Оценка возможности использования колониеформирующих эндотелиальных клеток для разработки тканеинженерных сосудистых графтов на основании анализа профиля генной экспрессии
Цель исследования — оценка пригодности использования колониеформирующих эндотелиальных клеток для разработки тканеинженерных конструкций на основе изучения профиля генной экспрессии в сравнении со зрелыми эндотелиальными клетками.
Материалы и методы. Для эксперимента использовали колониеформирующие эндотелиальные клетки (endothelial colony-forming cells, ECFC), которые получали из периферической крови пациентов, перенесших чрескожное коронарное вмешательство. Клетки выделяли на градиенте плотности Histopaque 1077 (Sigma-Aldrich, США), затем культивировали в культуральной среде EGM-2MV (Lonza, Швейцария). В качестве контроля использовали коммерческую культуру первичных эндотелиальных клеток коронарной артерии человека (HCAEC). Клетки размораживали и культивировали согласно рекомендациям производителя в среде для роста клеток MesoEndo Cell Growth Medium (Cell Applications, США).
Эксперимент выполняли в специализированных планшетах µ-Luer в перфузионной системе (IBIDI, Германия), обеспечивающей непрерывный однонаправленный поток культуральной среды с напряжением сдвига 5 дин/см2. Контрольные планшеты культивировали в стандартных условиях за аналогичный промежуток времени. Проводили выделение тотальной РНК из клеточных образцов. Экспрессию генов NOTCH4, NRP2, PLAT, PLAU, NOTCH1, FLT1, COL4A2, CD34, SERPINE1, HEY2, MKI67, KLF4, LYVE1, FLT4 оценивали с помощью количественной полимеразной цепной реакции с детекцией результата в режиме реального времени. Экспрессию изучаемых генов рассчитывали по ΔCt-методу, выражали на логарифмической (log10) шкале в виде кратного изменения относительно контрольных образцов.
Результаты. У зрелых эндотелиальных клеток HCAEC под воздействием ламинарного потока статистически значимо увеличились только значения транскрипционного фактора KLF4 и маркера венозной дифференцировки NRP2. У ECFC наблюдали статистически значимое увеличение KLF4, NRP2, CD34 и LYVE1, а также уменьшение экспрессии PLAU. При этом отмечали гиперэкспрессию FLT4, LYVE1, NOTCH4 и NRP2 в ECFC по отношению к HCAEC и гипоэкспрессию HEY2. Также наблюдали характерную для прогениторных клеток гиперэкспрессию CD34. Характерной особенностью ECFC явилось увеличение экспрессии COL4A2, связанного с синтезом коллагена IV типа.
Заключение. Профиль генной экспрессии колониеформирующих эндотелиальных клеток достаточно близок к таковому у первичных эндотелиальных клеток коронарной артерии человека, следовательно, полученные из периферической крови пациентов клетки могут быть использованы при разработке персонифицированных тканеинженерных конструктов.
Введение
Формирование сосудистого протеза в условиях in vitro является одним из перспективных подходов к такому интенсивно развивающемуся направлению, как тканевая инженерия [1]. Данный подход предполагает культивирование клеточной массы на поверхности каркаса с образованием конструкта, пригодного для имплантации в кровеносное русло с целью замены пораженного участка сосуда. Ключевыми вопросами при разработке данного метода являются выбор оптимального источника клеток; выбор материала и метода изготовления каркаса; определение условий культивирования, максимально соответствующих физиологическим.
