Фотодинамическая тераностика центрального рака легкого: возможности ранней диагностики и малоинвазивного лечения (обзор)

Введение

Рак легкого — одна из основных причин смертности от онкологических заболеваний, 5-летняя выживаемость таких пациентов не превышает 10–15% [1]. Ключевым фактором повышения эффективности помощи больным раком любой локализации является его ранняя диагностика [2, 3], Основным методом которой служит компьютерная томография (однако даже при применении самых современных томографов она не решает проблему выявления скрытых рентгенонегативных форм центрального рака легкого (ЦРЛ), составляющих 30% от общего числа случаев рака легких) [4]. В настоящее время не существует ни одного рекомендованного к использованию в рутинной клинической практике метода ранней диагностики ЦРЛ, за исключением бронхоскопии, выполняемой в белом свете, обладающей относительно невысокой чувствительностью (0,70) и специфичностью (0,78) [5]. Поэтому такая бронхоскопия часто не справляется с задачей раннего выявления опухолевых участков в крупных бронхах/трахее, что приводит к драматическим последствиям, отраженным в статистике смертности [6].

Одним из перспективных направлений ранней диагностики ЦРЛ и предраковых изменений считается бронхоскопия в свете флуоресценции [7]. Если опухоль бронха удается выявить на ранней стадии с помощью бронхоскопии, то и радикальное лечение такой опухоли может быть достигнуто путем малоинвазивного эндоскопического вмешательства.

Оценке перспектив скрининга ЦРЛ с целью выявления раннего рака с помощью флуоресцентной диагностики и его лечения методом эндобронхиальной фотодинамической терапии (ФДТ) посвящен настоящий обзор.

Диагностика центрального рака легкого

Для повышения возможностей диагностики ранних доклинических стадий ЦРЛ в последнее время предложено использовать различные оптические методы исследований, совмещаемые с обычной бронхоскопией, такие как визуализация в узком спектре (narrow band imaging), бронхоскопия с большим увеличением (high magnification bronchovideoscopy), оптическая когерентная томография (optical coherence tomography), конфокальная лазерная микроскопия (confocal laser microscopy), рамановсковая лазерная спектроскопия (Raman spectroscopy). К сожалению, эти методы, хорошо зарекомендовавшие себя при других локализациях злокачественных опухолей, пока еще не доказали свою эффективность в диагностике раннего ЦРЛ [8–10]. Более того, исследования возможностей использования этих методов применительно к ранней диагностике ЦРЛ в настоящее время не проводятся. Интересными с точки зрения массового обследования могут оказаться методы, основанные на анализе проб крови и выдыхаемого воздуха, которые пока находятся в стадии разработки [11, 12]. При этом, поскольку эти методы не способны указать локализацию опухолевого очага, после их применения в любом случае придется использовать те или иные средства визуализации.

Одним из перспективных направлений в указанной области является бронхоскопия в свете флуоресценции [6, 13]. Большие надежды в начале 1990-x гг. связывали с автофлуоресцентной визуализацией: первые результаты исследований [14, 15] свидетельствовали о существенно большей возможности выявления подозрительных на ранний рак участков слизистой оболочки бронхов по сравнению с исследованием в белом свете. Метод автофлуоресцентной бронхоскопии привлек внимание ученых прежде всего своей простотой, поскольку не требовал введения препаратов и позволял обнаруживать опухоль в зоне возникновения отрицательного оптического контраста без детального анализа изображения. Это послужило основой для промышленного выпуска ряда соответствующих инструментальных систем [7, 16]. В последующем, однако, было показано, что, несмотря на очень высокую чувствительность автофлуоресцентной диагностики (0,92), специфичность ее довольно низкая (0,67) [5], и в настоящее время этот метод используется крайне редко [17–19].

