Экспресс-анализ хрящевых тканей с использованием многомерного анализа ИК-спектров

Н.Ю. Игнатьева, О.Л. Захаркина, А.П. Свиридов

Ключевые слова: хрящевая ткань; коллаген; гликозаминогликаны; ИК-спектроскопия с нарушенным полным внутренним отражением; метод регрессии на главные компоненты.

Цель исследования — разработка метода диагностики хрящевой ткани разных видов с количественным определением основных компонентов на основе многомерного анализа ИК-спектров и верификация данных с помощью классического химического анализа.

Материалы и методы. В качестве образцов исследованы хрящи носовой перегородки, коленного сустава, ребра и пульпозного ядра межпозвонкового диска, а также трипсинизированные и дефектные образцы хрящей. Получены ИК-спектры образцов хрящей, а также калибровочных смесей коллагена и хондроитина сульфата. Для получения ИК-спектров использовали режим нарушенного полного внутреннего отражения, а для их обработки — программное обеспечение TQ Analyst и калибровочный метод регрессии на главные компоненты. На основе калибровочной зависимости определяли коэффициент K_сп как отношение массовых долей коллагена и хондроитина сульфата. Его значение сравнивали со значением K_хим, равным отношению массовых долей коллагена и хондроитина сульфата, полученных с помощью классического химического анализа этих веществ.

Результаты. ИК-cпектры хрящевых тканей являются суперпозицией ИК-спектров коллагена и хондроитина сульфата и качественно отражают их состав. Изменение соотношения между относительными интенсивностями характеристических полос соединений в ИК-спектре очевидно лишь при значительном изменении содержания этих соединений в хрящах. Такое изменение происходит после трипсинизации, когда K_сп возрастает от 0,88±0,05 (K_хим~0,8) до 4,55. Использование калибровочной модели с полным анализом ИК-спектра хрящей дало возможность определять разницу в соотношении основных компонентов в матриксе разных образцов при отсутствии очевидных изменений в ИК-спектрах. Так, было показано статистически значимое уменьшение содержания хондроитина сульфата в деградированном суставном хряще (K_сп=4,4±1,8; K_хим~5,5) по сравнению с интактными образцами (K_сп=2,8±1,1; K_хим~2,6).

Заключение. ИК-спектрометрический экспресс-анализ хрящевых тканей с применением метода регрессии на главные компоненты позволяет корректно определить соотношение основных компонентов матрикса хряща — коллагена и гликозаминогликанов. Предложенная методика включает одно измерение, не нуждается в длительной и трудоемкой пробоподготовке, не требует длительных, многостадийных и трудоемких химических манипуляций для определения каждого из компонентов, позволяет определить особенности и изменения состава для большого набора образцов хрящевой ткани разных типов. В перспективе такой подход может быть использован для неинвазивной диагностики хрящевой ткани.

Введение

Главными компонентами матрикса хрящевых тканей являются коллаген (структурообразующий белок) и сульфатированные полисахариды гликозаминогликаны (ГАГ), образующие сложные комплексы с белком (протеогликаны и их агрегаты) [1, 2]. Содержание этих компонентов и их соотношение являются одним из важнейших показателей функциональной способности хрящей и хрящевых материалов [1, 2]. Оценка данных показателей проводится при исследовании патологических изменений [3–11] и зональной структуры [12] хрящей, а также при создании их заместителей (скаффолдов) [13]. Для установления надежных корреляций между составом и характеристиками конкретного типа хрящевого материала требуется значительное количество исследуемых образцов.

Классический химический анализ биологических тканей обычно требует многостадийной пробоподготовки, включающей в себя получение растворимых форм (первый этап) и анализ растворов на каждый из компонентов (второй этап). При этом перевод ткани в растворимую форму не может происходить по одной методике и для коллагена, и для ГАГ, а анализ каждого компонента требует специального аналитического оборудования и высокой квалификации персонала.

Исключения многостадийной пробоподготовки и анализа, а следовательно, и использования дорогостоящих расходных реагентов можно достичь, измеряя набор физических величин целостной структуры. В этом случае проблемой останется установление связи между полученным набором физических величин и химической характеристикой. К таким методам относится ИК-спектроскопия. Теоретическая база использования ИК-спектроскопии для анализа, интерпретации и математической обработки ИК-спектров биологических жидкостей и тканей представлена в работе [14]. В работе [15] на примере анализа данных о крови подробно описан оригинальный подход к статистической обработке отношений высот пиков полос поглощения, позволяющий сделать вывод о патологических изменениях в биологической системе.

