Пластика седалищного нерва аутологичной жировой тканью

Введение

Проблема посттравматической регенерации периферического нерва при диастазе его культей является одним из актуальных вопросов нейрохирургии [1, 2]. В медицинской практике при больших диастазах часто используются аутотрансплантаты здорового афферентного кожного нерва, что в свою очередь приводит к нарушению чувствительности поврежденной конечности [3–6]. Одним из современных направлений в решении данного вопроса является репарация поврежденного нервного ствола с помощью кондуитов (трубок), заполняющихся различными средами, которые стимулируют его регенерацию [5–11]. В качестве наполнителей кондуитов в настоящее время наиболее широко применяют стволовые клетки, взятые из жировой ткани (СКЖТ), из-за их уникальных характеристик. СКЖТ имеют сходный фенотип и профили генной экспрессии с мезенхимными стволовыми клетками красного костного мозга и обладают рядом преимуществ: высоким процентом мультипотентных клеток, низкой иммуногенностью, высокой скоростью пролиферации [7]. Они секретируют ростовые факторы, обеспечивающие потенциал клеточной терапии при конструктивной хирургии [12, 13]. В силу этих свойств СКЖТ являются перспективными наполнителями для кондуитов при тубулировании нервов.

Использование стволовых клеток любых источников связано с определенными рисками и методологическими трудностями: провокация онкологических заболеваний [14], сниженная возможность использования аутологичных клеток при экстренной операции из-за длительности их культивирования и детерминации, например в военно-полевых условиях; законодательное ограничение их клинического применения в ряде стран. Такие трудности обусловливают дальнейший поиск оптимальных способов использования стволовых клеток в регенеративной медицине. Перспективным решением данной проблемы представляется пересадка аутологичной жировой ткани (АЖТ) с присутствующими в ней нативными стволовыми клетками, которые потенциально могут воздействовать на регенерирующие нервные волокна (НВ) [15, 16].

Целью нашего исследования стало изучение структурных изменений аутологичной жировой ткани сальника в силиконовом кондуите и оценка возможности ее использования для регенерации седалищного нерва при диастазе.

Материалы и методы

В исследовании использовались аутбредные крысы-самцы линии Wistar в возрасте 6 мес массой 350–450 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария. При работе с ними соблюдались этические принципы, установленные Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (Страс­бург, 2006).

Эксперименты проводили с использованием изофлурана, наркозного аппарата Zoomed MinorVet («ЗООМЕД», Россия) и концентратора кислорода Armed 7F-3L («АРМЕД», Россия). Животные были разделены на шесть экспериментальных групп и одну контрольную (n=4 в каждой).

Во всех экспериментальных группах крысам выполняли полную перерезку седалищного нерва с правой стороны на уровне средней трети бедра. Концы нерва разводили, вставляли в силиконовый кондуит (трубку), препятствующий формированию соединительнотканного рубца, и скрепляли за эпиневрий шовным материалом 8,0.

В эксперименте использовали трубки длиной 10 мм двух типов: сложной (1-й тип) и простой (2-й тип) конструкции. Кондуит 1-го типа состоял из двух частей с внутренним диаметром 2 мм и центральной части с диаметром 3 мм, что позволяло увеличить объем наполнителя из АЖТ. Кондуит 2-го типа представлял собой цельную трубку с внутренним диаметром 2 мм.

У животных 1-й группы концы перерезанного нерва вставляли в кондуит 1-го типа таким образом, чтобы между ними оставалось фиксированное расстояние в 5 мм. Кондуит заполняли физраствором. Срок наблюдения — 14 нед.

Во 2-й группе животным сначала вскрывали брюшную полость для взятия ткани сальника (1 мл), затем мышцы брюшной полости и кожу ушивали. Далее ткань сальника измельчали в физрастворе и (без предварительной химической обработки) шприцем помещали в кондуит 1-го типа, как и в 1-й группе. Постоперационный срок наблюдения — 4 и 14 нед.

В 3-й группе для выяснения, принимают ли участие клетки АЖТ в формировании регенерирующего нерва, впервые применяли маркировку измельченных тканей сальника прижизненным липофильным красителем РКН 26 (Sigma-Aldrich, США). Данный краситель фиксируется на клеточной мембране и передается в равномерном соотношении дочерним клеткам при митозе [17]. Известно, что РКН 26 сохраняется при трансплантации зрелых жировых клеток в течение 14,5 мес [18]. В этой группе нами была использована известная методика мечения суспензии мультипотентных стволовых клеток красного костного мозга [19, 20] в нашей модификации: без предварительной химической обработки АЖТ сальника и без выделения из него регионарных стволовых клеток.