В качестве возможного перспективного источника эндотелиальных клеток для использования в тканевой инженерии рассматривают эндотелиальные колониеформирующие клетки (endothelial colony-forming cells, ECFC) [2], обладающие высоким ангиогенным потенциалом [3, 4]. Как было показано в многочисленных исследованиях, ECFC могут быть выделены из большого числа источников, включая кровь [5, 6], костный мозг [7], жировую ткань [8], эмбриональные стволовые клетки [9] и многое другое. С точки зрения перспективы дальнейшего использования в клинической практике наибольшее внимание привлекает возможность дифференцировать ECFC из мононуклеарной фракции периферической крови. Преимуществом данного типа клеток по сравнению со зрелыми эндотелиальными клетками является их высокий пролиферативный потенциал [10], позволяющий получать большое количество клеточной массы, что очень важно при формировании тканеинженерных конструктов. При этом возможная гетерогенность ECFC из разных источников, а также влияние тканеинженерного носителя на их функциональные свойства требуют дальнейшего изучения.
Для успешной эндотелизации тканеинженерных сосудистых протезов необходимо создание максимально физиологичных условий, включая действие на клетки напряжения сдвига. Воздействие на эндотелиальные клетки потока жидкости — необходимое условие для их нормальной жизнедеятельности и формирования эндотелиального монослоя [11]. В лабораторных условиях имитация пульсирующего потока достигается посредством использования насосов, создающих поток питательной среды с заданными параметрами, в том числе силой напряжения сдвига.
Целью нашего исследования явилось изучение профиля генной экспрессии ECFC в сравнении со зрелыми эндотелиальными клетками для оценки возможности их использования при разработке тканеинженерных сосудистых графтов.
Материалы и методы
Культивирование клеток. Данное исследование выполнено в соответствии с положениями Хельсинкской декларации (2013) и одобрено Этическим комитетом Научно-исследовательского института комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний. На участие в исследовании получено информированное согласие пациентов.
Для эксперимента использовали ECFC, полученные из периферической крови пациентов с ишемической болезнью сердца (n=8), перенесших чрескожное коронарное вмешательство. Выделение и обогащение ECFC проводили по модифицированному протоколу M. Kolbe с соавт. [12]. Мононуклеарную фракцию выделяли на градиенте плотности Histopaque 1077 (Sigma-Aldrich, США), затем ресуспендировали в культуральной среде EGM-2MV (Lonza, Швейцария), содержащей 5% фетальной бычьей сыворотки (HyClone, США), и высевали в покрытые коллагеном культуральные флаконы. После недели культивирования клетки снимали с поверхности раствором аккутазы (Sigma-Aldrich) и пересевали в культуральные планшеты, покрытые фибронектином. Дальнейший пересев проводили по достижении 70–80% конфлюэнтности. На 19–22-й дни культивирования выполняли иммунофенотипирование и функциональный анализ полученной культуры.
В качестве контроля использовали коммерческую культуру первичных эндотелиальных клеток коронарной артерии человека (human coronary artery endothelial cells, HCAEC) (Cell Applications, США). Согласно информации производителя, клетки были получены из артерий здоровых доноров с криоконсервацией на втором пассаже (500 000 клеток в базальной среде MesoEndo Cell Basal Medium (Cell Applications), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки и 10% диметилсульфоксида). Клетки размораживали и культивировали согласно рекомендациям производителя в среде для роста клеток MesoEndo Cell Growth Medium (Cell Applications).
Для дальнейших экспериментов использовали клетки 6–8-го пассажей. Все манипуляции проводили в стерильных условиях, клетки культивировали в CO2-инкубаторе при 37 °C, 5% CO2.
Для проведения эксперимента культуры ECFC и HCAEC снимали с поверхности и засевали в специализированные планшеты µ-Luer (IBIDI, Германия) в концентрации 1·106 кл./мл и предкультивировали в инкубаторе в течение ночи для формирования монослоя. Затем часть планшетов подключали к насосу, обеспечивавшему непрерывный однонаправленный поток культуральной среды, и культивировали в течение 2 сут при напряжении сдвига 5 дин/см2 (динамика). Остальные планшеты культивировали в стандартных условиях аналогичный промежуток времени (статика). После окончания культивирования анализировали экспрессию генов в изучаемых культурах.