Возможность использования ИК-спектров хрящевой ткани для оценки содержания в ней основных компонентов обсуждалась еще более 20 лет назад [16]. В ранних работах на качественном уровне показано, что после трипсинизации хряща (и удаления значительной части ГАГ из матрикса) ИК-спектр поглощения в области 700–1700 см^–1 заметно изменяется [16, 17]. Были выделены характерные полосы, относящиеся к отдельным компонентам, и по соотношению интенсивностей пиков этих полос проведены оценки содержания основных компонентов [13, 18, 19]. К сожалению, такой подход не приводит к установлению строгих количественных соотношений между компонентами [12], хотя позволяет качественно картировать содержание ГАГ в хряще [18, 19].

Ситуация изменилась с применением в ИК-спектроскопии формальных методов многомерного анализа больших сложно организованных массивов экспериментальных данных (ИК-спектров многокомпонентных систем). Так, исследователи, создавая собственные алгоритмы обработки с помощью многомерного анализа ИК-спектров хрящевых материалов, получили неплохое согласие в количествах ГАГ, определенных спектральным и химическим методами анализа, в хряще cустава [11], носовой перегородке [12], хрящевых скаффолдах [13], а также провели оценку степени деградации суставного хряща [6]. Появление в программном обеспечении серийных приборов специализированных пакетов программ для многомерного анализа данных существенно облегчает количественное определение двух основных компонентов в матриксе хрящевой ткани. Тем не менее для доказательства достоверности и точности метода анализа ИК-спектральных данных необходимо проводить сравнение конечного результата с данными, полученными традиционными методами.

Особый интерес представляет спектроскопия нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО). Она позволяет выполнять экспрессные измерения спектров хрящей с помощью призменного наконечника, который лишь соприкасается с образцом, что существенно упрощает пробоподготовку. Однако в измерениях спектра участвует лишь приповерхностный слой образца, куда проникает эванесцентное световое поле при полном внутреннем отражении. Понятно, что ИК-спектр приповерхностного слоя образца может отличаться от ИК-спектра, усредненного по объему. Вопрос об адекватности определения состава хрящей методом ИК-спектроскопии НПВО до сих пор остается открытым.

Материалы и методы

Материалы

Носовые перегородки и реберные хрящи свиньи, а также коленный сустав коровы и фрагменты позвоночника кролика и барана были получены с фермы и подвергались предварительной обработке не позднее 12 ч после изъятия.

Образцы отмывали в растворе NaCl и выделяли предназначенные для исследования фрагменты. Для спектрального и последующего биохимического анализа из хрящевых тканей вырезали пластины толщиной 0,5–0,8 мм и площадью примерно 0,5×0,5 см². Такие пластины были выделены из средней части поперечных срезов носовой перегородки и реберного хряща. Для суставного хряща образцы отбирали отдельно из визуально гладких областей и из шероховатых областей с выраженной волокнистостью. Пульпозные ядра извлекали из межпозвонковых дисков. После выделения препараты высушивали в термостате при 37°C в воздушной атмосфере в течение 18 ч и получали их ИК-спектры. После этого каждый препарат делили на равные части, в одной половине образца определяли содержание ГАГ, в другой половине — содержание коллагена.

Одним из компонентов калибровочной смеси был хондроитин-4-сульфат (ХС) (C6737; Merck, США) — один из самых распространенных ГАГ хрящевой ткани. В качестве второго компонента использовали коллаген I типа (C3867; Sigma-Aldrich, США). Калибровочный раствор с массовым соотношением коллагена и ХС от 0,11 до 49,0 помещали на предметное стекло и высушивали в термостате при 37°C от 18 до 24 ч. В результате на предметном стекле образовывалась пленка, которую использовали как стандарт для получения ИК-спектра.

Первая трипсинизация. Препараты хрящевой ткани массой 1,5–2,0 мг помещали в раствор, содержащий трипсин с концентрацией 1 мг/мл и азид натрия с концентрацией 0,2 мг/мл, выдерживали в термостате при 37°C в течение 24 ч. Часть материала образца переходила в супернатант (С1), часть оказывалась нерастворенной (О1). В отдельном эксперименте с хрящом носовой перегородки супернатант декантировали, высушивали в стеклянной чашке Петри и измеряли ИК-спектр полученной пленки. Нерастворенный материал промывали, высушивали и измеряли его ИК-спектр. В остальных случаях вся система подвергалась прогреву и повторной трипсинизации.

