембран и освобождение ДНК и РНК от стабилизирующих белковых оболочек способствует удалению клеточного материала. К сожалению, коллагеновый каркас теряет свою устойчивость, в том числе термическую и механическую, в связи с разрушением подсистемы протеогликановых агрегатов [21, 23].

Почти пятикратное падение модуля Юнга в образцах типа II ставит под сомнение возможность их использования в качестве замены части хрящей, подвергающихся сжатию при работе сустава. Для увеличения жесткости и механической прочности материалов на основе коллагена успешно применяют обработку сшивающими агентами [24–26]. Первыми такими агентами были полифункциональные альдегиды, в первичной реакции образующие связь между альдольной группой и свободной аминогруппой остатка лизина, входящего в полипептидную цепь коллагена [24]. Увеличение количества ковалентных связей между молекулами коллагена, очевидно, приводит к увеличению жесткости материала, состоящего из отдельных волокон [27]. Основными требованиями к сшивающим агентам (в частности, альдегидам) являются наличие у них достаточной химической активности в реакции присоединения, с одной стороны, и отсутствие цитотоксичности — с другой. В качестве сшивающих агентов мы выбрали два альдегида: более активный глицериновый альдегид с крайне низкой цитотоксичностью и гораздо менее активную рибозу, но с абсолютным отсутствием цитотоксичности. Оба агента показали свою способность стабилизировать коллагеновый каркас конструкции (образцы типа III глицеринового альдегида и типа III рибозы). При этом с увеличением времени реакции показатели степени образования сшивок (температура денатурации и Е) возрастали, но в соответствии с ожидаемой активностью. Так, через 24 ч действия глицеринового альдегида механические характеристики материала сравнялись с таковыми для исходного гиалинового хряща. Коллаген стал существенно более термостабилен. Что касается химически менее активной рибозы, то приблизиться к этому результату удалось за трое суток реакции. Таким образом, использование предлагаемых нами нетоксичных сшивающих агентов позволяет получать скаффолды на основе единой системы волокон коллагена II и I, преимущественно разделенных в пространстве, причем механические характеристики конструкции можно варьировать в широком диапазоне.

Реакции, приводящие к образованию сшивок между макромолекулами, мы проводили при рН=3,5, в отличие от работ [25–28], в которых также применялись эти сшивающие агенты. Использование кислой среды для сшивания in vivo невозможно, но для обработки скаффолда это не является препятствием, так как излишек кислоты можно нейтрализовать основанием или отмыть. С другой стороны, образование первой ковалентной связи между альдегидом и остатком лизина включает стадию протонирования и реакция в кислой среде идет существенно быстрее. Действительно, в условиях нейтральной среды добиться значимого изменения характеристик стабильности под действием рибозы удается через 5–7 сут [25–28]. В нашем случае эффект зафиксирован уже через 3 сут.

Важным результатом является сохранение единого коллагенового каркаса и гиалиновой части, представленной коллагеном II, и надхрящницы, преимущественно состоящей из коллагена I. Такое пространственное разделение разных типов коллагена в единой системе может обеспечить нужную дифференцировку клеток как в остеогенной, так и в хондрогенной части.

Заключение

В результате последовательных обработок солями, трипсином, ИК-лазерным излучением и нетоксичными сшивающими агентами пластина хряща носовой перегородки образует пористую бесклеточную конструкцию. Она состоит из двух слоев, образованных волокнами коллагена типа I (из надхрящницы) и типа II (из гиалиновой части). Данной конструкции можно задавать стабильность, механические свойства и размеры полостей для заселения клеткам. Это дает возможность использовать ее для замены дефектов суставного хряща.

Источники финансирования. Исследование про­ве­дено при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты №19-02-00135а и №19-315-90058), а также Министерства науки и высшего образования РФ в рамках Государственного задания Федерального научно-исследовательского центра «Кристаллография и фотоника» РАН в части лазерных технологий, Федерального исследовательского центра Институт прикладной физики РАН (проект №#0030-2021-0014) в части морфологического исследования и Государственного задания по теме №АААА-А21-121011990019-4 в части физико-химической модификации и анализа образцов.

Конфликт интересов отсутствует.