Экспрессия генов. Из клеточных образцов выделяли тотальную РНК, по 4 репликаты на каждую линию клеток. После забора культуральной среды клетки промывали холодным фосфатно-солевым буфером, затем лизировали тризолом (Invitrogen, США). Выделение тотальной РНК осуществляли при помощи набора PureLink RNA Micro Scale Kit (Invitrogen) с сопутствующей обработкой ДНКазой (Sigma-Aldrich). Оценку количества выделенной РНК проводили на спектрофотометре NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, США). Экспрессию генов NOTCH4, NRP2, PLAT, PLAU, NOTCH1, FLT1, COL4A2, CD34, SERPINE1, HEY2, MKI67, KLF4, LYVE1, FLT4 оценивали с помощью количественной полимеразной цепной реакции с детекцией результата в режиме реального времени. Праймеры были синтезированы ЗАО «Евроген» (Москва), использованные последовательности праймеров приведены в таблице. Нормализацию результатов количественной ПЦР проводили с помощью трех референсных генов ACTB, GAPDH и B2M в соответствии с общепринятыми рекомендациями. Экспрессию изучаемых генов рассчитывали по ΔCt-методу, выражали на логарифмической (log10) шкале в виде кратного изменения относительно контрольных образцов.
|
Характеристика праймеров, использованных для проведения исследования |
Статистический анализ. Обработку результатов выполняли в программе GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, США). Данные представлены в виде медианы и квартилей (Ме [25%; 75%]). Сравнение групп проводили с использованием U-критерия Манна–Уитни. Статистически значимыми считали значения p≤0,05. При сравнении ECFC и HCAEC статистически значимые различия экспрессии генов определяли по кратности изменения (fold change) ≥2.
Результаты и обсуждение
Установлено, что у зрелых эндотелиальных клеток HCAEC под воздействием ламинарного потока изменения генного профиля были незначительными. Так, статистически значимо увеличились только значения транскрипционного фактора KLF4 и маркера венозной дифференцировки NRP2 (р=0,03) (рис. 1, а).
|
Рис. 1. Экспрессия генов в культуре ECFC (а) и HCAEC (б) |
Реакция ECFC на действие напряжения сдвига была более выраженной. Как и в случае с HCAEC, наблюдали статистически значимое увеличение KLF4 и NRP2 (р=0,03) (рис. 1, б). Кроме того, отмечали увеличение маркеров CD34 и лимфатической дифференцировки LYVE1, а также уменьшение экспрессии PLAU (урокиназный активатор плазминогена).
С учетом гетерогенности различных линий эндотелиальных клеток подробное изучение их секреторной активности, профиля генной экспрессии и особенностей реакции на специфические раздражители, такие как напряжение сдвига, может помочь при определении пригодности той или иной популяции эндотелиальных клеток к применению в тканевой инженерии сердца и сосудов. В качестве контроля в нашем эксперименте мы использовали линию зрелых эндотелиальных клеток артерии человека, предполагая, что сходство экспериментальной линии с данными клетками должно указывать на возможность их применения для решения задач тканевой инженерии.
Выявлено, что напряжение сдвига не вызывало значимых изменений в профиле HCAEC, за исключением увеличения экспрессии транскрипционного фактора KLF4, связанного с антитромботической и противовоспалительной функцией эндотелия, а также венозного эндотелиального маркера NRP2. Отсутствие выраженной реакции на ламинарный поток может быть в первую очередь связано с низким значением напряжения сдвига. В условиях эксперимента небольшое напряжение часто используется при выращивании в условиях in vitro тканеинженерных конструктов [13, 14]; однако в естественных условиях эндотелиальные клетки подвергаются напряжению сдвига 5–20 дин/см2 [15]. Таким образом, использованное нами в эксперименте значение находится на нижней границе физиологической нормы.