Вторая трипсинизация. Оставшиеся после первой трипсинизации супернатант и нерастворившийся остаток прогревали на водяной бане при 85°C в течение 15–20 мин, затем добавляли трипсин до конечной концентрации 2 мг/мл и оставляли в термостате при 37°С еще на 24 ч. Полученную коллоидную смесь центрифугировали, супернатант (С2) декантировали. В отдельном эксперименте центрифугат (О2) и супернатант С2 высушивали и получали их ИК-спектры. Во всех остальных случаях С2 от второй трипсинизации анализировали на содержание ГАГ с помощью спектрофотометрической реакции.

Методы

Определение содержания гликозаминогликанов. Количество ГАГ определяли в супернатанте после второй трипсинизации высушенных образцов. Анализ основан на реакции комплексообразования анионных ГАГ с красителем диметилметиленовым синим (ДММС), которая сопровождается метахромазией. Анализ проводили по методу Фарндэйла [20] с небольшими изменениями, позволяющими существенно уменьшить стандартное отклонение для калибровочной зависимости. Изменения заключались в замене соляной кислоты на уксусную при приготовлении раствора ДММС, в исключении добавления NaCl в этот раствор и в дополнительной обработке раствора красителя в ультразвуковой бане. В качестве калибровочного стандарта использовали растворы ХС (C6737) с концентрацией 1–5 мкг/мл. Оценку содержания комплекса ХС–ДММС проводили методом дифференциальной спектрофотометрии на длине волны 589 нм с использованием спектрофотометра UV-1800 (Shimadzu Co., Япония) и раствора ДММС как раствора сравнения. Для каждого супернатанта измерения проводились 3–5 раз.

Отношение массовых долей коллагена и ХС в образцах хряща обозначали как K_хим.

Определение содержания коллагена. Кислотный гидролизат высушенных образцов хрящей массой 2–5 мг готовили в смеси соляной и трифторуксусной кислот в запаянных стеклянных ампулах при температуре 166ºС. Аминокислотный анализ проводили на анализаторе Hitachi-835 (Hitachi, Япония) в стандартном режиме анализа белковых гидролизатов. Для каждого гидролизата измерения выполняли 3 раза. Содержание коллагена оценивали в предположении, что гидроксипролин составляет 13,5% (массовых) в аминокислотном пуле коллагена.

Получение и обработка ИК-спектров. Спектры образцов регистрировали с помощью инфракрасного Фурье-спектрометра Nicolet iS10 (Thermo Fisher Scientific, США) методом НПВО с использованием специальной приставки с алмазной призмой. ИК-спектры получали в режиме отражения в диапазоне 400–4000 см^–1 с разрешением 0,5 см^–1 и усреднением по 32 сканам, преобразовывали в единицы log (1/R) с помощью алгоритма программы OMNIC. Величина log (1/R) аналогична поглощению, поскольку R — отношение интенсивностей инфракрасной энергии, отраженной от образца и от алмазной призмы без образца.

ИК-спектры в диапазоне 750–1800 см^–1 обрабатывали с помощью программного обеспечения (Thermo Fisher Scientific, США).

Статистическая обработка данных. Экспериментальные данные химического анализа и спектрального анализа нескольких однотипных образцов обрабатывали с использованием пакета программ OriginPro 2015 (OriginLab Corporation, США). Данные представлены в виде М±SD, где М — среднее значение, а SD — стандартное отклонение. Разницу между средними величинами К_сп для образцов суставного хряща, взятых из визуально гладких областей и из шероховатых областей с выраженной волокнистостью, оценивали по двухвыборочному t-критерию Стьюдента. Уровень значимости a priori задали как р=0,05.

Экспериментальные данные спектрального анализа с использованием калибровочного метода регрессии на главные компоненты обрабатывали с помощью программы TQ Analyst, которая обеспечивала среднеквадратичные ошибки калибровки, прогнозирования [21] и коэффициенты корреляции.