Более перспективным направлением ранней диагностики ЦРЛ и предраковых изменений представляется бронхоскопия в свете индуцированной флуоресценции с помощью экзогенных веществ. Флуоресцентную диагностику, основанную на индуцированной флуоресценции, иногда называют лекарственной или фотодинамической диагностикой, чтобы отличить ее от автофлуоресцентной диагностики. Применительно к ЦРЛ ее можно проводить с использованием фотосенсибилизаторов второго поколения, к которым относятся 5-аминолевулиновая кислота (5-ALA) и препараты хлоринового ряда. 5-ALA является предшественником синтеза эндогенного протопорфирина IX и при его избытке в организме накапливается в интенсивно делящихся клетках, что с успехом используется, в частности, в нейрохирургии для удаления глиобластом под флуоресцентным контролем [20]. Однако неоднократные попытки применения индуцированной 5-ALA флуоресценции для диагностики раннего ЦРЛ не увенчались успехом из-за низкой чувствительности и специфичности [21–23].

Пригодными для целей диагностики оказались фотосенсибилизаторы на основе хлорина е6. При возбуждении ультрафиолетовыми и фиолетовыми лучами они обеспечивают высокий цветовой контраст при визуализации различных опухолей, который позволяет легко отличить их от здоровых тканей по характерной красной флуоресценции [24, 25]. Кроме того, эти фотосенсибилизаторы широко применяются в противоопухолевой ФДТ благодаря высокому квантовому выходу синглетного кислорода и сильной полосе поглощения в красной области спектра [26].

Фотодинамическая диагностика, основанная на «хлориновой» флуоресценции, может проводиться с помощью систем, предназначенных для автофлуоресцентной диагностики, поскольку используемые в них длины волн возбуждения вблизи 400 нм хорошо подходят также и для всех хлориновых фотосенсибилизаторов. Опыт применения таких систем, например SAFE-3000 (Pentax, Япония), позволил японским исследователям достичь высокого уровня визуализации эндобронхиальных опухолей с использованием хлоринового препарата NPe6 [27–29]. Наш опыт работы с аналогичными отечественными фотосенсибилизаторами (Фотодитазин или Радахлорин) подтверждает этот вывод [30].

Тераностический подход

В последние годы в разных областях медицины реализуется принцип «хирургия и терапия с использованием изображений» (image-guided surgery and therapy). Применительно к ЦРЛ такой принцип может основываться на флуоресцентной визуализации и ФДТ при введении только одного химического агента [13]. Основные условия успешности ФДТ — значимое количество фотосенсибилизаторов в опухолевой ткани, достаточное поступление кислорода, а также оптимальное количество и точность подачи световой энергии в процессе проведения ФДТ [31–38].

Нами разработан и исследован метод флуоресцентного контроля эффективности ФДТ, позволяющий совместить в рамках одной процедуры и диагностический, и лечебный компоненты, причем параметры лечебного воздействия корригируются в реальном масштабе времени в зависимости от получаемой диагностической информации [30, 39]. Такой подход, соответствующий тенденции к персонализации современной медицины, может рассматриваться как вариант тераностики (терапия + диагностика) и называться фотодинамической тераностикой. Он предполагает использование двух длин волн излучения, соответствующих максимумам поглощения фотосенсибилизатора хлоринового ряда в областях 398–410 и 660–665 нм [40]. Визуализация красной флуоресценции хлорина е6 в ткани с повышенной концентрацией данного фотосенсибилизатора облегчает выбор зоны облучения и мониторинг его эффективности по исчезновению красного свечения в результате фотовыцветания. В ходе фотодинамического воздействия фотосенсибилизатор в зоне облучения полностью выгорает, но в большинстве наблюдений через несколько минут после прерывания лечебного облучения красная флуо­ресценция в обесцвеченном месте возникает вновь. Такой эффект «фоторазгорания», вероятнее всего, связан с накоплением новой порции фотосенсибилизатора в опухолевой ткани за счет экстравазации его из разрушенных в процессе ФДТ кровеносных сосудов, что дает возможность продолжить фотодинамическое воздействие [30]. Если же перед проведением сеанса ФДТ установлено, что флуоресценция патологического очага отсутствует, т.е. фотосенсибилизатор не накопился в опухолевой ткани в достаточном количестве, ФДТ такому пациенту можно не проводить, так как эффекта от лечения не будет [40].