Измельченную ткань сальника (1 мл) отмывали в физрастворе в центрифуге при 1500 об./мин (3 раза по 5 мин). После слива супернатанта к осадку добавляли 1 мл разбавителя Diluent C (Sigma-Aldrich, США). Затем проводили окраску красителем PKH26GL-1KT (Sigma-Aldrich, США) (4 мкл PKH 26 : 1 мл Diluent C, инкубация 5 мин), окраску останавливали 1% раствором бычьего сывороточного альбумина (BSA) в физрастворе. Окрашенный осадок отмывали физраствором 3 раза по 10 мин при 1500 об./мин. Концы перерезанного седалищного нерва разводили на 5 мм и вставляли в кондуит 1-го типа, предварительно заполненный АЖТ, окрашенной РКН 26. Постоперационный срок наблюдения — 14 нед. Из участка регенерирующего нерва, расположенного в кондуите, изготавливали замороженные срезы толщиной 15 мкм на микротоме Leica CM 1900 UV (Leica Microsystems, Австрия) для флуоресцентного анализа. Срезы были сфотографированы на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе LSM 710 (Carl Zeiss, Германия) и проанализированы.

В 4–7-й группах измельченную ткань сальника (без предварительной химической обработки) помещали в кондуит 2-го типа, закрывающий диастаз 2 мм. Постоперационные сроки наблюдения составили в 4-й группе — 4 нед, в 5-й группе — 14 нед, в 6-й группе — 21 нед, в 7-й группе — 42 нед.

На светооптический и электронно-микроскопический анализ брали формирующийся нерв в области его диастаза у животных всех групп, кроме 3-й группы. Материал фиксировали в 2,5% растворе глутарового альдегида на фосфатно-солевом буфере (PBS) (рН=7,4) и постфиксировали в 1% растворе четырёхокиси осмия с последующим заключением в смесь эпон-аралдит по стандартной методике. Морфологический анализ выполняли на полутонких (0,5 мкм) срезах, изготовленных на ультрамикротоме Leica UC7 (Leica Microsystems, Австрия) и окрашенных метиленовым синим и фуксином, а также на ультратонких срезах (70 нм), окрашенных уранилацетатом и цитратом свинца по Рейнольдсу. Фоторегистрацию срезов проводили на световом микроскопе Eclipse 80i с камерой DS-Fi1 (Nikon, Япония) при увеличении окуляра 10 и объективов — 10 и 20. Морфологический анализ поперечных срезов выполняли в программе NIS Elements BR 4.0 (Nikon, Япония). Ультратонкие срезы анализировали на трансмиссионном электронном микроскопе Morgagni 268D (FEI, США).

В 1-й и 2-й группах проводили тотальный подсчет общего количества регенерировавших НВ, процент содержания в них разных размерных групп: мелких (менее 4 мкм в диаметре), средних (4–7 мкм), крупных (более 7 мкм).

Статистические методы. Количественный анализ нервных волокон различного калибра осуществляли в экспериментальных 1-й и 2-й группах с использованием программы Statistiсa 10.0. Применяли непараметрический критерий Манна–Уитни, статистически значимыми считали значения при р≤0,025.

Результаты

Клиническая оценка состояния поврежденной конечности. Через 14 нед после перерезки седалищного нерва поврежденная конечность у животных 1-й группы имела следующий вид: на пятке наблюдалась большая трофическая язва, голеностопный сустав был сильно утолщен, разгибался на 90–100° (в норме — 180°), пальцы полностью или частично отгрызены, оставшиеся — поджаты; при ходьбе животные плохо опирались на поврежденную конечность (рис. 1, а).

---

Рис. 1. Вид конечности через 14 нед после тубулирования седалищного нерва: а — 1-я группа (кондуит заполнен физраствором); б — 2-я группа (кондуит заполнен аутологичной жировой тканью сальника)

---

Полученные клинические результаты показали, что применение силиконового кондуита, заполненного физраствором, не приводит к полноценному восстановлению конечности.

Во 2-й группе животные при ходьбе хорошо опирались на оперированную лапу, пальцы не были поджаты, при ходьбе расправлялись. В области голеностопа лапа разгибалась на 150–160°, сустав не был утолщен (рис. 1, б). После трансплантации в диастаз АЖТ сальника между культями вновь сформированный участок нерва анатомически значительно превосходил по толщине нерв в условно пустом кондуите.