Результаты

Чистые компоненты и калибровочные смеси. ИК-спектры чистых компонентов (коллагена и ХС) представлены на рис. 1. Там же представлен ИК-спектр полученной из смеси пленки, состоящей из 70% коллагена и 30% ХС (по массам) с отношением K_хим=2,33.

Рис. 1. ИК-спектры коллагена (кривая3) и хондроитин-4-сульфата (кривая 1) и их смеси с отношением K=2,33 (кривая 2)

Для ИК-спектра коллагена наиболее характерными являются следующие полосы:

интенсивные с максимумами ~1628 и ~1530 см^–1 и менее интенсивная с максимумом ~1236 см^–1, связанные с колебаниями в пептидной группе (полосы Амид I и Амид II);

с максимумами ~1447 и ~1394 см^–1, связанные с деформационными колебаниями групп СН₂ и СН₃;

знаковая для коллагена полоса с максимумом ~1338 см^–1, предположительно связанная с деформационным колебанием группы СН₂ в остатке пролина в полипептидной цепи.

В ИК-спектре ХС проявляются такие полосы:

широкая, в области 1650–1500 см^–1, связанная с колебаниями в N-ацетильной группе (близкой по химической структуре к пептидной группе) и валентными колебаниями С=О в группе СОО^–;

с центрами ~1410 и ~1375 см^–1, связанные с деформационными колебаниями групп СН₂ и СН₃ или СОО^–;

интенсивные с центрами ~1223 и ~1025 см^–1, связанные с валентными симметричными и антисимметричными колебаниями в группе SO₃^– и, возможно, cо скелетными колебаниями С-О-С (~1025 см^–1);

с центром ~1125 см^–1, ассоциированная с пиранозным кольцом;

с центрами ~924 и ~855 см^–1, ассоциированные со скелетными колебаниями групп С-О-С и С-О-S.

На рис. 2 представлена калибровочная зависимость для содержания коллагена в смеси коллаген–ХС, построенная по методу регрессии на главные компоненты. Калибровочный и проверочный наборы (пленки с известным составом) состояли из 20 и 5 объектов соответственно. Среднеквадратичные ошибки калибровки и прогнозирования составляют около 1,9 и 2,3%, а коэффициенты корреляции близки к единице как для моделирования (R_с²=0,997), так и для прогнозирования (R_t²=0,9978). Калибровочная и проверочные линии практически сливаются. На основе калибровочной зависимости определяли K_сп как отношение массовых долей коллагена и ХС.

Рис. 2. Калибровка и проверка смеси коллагена и хондроитин-4-сульфата:

○ — калибровочный набор; × — проверочный набор с известным составом

Хрящ носовой перегородки и его модификация трипсином. В табл. 1 показаны содержание основных компонентов и значения K_хим и K_сп в образце хрящевой ткани носовой перегородки. ИК-спектр исходной ткани представлен на рис. 3 (кривая 2).

Таблица 1. Содержание основных компонентов и значения K_хими K_сп для хряща носовой перегородки (ХНП)

Рис. 3. ИК-спектры исходного хряща носовой перегородки (кривая 2), центрифугированного нерастворимого осадка (О2, кривая 1) и супернатанта (С2, кривая 3) после двойной обработки трипсином и прогрева исходного образца

После первичной трипсинизации образца с K_сп=0,91 по данным спектрального анализа произошло резкое увеличение доли коллагена в нерастворимом остатке О1 (K_сп=4,55) и уменьшение этой величины в пленке супернатанта С1 (K_сп=0,32). Тем не менее после первой трипсинизации заметная часть от исходного количества ХС осталась в нерастворимом остатке О1. После трипсинизации, денатурации и повторной трипсинизации образца с K_сп=0,89 подавляющая часть ХС оказалась в растворе супернатанта С2 (K_сп=0,25), в то время как в нерастворимом остатке О2 оказался преимущественно коллаген (K_сп=13,5). ИК-спектры центрифугата О2 (рис. 3, кривая 1) и пленки С2 (рис. 3, кривая 3) заметно отличаются и приближаются к ИК-спектрам коллагена и ХС соответственно.

В табл. 1 приведено также значение K_сп, усредненное для 11 образцов хрящей носовой перегородки.

Реберный хрящ. Заметим, что ИК-спектры препаратов гиалиновых хрящей (суставных и реберных) принципиально не отличались от таковых для хрящей носовой перегородки. В табл. 2 представлено содержание основных компонентов, а также значения K_хим и K_сп для двух образцов реберного хряща.