Таким образом, благодаря флуоресцентной диагностике достигается индивидуализация ФДТ в зависимости от биологических особенностей опухоли в каждом конкретном клиническом случае. При этом детектирующая способность хлориновой флуоресценции весьма высока: из 45 обследованных пациентов со II–IV стадиями центрального немелкоклеточного рака легкого у 43 (96%) отмечалась яркая флуоресценция в зоне опухолевого стеноза [30].

Видеоэндоскопическая система для фотодинамической тераностики центрального рака легкого

Для реализации тераностических технологий в лечении ЦРЛ разработан специальный аппаратный комплекс, представляющий собой созданную на базе бронхофиброскопа мультимодальную платформу с лазерными источниками света и с устанавливаемой на окуляре эндоскопа цифровой видеокамерой [41–43]. Возбуждение видимой флуоресценции осуществляется лазером с длиной волны 405 нм, для фотодинамического облучения применяется лазер с длиной волны 660 нм. Наблюдение в отраженном белом свете осуществляется с помощью RGB-лазеров. Доставка всех диагностических излучений в осветительный канал эндоскопа выполняется по одному и тому же моноволокну. Для фотодинамического воздействия используется вводимый в инструментальный канал эндоскопа дополнительный световодный инструмент. Для одновременного наблюдения двух картин (например, в отраженном белом свете и свете флуоресценции) проводится синхронизированное с камерой поочередное включение соответствующих источников света и отображение полученных кадров с помощью специальной компьютерной программы [41–43].

Приведенные фотографии (рис. 1) иллюстрируют возможность флуоресцентной визуализации с хлорином е6: участок опухоли, незаметный в обычном (видимом) свете, отчетливо виден в свете флуоресценции за счет появления красной компоненты. В качестве фотосенсибилизатора в данном наблюдении использовался препарат Радахлорин, который в дозе 1 мг/кг массы тела больного вводили внутривенно за 2 ч до начала операции. Заключение гистологического исследования материала, полученного из зоны красной флуоресценции в результате прицельной биопсии, — «плоскоклеточный рак легкого».

Рис. 1. Парные фотографии участка слизистой оболочки бронха в белом свете (а) и в свете флуоресценции (б), полученные у пациента с центральным плоскоклеточным раком легкого

Несмотря на высокую детектирующую способность хлориновой флуоресценции, если говорить только о диагностике, причем о диагностике доклинических форм ЦРЛ, использование такого фотосенсибилизатора все же нецелесообразно, поскольку он относительно дорог и требует предварительного введения препарата, что не позволяет реализовать эту технологию в качестве скрининговой. Чтобы решить задачу раннего обнаружения, нужен флуоресцирующий краситель, отличающийся большей доступностью и возможностью его применения непосредственно во время проведения обследования. Таким красителем может служить индоцианин зеленый (ИЦЗ).

Индоцианин зеленый

В фундаментальной медицинской литературе последних лет обсуждается возможность использования для целей диагностики и таргетной терапии механизма накопления химических веществ в опухолевой ткани за счет эффекта повышенной проницаемости и удержания (the enhanced permeability and retention, EPR), который связан с незрелостью сосудов, образующихся в результате неоангиогенеза [44]. Экзогенные молекулы способны проникать через такие сосуды в опухолевую ткань и задерживаться в ней. Одним из веществ, обладающих таким свойством, является ИЦЗ, который достаточно давно используется в клинической практике для оценки функции печени, а также в качестве контрастного агента в офтальмологии. В последние годы круг решаемых с ИЦЗ задач существенно расширился. С его помощью проводятся лимфография, визуализация желчных протоков, осуществляется картирование «сторожевых» лимфоузлов при различных злокачественных опухолях, определяются качество кровоснабжения трансплантатов, герметичность сосудистых анастомозов и др. [45–48]. Особенностью применения ИЦЗ является необходимость возбуждения и регистрации флуоресценции в ближнем инфракрасном (БИК) диапазоне, что требует наличия специального оборудования [49].