ECFC проявляли бóльшую чувствительность к действию ламинарного потока. При этом примечательным представляется тот факт, что наряду с увеличением экспрессии венозного эндотелиального маркера NRP2 значительно возрастала экспрессия LYVE1, связанного с дифференцировкой лимфатического эндотелия. Кроме того, напряжение сдвига вызывало уменьшение экспрессии PLAU, являющегося компонентом фибринолитической системы, но не PLAT, который также задействован в процессе фибринолиза. Ранее эффект гипоэкспрессии PLAU при нормальном значении напряжения сдвига по отношению к статическому культивированию был показан для зрелых эндотелиальных клеток [16]. В нашем эксперименте данный эффект отмечался только для ECFC, что может быть связано с более низкими параметрами потока и, по-видимому, свидетельствует о большей чувствительности незрелых эндотелиальных клеток к изменению динамического воздействия.
Все изученные гены были разделены на три группы, в зависимости от характера изменения их экспрессии в ECFC по сравнению с HCAEC: гены с повышенной экспрессией, гены без изменения уровня экспрессии и гены с пониженной экспрессией (рис. 2).
|
Рис. 2. Уровень генной экспрессии в культуре ECFC по сравнению с HCAEC |
Сравнение профиля генной экспрессии ECFC и HCEAC в статических условиях культивирования подтвердило эндотелиальный фенотип ECFC, но при этом продемонстрировало его переходный характер, что проявлялось в гиперэкспрессии маркеров лимфатической эндотелиальной дифференцировки LYVE1 и FLT4, гиперэкспрессии маркера NOTCH4, связанного с фенотипом артериальных эндотелиальных клеток, и гиперэкспрессии маркера венозной дифференцировки NRP2 в сочетании с ярко выраженным снижением экспрессии маркера артериальной дифференцировки HEY2. Также отмечалась характерная для прогениторных клеток гиперэкспрессия CD34. Характерной особенностью ECFC явилось увеличение экспрессии COL4A2, связанного с синтезом коллагена IV типа.
Под действием напряжения сдвига указанные тенденции в целом сохраняются. При этом культивирование в ламинарном потоке способствовало увеличению различий фенотипа: при сохранении уровня экспрессии панэндотелиального маркера FLT1 отмечалась гипоэкспрессия NOTCH4. Также наблюдали гиперэкспрессию KLF4, что согласуется с данными о влиянии этого транскрипционного фактора на сигнальный путь Notch [17]. Несмотря на то, что KLF4 ассоциирован с дифференцировкой эндотелиальных клеток [17], при сохранении соотношений в экспрессии маркеров венозной и лимфатической дифференцировки изменение экспрессии NOTCH4 может говорить о негативном влиянии низкого значения напряжения сдвига на артериальную дифференцировку ECFC.
Известно, что ECFC могут быть дифференцированы из большого числа различных источников [5–9]. При этом не до конца изучены особенности ECFC различного происхождения, так же как и их реакция на воздействие специфических раздражителей. Исследования показывают, что реакция ECFC на напряжение сдвига в целом оказывается сходной с таковой у зрелых эндотелиальных клеток [18]. В нашем исследовании профиль ECFC, полученных из периферической крови пациентов с ИБС, оказался близким к HCAEC, однако наблюдались различия в уровне экпрессии отдельных генов, связанных с дифференцировкой различных эндотелиальных линий, которые усиливались под действием ламинарного потока. Расхождения с исследованиями, которые связывают усиление экспрессии маркеров зрелого эндотелия в условиях динамического культивирования в эндотелиальных прогениторных и колониеформирующих клетках с воздействием напряжения сдвига [19], могут быть объяснены в первую очередь различным происхождением клеток, а также отличающимися условиями культивирования и параметрами потока в разных экспериментах.
В ряде исследований проводили успешную эндотелизацию поверхности тканеинженерных скаффолдов с использованием низких значений напряжения сдвига [19, 20]. Подобный подход позволяет за счет щадящих условий культивирования избежать нарушения формирующегося эндотелиального слоя под воздействием потока. Тем не менее полученные нами данные свидетельствуют о необходимости тщательного подбора режимов культивирования, по крайней мере при использовании ECFC, которые будут способствовать формированию зрелого эндотелиального фенотипа клеток.