Таблица 2. Содержание основных компонентов и значения K_хими K_сп для реберного хряща (РХ)

Суставной хрящ. Образцы суставного хряща отбирались как с гладкой поверхности, так и с шероховатой волокнистой поверхности сустава. В табл. 3 показано содержание основных компонентов и значения K_хим и K_сп для образцов суставного хряща с разной фактурой (по два образца каждой фактуры). Там же приведено значение K_сп, усредненное для 12 образцов с гладкой поверхности и 8 образцов — с шероховатой волокнистой поверхности сустава.

Таблица 3. Содержание основных компонентов и значения K_хим и K_сп для препаратов суставного хряща, полученных с гладкой (СХГ) и шероховатой волокнистой (СХФ) поверхностей

Пульпозное ядро межпозвонкового диска. На рис. 4 показан ИК-спектр препаратов пульпозного ядра межпозвонкового диска кролика и барана. В табл. 4 представлено содержание основных компонентов и значения K_хим и K_cп для разных образцов пульпозного ядра кролика и барана.

Таблица 4. Содержание основных компонентов и значения K_хим и K_сп для пульпозного ядра кролика (ПЯ_кр) и барана (ПЯ_б)

Обсуждение

Основные полосы поглощения в ИК-спектрах коллагена и ГАГ связаны с характерными колебаниями специфических групп в белках [12, 18, 22, 23] и сульфатированных аминосахарах [18, 24, 25]. ИК-cпектры пленок (рис. 1, кривая 3) и хрящевых тканей (см. рис. 3, 4) являются суперпозицией ИК-спектров коллагена и ГАГ, что качественно отражает их состав. Так, c увеличением содержания ГАГ увеличивается относительная интенсивность полос в области 980–1100 см^–1, связанных с колебаниями в пиранозном кольце и группе SO₃^–, и уменьшается интенсивность полос Амид I и Амид II пептидных групп.

Изменения соотношений между характеристическими полосами соединений в ИК-спектре очевидны при значительном изменении содержания этих соединений в хрящах. Например, при сравнении приведенных на рис. 4 ИК-спектров пульпозного ядра кролика (K_сп~0,2) и пульпозного ядра барана (K_cп~1,2) отчетливо заметно усиление поглощения, связанное с колебаниями характерных групп ГАГ в первом случае. Проявление этого эффекта наблюдается и при трипсинизации, которая приводит к разрушению стержневых и связующих белков протеогликанов и их агрегатов и обеспечивает таким образом выход ГАГ в супернатант [26]. В ИК-спектрах твердого остатка полосы поглощения ГАГ гораздо менее выражены, чем в спектрах супернатанта (см. рис. 2).

Рис. 4. ИК-спектры пульпозного ядра межпозвонкового диска барана (1) и кролика (2)

Более точную количественную характеристику состава ткани можно получить, лишь используя калибровочные модели, причем желательно с полным анализом ИК-спектра, а не одного отношения интенсивностей полос [11, 12]. Здесь уместно отметить, что количественный анализ указывает на необходимость повторной трипсинизации после прогрева образцов для переведения подавляющей части ГАГ в супернатант. Лишь после такой обработки ГАГ оказываются полностью доступны для химического анализа.

Определенный двумя методами химический состав хрящей соответствует литературным данным [4–7, 27–29]. Это справедливо как для гиалиновых хрящей, где K_хим меняется от ~1 в носовой перегородке скота [27] до ~3–5 в суставном хряще [30], так и для пульпозного ядра (не относящегося к гиалиновому типу). В последнем случае доля ГАГ может превышать долю коллагена в несколько раз в зависимости от типа животного, и полученные нами значение K_хим и близкое значение K_сп для пульпозного ядра межпозвонкового диска кролика и барана прекрасно согласуются с данными других авторов ([28] и [29] соответственно). Заметим, что и для одного типа хрящевой ткани существуют некоторые вариации величины отношения коллаген/ГАГ. Это иллюстрируется разбросом значений K_сп для нескольких образцов от одного объекта (хрящ сустава, см. табл. 2) или нескольких объектов (носовые перегородки, см. табл. 1). Вариации могут быть связаны как с зональным изменением химического состава в целостной системе, так и с индивидуальными характеристиками биологического объекта [4–7, 27–30].