Основные преимущества работы в БИК-диапазоне: бóльшая глубина проникновения в ткань такого излучения по сравнению с видимым светом, возможность работы в светлых помещениях, высокая контрастность в связи с низкой автофлуоресценцией. При попадании в кровяное русло ИЦЗ быстро связывается с белками плазмы крови, 95% красителя переносится β-липопротеинами. Выведение его из крови проходит в две фазы [50]: период полувыведения в первой фазе составляет 3–4 мин, во второй — 60–80 мин.

Органическими наноносителями для ИЦЗ могут служить природные наночастицы, такие как сывороточный альбумин (альбумин человека, АЧ) [51, 52]. Связывание ИЦЗ с альбумином приводит к улучшению его свойств в качестве флуоресцирующего маркера — увеличению интенсивности флуоресценции. При исследовании раствора ИЦЗ, связанного с АЧ, установлено, что такое связывание может привести к возрастанию интенсивности флуоресценции ИЦЗ в 180 раз относительно водного его раствора при условии соотношения молекул АЧ/ИЦЗ ≥1 [53]. Другая полезная особенность ИЦЗ + АЧ — высокая стабильность препарата. В отличие от водного раствора ИЦЗ, который быстро теряет флуоресцирующие свойства из-за склонности к агрегации и требует приготовления непосредственно перед применением, ИЦЗ + АЧ не теряет флуоресцентных свойств в течение по крайней мере месяца при условии его хранения при 4°С [53].

В эксперименте на крысах с помощью ИЦЗ-флуоресценции удалось визуализировать участки перевитой подкожно опухоли (лимфосаркомы Плисса) с высокой яркостью и контрастом, причем коэффициент контрастности через 1–3 ч после введения при использовании ИЦЗ + АЧ оказался существенно выше, чем при использовании только ИЦЗ: 3,0–4,9 (ИЦЗ) против 4,6–6,1 (ИЦЗ + АЧ). Раствор ИЦЗ в смеси с альбумином задерживался в патологической ткани в течение как минимум 72 ч, при этом в опыте с двойной окраской (ИЦЗ + Радахлорин) установлено заметное несовпадение зон максимальной флуоресценции, что можно объяснить различием механизмов селективного накопления [53].

Флуоресцентная визуализация с ИЦЗ, основанная на эффекте EPR, использована в ряде клинических исследований, в том числе связанных с раком легкого [54–57]. В этих работах реализован разработанный в США метод, названный TumorGlow, при котором ИЦЗ вводится системно за 24 ч до осмотра и в очень большой дозе — 5 мг/кг массы тела, что более чем в 10 раз превышает дозу, обычно используемую при ИЦЗ-ангиографии. Это в свою очередь существенно удорожает диагностическую процедуру и повышает риск побочных реакций. Поэтому метод TumorGlow непригоден для проведения широкомасштабных скрининговых исследований как по медицинским, так и по организационно-экономическим соображениям.

Нам удалось достичь бронхоскопической визуализации злокачественных опухолевых участков при эндобронхиальных опухолях с применением минимальной дозы ИЦЗ (0,1–0,2 мг/кг) и АЧ, вводимых внутривенно непосредственно перед операцией или в процессе ее проведения [41]. Объяснить данный эффект, при котором оказалась возможной ускоренная ИЦЗ-визуализация опухолей бронхов, непросто, поскольку при других локализациях опухолей ни в эксперименте [53], ни в клинических условиях [58] ее достичь не удалось. Для визуализации ИЦЗ-флуоресценции описанная выше видеобронхоскопическая система была модернизирована путем добавления в нее лазера с длиной волны 808 нм, а также необходимых элементов для регистрации БИК-флуоресценции [39, 59].