Заключение
Результаты исследования позволяют утверждать, что профиль генной экспрессии ECFC достаточно близок к профилю HCAEC и, таким образом, полученные из периферической крови пациентов ECFC могут быть использованы при разработке персонифицированных тканеинженерных сосудистых графтов. В то же время необходимо проведение дальнейших исследований по определению особенностей реакции ECFC на напряжение сдвига разной величины, поскольку эти данные могут быть важны для определения оптимальных условий при формировании тканеинженерных конструктов.
Источник финансирования. Работа выполнена при поддержке комплексной программы фундаментальных научных исследований Сибирского отделения РАН в рамках фундаментальной темы Научно-исследовательского института комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний «Патогенетическое обоснование разработки имплантатов для сердечно-сосудистой хирургии на основе биосовместимых материалов, с реализацией пациент-ориентированного подхода, с использованием математического моделирования, тканевой инженерии и геномных предикторов».
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Литература
- Mallis P., Kostakis A., Stavropoulos-Giokas C., Michalopoulos E. Future perspectives in small-diameter vascular graft engineering. Bioengineering (Basel) 2020; 7(4): 160, https://doi.org/10.3390/bioengineering7040160.
- Paschalaki K.E., Randi A.M. Recent advances in endothelial colony forming cells toward their use in clinical translation. Front Med (Lausanne) 2018; 5: 295, https://doi.org/10.3389/fmed.2018.00295.
- Prasain N., Lee M.R., Vemula S., Meador J.L., Yoshimoto M., Ferkowicz M.J., Fett A., Gupta M., Rapp B.M., Saadatzadeh M.R., Ginsberg M., Elemento O., Lee Y., Voytik-Harbin S.L., Chung H.M., Hong K.S., Reid E., O’Neill C.L., Medina R.J., Stitt A.W., Murphy M.P., Rafii S., Broxmeyer H.E., Yoder M.C. Differentiation of human pluripotent stem cells to cells similar to cord-blood endothelial colony-forming cells. Nat Biotechnol 2014; 32(11): 1151–1157, https://doi.org/10.1038/nbt.3048.
- Yoder M.C., Mead L.E., Prater D., Krier T.R., Mroueh K.N., Li F., Krasich R., Temm C.J., Prchal J.T., Ingram D.A. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood 2007; 109(5): 1801–1809, https://doi.org/10.1182/blood-2006-08-043471.
- Ren X., Feng Y., Guo J., Wang H., Li Q., Yang J., Hao X., Lv J., Ma N., Li W. Surface modification and endothelialization of biomaterials as potential scaffolds for vascular tissue engineering applications. Chem Soc Rev 2015; 44(15): 5680–5742, https://doi.org/10.1039/c4cs00483c.
- Ingram D.A., Mead L.E., Tanaka H., Meade V., Fenoglio A., Mortell K., Pollok K., Ferkowicz M.J., Gilley D., Yoder M.C. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood 2004; 104(9): 2752–2760, https://doi.org/10.1182/blood-2004-04-1396.
- Solomon I., O’Reilly M., Ionescu L., Alphonse R.S., Rajabali S., Zhong S., Vadivel A., Shelley W.C., Yoder M.C., Thébaud B. Functional differences between placental micro- and macrovascular endothelial colony-forming cells. Stem Cells Transl Med 2016; 5(3): 291–300, https://doi.org/10.5966/sctm.2014-0162.
- Yu S., Li Z., Zhang W., Du Z., Liu K., Yang D., Gong S. Isolation and characterization of endothelial colony-forming cells from mononuclear cells of rat bone marrow. Exp Cell Res 2018; 370(1): 116–126, https://doi.org/10.1016/j.yexcr.2018.06.013.