Данные спектрального ИК-анализа отражают специфику дегенерации суставного хряща [4–7, 18]. Важным показателем этой дегенерации служит уменьшение содержания ГАГ. Мы подтвердили, что значение K_сп значительно больше в образцах хряща с шероховатой поверхностью и выраженной волокнистостью по сравнению с внешне гладкими образцами (см. табл. 2). Заметим, что это выполняется как для образцов, в которых был дополнительно определен показатель K_хим, так и для усредненных значений K_сп.

Важным результатом является совпадение величин K_хим и K_сп для препаратов всех типов хрящей, причем соотношения массовых долей коллагена находятся в широком диапазоне значений. Такое совпадение этих значений, одно из которых (K_сп) получено на целом образце, а другое — как количество окрашенного комплекса ГАГ с ДММС в трипсинате, требует некоторых пояснений. Предположим, что минимальной является ошибка в оценке содержания коллагена, определенного наиболее точным из используемых аналитических методов. В то же время константы связывания ГАГ и красителя ДММС в комплекс для разных ГАГ отличаются и калибровочные кривые для них не совпадают [31], а используемая исследователями калибровочная зависимость получается для конкретного стандарта. Таким образом, нельзя быть уверенным в точном определении суммарного содержания всех ГАГ по измерению поглощения в супернатанте хрящевой ткани после добавления красителя, поскольку в хрящевой ткани присутствуют различные ГАГ, причем в разных соотношениях [32].

Существуют и другие факторы, обусловливающие неточность метода определения ГАГ с помощью ДММС [33], однако до сих пор считается, что он наиболее адекватно позволяет оценить «абсолютное» содержание ГАГ. Что касается ИК-спектров разных ГАГ, то в них нет принципиальных отличий, так как у них одинаковые химические структуры, определяющие характерные полосы в ИК-спектре. Спорным моментом спектрального определения величины K является отличие по составу калибровочных смесей и препаратов ткани. Однако сходство их ИК-спектров позволяет предположить, что остальные (отличные от белков и ГАГ) компоненты незначительно влияют на вид ИК-спектра хрящевых тканей. Еще раз подчеркнем, что мы оцениваем не абсолютное количество коллагена и ГАГ, а только их отношение, которое совпадает со значением коэффициента, определенного на основе химического анализа.

Экспериментальное определение отношения коллаген/ГАГ на основе ИК-спектра (K_сп), полученного с помощью НПВО, не требует многостадийной пробоподготовки, дорогостоящего, длительного анализа, который должен проводить исполнитель высокой квалификации. Кроме того, химическое определение коллагена и ГАГ не может быть сделано в одном образце, а анализируемые образцы могут быть неидентичными. Зная спектральное отношение в образце, можно выбрать и провести более удобный для исследователя анализ одного из компонентов. Количество второго компонента легко рассчитывается. Определение величины K_хим часто является первым в исследованиях изменений хрящевой ткани, и количество образцов может достигать нескольких десятков. В этом случае экспресс-характеристика вариативности химического состава оказывается крайне важной.

Заключение

Инфракрасный спектрометрический анализ в режиме нарушенного полного внутреннего отложения с применением метода регрессии на главные компоненты дает возможность корректно определить соотношение основных компонентов матрикса хряща — коллагена и гликозаминогликанов — и провести предварительную неинвазивную диагностику хрящевой ткани. Предложенная методика является экспрессной и позволяет определить особенности и изменения состава для большого набора образцов хрящевой ткани нескольких типов. Дополнительным преимуществом служит крайне простая пробоподготовка, которая не требует многостадийных и трудоемких химических манипуляций и расхода реагентов.

Финансирование исследования. Исследование проведено в рамках выполнения работ по Государственному заданию Федерального научного исследовательского центра «Кристаллография и фотоника» РАН и по Государственному заданию №АААА-А21-121011990019-4.

Конфликт интересов отсутствует.