Морфологический анализ восстановления нерва в области кондуита. При анализе среза седалищного нерва через 14 нед эксперимента в 1-й группе наблюдается один пучок НВ в отличие от нормального строения нерва [21]. Эпиневрий, периневрий и эндоневрий хорошо выражены (рис. 2, а). Преобладают в основном мелкие НВ — 71,7%, средние составляют 26,6%, крупные — 1,7% соответственно от общего количества НВ в данной группе (см. таблицу). В этой группе кровеносные сосуды в оболочках нерва — малого диаметра, встречаются редко. Тотального рубца в области травмы не наблюдается. Клиническая картина и морфологические показатели свидетельствуют о том, что преобладающие мелкие волокна в 1-й группе не позволяют полноценно функционировать нерву. В то же время отсутствие тотального рубца в области диастаза явилось положительным эффектом тубулирования — препятствовало проникновению соединительнотканных элементов в зону травмы.

---

Рис. 2. Поперечные срезы седалищного нерва в области силиконового кондуита через 14 нед после операции: а — 1-я группа; б — 2-я группа; в — интактный нерв [21]. ПНВ — пучок нервных волокон, АЖТ — аутологичная жировая ткань сальника

---

Количество миелиновых нервных волокон в седалищном нерве в экспериментальных группах через 14 нед после операции, %

---

Во 2-й группе морфологический анализ показал, что площадь поперечного сечения нерва значительно превосходит показатель в 1-й группе 1 (рис. 2, б). Все оболочки хорошо выражены. Эпиневрий более развит. Во внутриствольной структуре выявлено преобладание крупных и средних НВ по сравнению с показателями 1-й группы: средних — 53%, крупных — 22% и мелких — 25% (от общего количества НВ в данной группе) (см. таблицу). Усилена васкуляризация по сравнению с 1-й группой (рис. 3). В этой группе на фоне общего количества НВ выявлено преобладание средних НВ, которые в отличие от мелких могут обеспечивать функционирование нерва. Данный факт отмечен и в нашем предыдущем исследовании [21].

---

Рис. 3. Структура нерва в области кондуита во 2-й группе через 14 нед эксперимента ЛО — липидные образования, Кс — кровеносные сосуды, ПНВ — пучок нервных волокон, ФК — фагоцитирующие клетки на периферии ЛО; ок. — ×15; об. — ×20

---

Известно, что СКЖТ, выделенные из подкожного и интерстициального жира, способны встраиваться в регенерирующий нерв, принимать непосредственное участие в его реконструкции, увеличивать экспрессию ряда нейротрофических факторов [16, 22–24].

Клиническое состояние повреждённой конечности животных во 2-й группе показало, что трансплантат из АЖТ является своеобразной «арматурой», направляющей и способствующей регенерации седалищного нерва.

Во 2-й группе восстановленный нерв имеет гетерогенную структуру: соединительнотканная строма с участками фиброза, липидными образованиями пронизана кровеносными сосудами и пучками НВ (см. рис. 2, б и рис. 3). Похожие процессы наблюдались и другими авторами при трансплантации жировой ткани [16, 25], когда после дегенерации и некроза образовывались рубцы и образования, которые они называют липидными кистами. Фагоцитоз адипоцитов макрофагами и их резорбция занимают от нескольких недель до месяцев [26]. По нашим данным, через 14 нед липиды трансплантата полностью не утилизируются и процесс продолжается.

В этот период (14 нед) разные по форме и размеру липидные образования окружены плотно прилегающими по периферии клетками неустановленного фенотипа, участвующими в их утилизации. На ультраструктурном уровне клетки имеют разнообразную форму, отмечаются крупные светлые ядра с ядрышком, у большинства наблюдается расширение цистерн гладкой эндоплазматической сети, цитоплазма заполнена липидными включениями. Признаки активного фагоцитоза появляются через 4 нед (рис. 4, а). По данным ряда авторов [27, 28], шванновские и периневральные клетки утилизируют миелин при валлеровской и ретроградной дегенерации поврежденных периферических НВ. Вероятность участия этих клеток в фагоцитозе липидных образований в нашем эксперименте нельзя исключать.