- Alphonse R.S., Vadivel A., Zhong S., McConaghy S., Ohls R., Yoder M.C., Thébaud B. The isolation and culture of endothelial colony-forming cells from human and rat lungs. Nat Protoc 2015; 10(11): 1697–1708, https://doi.org/10.1038/nprot.2015.107.
- Joo H.J., Song S., Seo H.R., Shin J.H., Choi S.C., Park J.H., Yu C.W., Hong S.J., Lim D.S. Human endothelial colony forming cells from adult peripheral blood have enhanced sprouting angiogenic potential through up-regulating VEGFR2 signaling. Int J Cardiol 2015; 197: 33–43, https://doi.org/10.1016/j.ijcard.2015.06.013.
- Nayak L., Lin Z., Jain M.K. “Go with the flow”: how Krüppel-like factor 2 regulates the vasoprotective effects of shear stress. Antioxid Redox Signal 2011; 15(5): 1449–1461, https://doi.org/10.1089/ars.2010.3647.
- Kolbe M., Dohle E., Katerla D., Kirkpatrick C.J., Fuchs S. Enrichment of outgrowth endothelial cells in high and low colony-forming cultures from peripheral blood progenitors. Tissue Eng Part C Methods 2010; 16(5): 877–886, https://doi.org/10.1089/ten.tec.2009.0492.
- Liu H., Gong X., Jing X., Ding X., Yao Y., Huang Y., Fan Y. Shear stress with appropriate time-step and amplification enhances endothelial cell retention on vascular grafts. J Tissue Eng Regen Med 2017; 11(11): 2965–2978, https://doi.org/10.1002/term.2196.
- Melchiorri A.J., Bracaglia L.G., Kimerer L.K., Hibino N., Fisher J.P. In vitro endothelialization of biodegradable vascular grafts via endothelial progenitor cell seeding and maturation in a tubular perfusion system bioreactor. Tissue Eng Part C Methods 2016; 22(7): 663–670, https://doi.org/10.1089/ten.tec.2015.0562.
- Fisher A.B., Chien S., Barakat A.I., Nerem R.M. Endothelial cellular response to altered shear stress. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2001; 281(3): L529–L533, https://doi.org/10.1152/ajplung.2001.281.3.l529.
- Dolan J.M., Sim F.J., Meng H., Kolega J. Endothelial cells express a unique transcriptional profile under very high wall shear stress known to induce expansive arterial remodeling. Am J Physiol Cell Physiol 2012; 302(8): C1109–C1118, https://doi.org/10.1152/ajpcell.00369.2011.
- Hale A.T., Tian H., Anih E., Recio F.O. III, Shatat M.A., Johnson T., Liao X., Ramirez-Bergeron D.L., Proweller A., Ishikawa M., Hamik A. Endothelial Krüppel-like factor 4 regulates angiogenesis and the notch signaling pathway. J Biol Chem 2014; 289(17): 12016–12028, https://doi.org/10.1074/jbc.m113.530956.
- Egorova A.D., DeRuiter M.C., Boer H.C., Pas S., Gittenberger-de Groot A.C., Zonneveld A.J., Poelmann R.E., Hierck B.P. Endothelial colony-forming cells show a mature transcriptional response to shear stress. In Vitro Cell Dev Biol Anim 2012; 48(1): 21–29, https://doi.org/10.1007/s11626-011-9470-z.
- Cui X., Zhang X., Guan X., Li H., Li X., Lu H., Cheng M. Shear stress augments the endothelial cell differentiation marker expression in late EPCs by upregulating integrins. Biochem Biophys Res Commun 2012; 425(2): 419–425, https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2012.07.115.
- Tondreau M.Y., Laterreur V., Gauvin R., Vallières K., Bourget J.M., Lacroix D., Tremblay C., Germain L., Ruel J., Auger F.A. Mechanical properties of endothelialized fibroblast-derived vascular scaffolds stimulated in a bioreactor. Acta Biomater 2015; 18: 176–185, https://doi.org/10.1016/j.actbio.2015.02.026.