Особый интерес представляет серия клинических экспериментов по введению больному сразу двух флуо­ресцирующих препаратов — Радахлорина (за 2 ч до обследования) и ИЦЗ (в процессе проведения бронхоскопии, за 1 мин до флуоресцентной визуализации) [39]. С помощью ИЦЗ-флуоресценции (рис. 2, а) визуализируются с хорошим контрастом все опухолевые узлы, которые выявляются и с помощью Радахлорина (рис. 2, б). Более того, в свете ИЦЗ-флуоресценции удается без труда увидеть узлы, слабо визуализируемые в свете хлориновой флуоресценции.

Рис. 2. Фотографии слизистой оболочки бронха, полученные при двойной флуоресцентной окраске (индоцианин зеленый + Радахлорин) в ближнем инфракрасном свете (а, в) и видимой (б, г) флуоресценции до (а, б) и в конце фотодинамического облучения (в, г)

После окончания этапа флуоресцентной диагностики, который длился около 5 мин, проводилась ФДТ с применением лазера с длиной волны 660 нм. Фотографии (рис. 2, в, г) демонстрируют картину в конце лечебного облучения, когда в результате фотовыгорания красная компонента флуоресценции стала практически не видна, в то же время БИК-картина осталась неизменной. Особенность применения ИЦЗ в данном исследовании [39] заключается в том, что БИК-визуализация проводилась при минимальных дозировках ИЦЗ и введении препарата непосредственно во время обследования. Такую методику с целью отличия от методик с большим интервалом времени между вводом препарата и началом визуализации предложено называть on-site bronchoscopic photodynamic theranostics (OS-BPT) [39]. На внедрении методики OS-BPT могут быть основаны перспективы скрининга раннего ЦРЛ.

Фотодинамическая тераностика в БИК-диапазоне

Так как с целью диагностики и с целью лечения может применяться один и тот же препарат, логично сочетать флуоресцентную диагностику раннего ЦРЛ в БИК-диапазоне и эндобронхиальное малоинвазивное лечение в рамках одной процедуры. Свойства ИЦЗ в качестве фотосенсибилизатора как в растворе, так и в составе наночастиц изучались многими исследователями, однако данные о возможности его применения для ФДТ противоречивы [60–62]. Мы также исследовали этот вопрос в опытах на перевиваемой крысиной опухоли (лимфосаркоме Плисса) [53]. При попытке лечения 21 животного излучение лазером с длиной волны 808 нм при световой дозе 450–850 Дж/см² привело к ингибированию роста опухоли у 12 крыс (57%) и полному исчезновению опухоли у 2 крыс (10%). Эти результаты свидетельствуют, что ИЦЗ является фотосенсибилизатором средней силы и в принципе может использоваться не только для фотодинамической диагностики, но и для ФДТ. Однако по эффективности он уступает хлорину e6, что, по-видимому, объясняется малым квантовым выходом синглетного кислорода (0,12–0,21 — у ИЦЗ [61] и 0,77 — у хлорина e6 [26]). Поэтому использование ИЦЗ в качестве фотосенсибилизатора для ФДТ центрального рака легкого вряд ли целесообразно.

Ситуация может измениться при появлении новых БИК-препаратов с более высоким выходом синглетного кислорода и способностью молекулярного таргетирования. Для усиления специфичности диагностики первичной опухоли при немелкоклеточном раке легкого J.D. Predina с соавт. [57] применили флуоресцентно-контрастный препарат OTL38, представляющий собой конъюгированный с БИК-красителем S0456 фолат, избирательно связывающийся с рецептором фолиевой кислоты α. Этот рецептор слабо выражен или совсем отсутствует в здоровых тканях, но отмечается при нескольких типах рака, в том числе в 86% легочных аденокарцином. Для этой же цели вместо рецепторных лигандов может использоваться конъюгирование БИК-фотосенсибилизаторов c моноклональными антителами [63–65].