Литература

Silver F.H., Kato Y.P., Ohno M., Wasserman A.J. Analysis of mammalian connective tissue: relationship between hierarchical structures and mechanical properties. J Long Term Eff Med Implants 1992; 2(2–3): 165–198.
Muir H. The chondrocyte, architect of cartilage. Biomechanics, structure, function and molecular biology of cartilage matrix macromolecules. Bioassays 1995; 17(12): 1039–1048, https://doi.org/10.1002/bies.950171208.
Rotter N., Tobias G., Lebl M., Roy A.K., Hansen M.C., Vacanti C.A., Bonassar L.J. Age-related changes in the composition and mechanical properties of human nasal cartilage. Arch Biochem Biophys 2002; 403(1): 132–140, https://doi.org/10.1016/s0003-9861(02)00263-1.
Homicz M.R., McGowan K.B., Lottman L.M., Beh G., Sah R.L., Watson D. A compositional analysis of human nasal septal cartilage. Arch Facial Plast Surg 2003; 5(1): 53–58, https://doi.org/10.1001/archfaci.5.1.53.
Karchner J.P., Yousefi F., Bitman S.R., Darvish K., Pleshko N. Non-destructive spectroscopic assessment of high and low weight bearing articular cartilage correlates with mechanical properties. Cartilage 2019; 10(4): 480–490, https://doi.org/10.1177/1947603518764269.
Li G., Thomson M., Dicarlo E., Yang X., Nestor B., Bostrom M.P.G., Camacho N.P. A chemometric analysis for evaluation of early-stage cartilage degradation by infrared fiber-optic probe spectroscopy. Appl Spectrosc 2005; 59(12): 1527–1533, https://doi.org/10.1366/000370205775142593.
Mrosek E.H., Lahm A., Erggelet C., Uhl M., Kurz H., Eissner B., Schagemann J.C. Subchondral bone trauma causes cartilage matrix degeneration: an immunohistochemical analysis in a canine model. Osteoarthritis Cartilage 2006; 14(2): 171–178, https://doi.org/10.1016/j.joca.2005.08.004.
West P.A., Bostrom M.P.G., Torzilli P.A., Camacho N.P. Fourier transform infrared spectral analysis of degenerative cartilage: an infrared fiber optic probe and imaging study. Appl Spectrosc 2004; 58(4): 376–381, https://doi.org/10.1366/000370204773580194.
Franz T., Hasler E.M., Hagg R., Weiler C., Jakob R.P., Mainil-Varlet P. In situ compressive stiffness, biochemical composition, and structural integrity of articular cartilage of the human knee joint. Osteoarthritis Cartilage 2001; 9(6): 582–592, https://doi.org/10.1053/joca.2001.0418.
Laverty S., O’Kouneff S., Ionescu M., Reiner A., Pidoux I., Webber C., Rossier Y., Billinghurst R.C., Poole A.R. Excessive degradation of type II collagen in articular cartilage in equine osteochondrosis. J Orthop Res 2002; 20(6): 1282–1289, https://doi.org/10.1016/S0736-0266(02)00053-0.
Yin J., Xia Y. Proteoglycan concentrations in healthy and diseased articular cartilage by Fourier transform infrared imaging and principal component regression. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc 2014; 133: 825–830, https://doi.org/10.1016/j.saa.2014.05.092.
Yin J., Xia Y. Macromolecular concentrations in bovine nasal cartilage by Fourier transform infrared imaging and principal component regression. Appl Spectrosc 2010; 64(11): 1199–1208, https://doi.org/10.1366/000370210793335124.
Baykal D., Irrechukwu O., Lin P.C., Fritton K., Spencer R.G., Pleshko N. Nondestructive assessment of engineered cartilage constructs using near-infrared spectroscopy. Appl Spectrosc 2010; 64(10): 1160–1166, https://doi.org/10.1366/000370210792973604.
Gordetsov A.S. Infrared spectroscopy of biological fluids and tissues. Sovremennye tehnologii v medicine 2010; 1: 84.
Kogan L.P., Kislitsyn D.I., Krasnikova O.V., Medyanik I.A., Gordetsov A.S. Diagnosis of a disease using the values of statistical functionals calculated from infrared spectroscopic parameters of blood. Sovremennye tehnologii v medicine 2017; 9(4): 25–35, https://doi.org/10.17691/stm2017.9.4.03.
Querido W., Kandel S., Pleshko N. Applications of vibrational spectroscopy for analysis of connective tissues. Molecules 2021; 26(4): 922, https://doi.org/10.3390/molecules26040922.