ФДТ-опосредованный противоопухолевый иммунный ответ

Еще одно перспективное направление в онкологии связано с возможной стимуляцией противоопухолевого иммунного ответа путем проведения ФДТ. Интерес к иммунотерапии рака существенно вырос в связи с разработкой ингибиторов контрольных точек иммунитета, позволивших достичь существенного прорыва в лечении целого ряда злокачественных опухолей, в том числе и рака легкого. Проведенные в последние годы исследования иммунных реакций после ФДТ показали, что фотодинамическое воздействие может с успехом применяться не только для уничтожения опухоли, но и для мобилизации иммунной системы организма.

Направлению ФДТ-опосредованной иммунотерапии (PDT-mediated immunotherapy), или иммунной ФДТ (photodynamic immunotherapy), в настоящее время посвящено более полутора сотен научных статей и значительное число специальных обзоров [66–77]. К сожалению, лишь небольшое число работ носят клинический характер [78–86], а подавляющее большинство выполнено в виде экспериментов, в том числе с моделированием рака легкого [87–91]. Результаты свидетельствуют, что местное воздействие ФДТ на опухоль приводит к индукции системного противоопухолевого иммунного ответа, способного контролировать ее рост за пределами области лечения, и, следовательно, имеет потенциал в лечении метастазов. Сравнивая противораковые эффекты ФДТ и различных фотосенсибилизаторов для лечения ЦРЛ, J. Usuda с соавт. [92] показали, что благодаря индукции системной иммунной реакции хлориновый фотосенсибилизатор NPe6 оказывал более сильное, чем Фотофрин, противоопухолевое действие, причем частота полного ответа после ФДТ с NPe6 была намного выше, чем после ФДТ с Фотофрином. Вместе с тем иммунное воздействие ФДТ на опухоль достижимо далеко не всегда. Лучшие результаты обеспечивает двухстадийная процедура терапии. На первой стадии проводится облучение с низкой плотностью энергии, которое в результате так называемой сосудистой ФДТ приводит к высвобождению опухольспецифического неоантигена, стимулирующего адаптивный иммунитет, а на второй стадии, отнесенной во времени на несколько часов или даже дней в зависимости от типа фотосенсибилизатора, производится разрушение первичной опухоли излучением большой плотности энергии путем проведения стандартной клеточной ФДТ [93]. Показано, что иммунный ответ при ФДТ может быть получен даже при однократном освещении с использованием нового фотосенсибилизатора Редапорфина (синтетический бактериохлорин, разработанный в Португалии для применения при раке желчевыводящих путей и находящийся на стадии клинических испытаний) [94]. Можно надеяться, что подобные фотосенсибилизаторы, а также фотосенсибилизаторы на основе наночастиц будут способны к еще большей активации Т-клеток в микроокружении опухоли — либо самостоятельно [95], либо в комбинированных схемах при последовательном применении ФДТ с фототермотерапией [96, 97] или совместно с ингибиторами контрольных точек иммунитета [98–101].

Заключение

Первые полученные результаты применения фотодинамической тераностики обнадеживают и позволяют рассчитывать на реализацию ее потенциала применительно к ранней диагностике и малоинвазивному эндоскопическому лечению центрального рака легкого. На данном этапе при подтверждении наличия злокачественной опухоли слизистой оболочки трахеи или крупного бронха путем гистологического исследования прицельно полученного биоптата во время проведения скрининговой бронхоскопии с индоцианином зеленым необходимо выполнение второй бронхоскопии, направленной уже на лечение выявленных ранних очагов с помощью фотодинамической терапии с хлориновым фотосенсибилизатором. Актуальным является вопрос разработки новых фотосенсибилизаторов, которые должны иметь сильную полосу поглощения в БИК-области, быстрое накопление в опухоли, высокий выход синглетного кислорода при БИК-освещении, яркую флуоресценцию и высокую противоопухолевую иммунологическую направленность.

Если такие фотосенсибилизаторы станут доступными для клинической практики, это позволит существенно улучшить возможности ранней диагностики и малоинвазивного лечения центрального рака легкого методом OS-BPT.

Финансирование исследования. Дополнительных источников финансирования нет.

Конфликт интересов отсутствует.