Potter K., Kidder L.H., Levin I.W., Lewis E.N., Spencer R.G. Imaging of collagen and proteoglycan in cartilage sections using Fourier transform infrared spectral imaging. Arthritis Rheum 2001; 44(4): 846–855, https://doi.org/10.1002/1529-0131 (200104)44:4846::aid-anr1413.0.co;2-e.
Camacho N.P., West P., Torzilli P.A., Mendelsohn R. FTIR microscopic imaging of collagen and proteoglycan in bovine cartilage. Biopolymers 2001; 62(1): 1–8, https://doi.org/10.1002/1097-0282 (2001)62:11::aid-bip103.0.co;2-o.
Ramakrishnan N., Xia Y., Bidthanapally A. Polarized IR microscopic imaging of articular cartilage. Phys Med Biol 2007; 52(15): 4601–4614, https://doi.org/10.1088/0031-9155/52/15/016.
Farndale R.W., Buttle D.J., Barrett A.J. Improved quantitation and discrimination of sulphated glycosaminoglycans by use of dimethylmethylene blue. Biochim Biophys Acta 1986; 883(2): 173–177, https://doi.org/10.1016/0304-4165(86)90306-5.
Родионова О.Е. Интервальный метод обработки результатов многоканальных экспериментов. Дис. … докт. физ.-мат. наук. М; 2008.
Edwards H.G.M., Farwell D.W., Holder J.M., Lawson E.E. Fourier-transform Raman spectroscopy of ivory: II. Spectroscopic analysis and assignments. J Mol Struct 1997; 435(1): 49–58, https://doi.org/10.1016/s0022-2860(97)00122-1.
Manoharan R., Wang Y., Feld M.S. Histochemical analysis of biological tissues using Raman spectroscopy. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc 1996; 52(2): 215–249, https://doi.org/10.1016/0584-8539(95)01573-6.
Cael J.J., Isaac D.H., Blackwell J., Koenig J.L., Atkins E.D.T., Sheehan J.K. Polarized infrared spectra of crystalline glycosaminoglycans. Carbohydr Res 1976; 50(2): 169–179, https://doi.org/10.1016/s0008-6215(00)83848-3.
Servaty R., Schiller J., Binder H., Arnold K. Hydration of polymeric components of cartilage — an infrared spectroscopic study on hyaluronic acid and chondroitin sulfate. Int J Biol Macromol 2001; 28(2): 121–127, https://doi.org/10.1016/s0141-8130(00)00161-6.
Bank R.A., Krikken M., Beekman B., Stoop R., Maroudas A., Lafeber F.P., te Koppele J.M. A simplified measurement of degraded collagen in tissues: application in healthy, fibrillated and osteoarthritic cartilage. Matrix Biol 1997; 16(5): 233–243, https://doi.org/10.1016/s0945-053x(97)90012-3.
Peters T.J., Smillie I.S. Studies on chemical composition of menisci from the human knee-joint. Proc R Soc Med 1971; 64(3): 261–262, https://doi.org/10.1177/003591577106400310.
Ghosh P., Taylor T.K.F., Horsburgh B.A. The composition and protein metabolism in the immature rabbit intervertebral disc. Cell Tissue Res 1975; 163(2): 223–238, https://doi.org/10.1007/bf00221729.
Mizuno H., Roy A.K., Vacanti C.A., Kojima K., Ueda M., Bonassar L.J. Tissue-engineered composites of anulus fibrosus and nucleus pulposus for intervertebral disc replacement. Spine (Phila Pa 1976) 2004; 29(12): 1290–1298, https://doi.org/10.1097/01.brs.0000128264.46510.27.
Fermor H.L., McLure S.W.D., Taylor S.D., Russell S.L., Williams S., Fisher J., Ingham E. Biological, biochemical and biomechanical characterisation of articular cartilage from the porcine, bovine and ovine hip and knee. Biomed Mater Eng 2015; 25(4): 381–395, https://doi.org/10.3233/bme-151533.
Goldberg R.L., Kolibas L.M. An improved method for determining proteoglycans synthesized by chondrocytes in culture. Connect Tissue Res 1990; 24(3–4): 265–275, https://doi.org/10.3109/03008209009152154.
Buckwalter J.A., Roughley P.J., Rosenberg L.C. Age-related changes in cartilage proteoglycans: quantitative electron microscopic studies. Microsc Res Tech 1994; 28(5): 398–408, https://doi.org/10.1002/jemt.1070280506.
Warren S. A critical analysis of the 1,9-dimethylmethylene blue assay for sulfated glycosaminoglycans in synovial fluid. MSc Thesis. Guelph, Ontario: University of Guelph; 2000.