---

Рис. 4. Срез нерва в области кондуита во 2-й группе: а — 4 нед эксперимента, фагоцитирующие клетки указаны красными стрелками; б — 14 нед эксперимента, фагоцитирующая клетка. ЛО — липидное образование, Я — ядро фагоцитирующей клетки, липидные включения указаны синими стрелками

---

В 4–7-й группах также происходит постепенная утилизация липидных образований. Через 4 нед после трансплантации жировые конгломераты в срезах преобладают, НВ единичны. Через 21 нед эксперимента (6-я группа) АЖТ еще присутствует в небольших количествах, к 42-й неделе (7-я группа) полностью утилизируется, регенерировавший нерв заполняется пучками НВ (рис. 5).

---

Рис. 5. Поперечный срез нерва в области кондуита через 42 нед эксперимента (7-я группа) НВ — нервные волокна

---

В эксперименте [29] измельченная жировая ткань из области спины, помещенная в диастаз на 1 см медианного нерва, через 6 мес не оказывала положительного эффекта на его регенерацию. По мнению авторов, большое количество неутилизированных жировых конгломератов блокировали рост НВ. Вероятно, это связано с большим размером диастаза.

В 3-й группе с применением прижизненной маркировки жировой ткани сальника с использованием PKH 26 наблюдали клетки с красным свечением, содержащие краситель. Они были распределены в трех зонах: поблизости от липидных образований (рис. 6, а, б); вдоль НВ (рис. 6, в) и в эпиневрии (рис. 6, г).

---

Рис. 6. Продольный срез нерва в области кондуита (3-я группа) через 14 нед эксперимента Белыми стрелками указаны области с клетками с красной флуоресценцией, положительными на краситель РКН 26, которые расположены поблизости от ЛО (а, б), вдоль НВ (в) и в эпиневрии (г). ЛО — липидные образования, НВ — нервные волокна

---

На рис. 6, а, б вблизи липидных образований с зеленым эндогенным свечением располагаются небольшие красные клетки с темными округлыми полостями разных размеров. Подобную морфологическую картину наблюдали в работе [22] при изучении культурированных СКЖТ, окрашенных Oil Red O, и объясняли данное явление адипогенетической дифференциальной индукцией в стволовых клетках. Поэтому и в нашем исследовании часть СКЖТ трансплантированного сальника могли дифференцироваться в новые жировые клетки.

Вопрос о выживаемости жировых клеток после измельчения ткани сальника в нашем эксперименте остается открытым. По данным авторов [16, 26, 30, 31], значительная часть адипоцитов в жировом трансплантате подвергается некрозу в течение 24 ч после операции. Мы предполагаем, что в нашем эксперименте жировые клетки, встречающиеся через 14 нед эксперимента, являются новообразованными.

В 3-й группе нами обнаружены клетки с красным свечением вдоль продольно срезанных НВ с зеленым эндогенным свечением. Конечный фенотип данных клеток в нашей работе не устанавливался, однако на препаратах видно, что меченные РКН 26 клетки сальника встроились в новообразованный участок нерва (см. рис. 6, в). Похожие результаты получены и другими авторами в исследованиях с культивируемыми и некультивируемыми СКЖТ.

Авторы работы [22] помещали СКЖТ крыс линии Wistar с бесклеточным аллотрансплантатом в диастаз перерезанного седалищного нерва. Через 12 нед выявили меченные РКН 26 клетки с красной флуоресценцией и повышенную экспрессию нейротрофических факторов BDNF, NT-3, GDNF, что свидетельствовало о длительной выживаемости данных клеток и их стимулирующем эффекте на регенерацию нерва. Следует отметить, что авторы не проводили идентификацию СКЖТ.

Культивируемые СКЖТ человека, предварительно меченные РКН 26, трансплантировались в биодеградируемый поликапролактамовый кондуит, закрывающий диастаз в 6 мм в поврежденном седалищном нерве крысы [32]. Через 12 нед в области трансплантата наблюдались меченные РКН 26 клетки с красным свечением без колокализации с нейротрофином NF, идентифицирующим растущие аксоны. Отсюда авторы сделали вывод, что стволовые клетки не дифференцировались в шванновские клетки. Это могло быть связано с невозможностью окрасить каждую клетку в срезе, и авторы допускают возможность такой дифференцировки.

В работе [24] диастаз на периферическом нерве в 10 мм закрывали силиконовым кондуитом, заполненным смесью некультивированных СКЖТ и коллагена I типа. Степень регенерации в данной группе оценивали удовлетворительно. При этом распределение областей, положительных на РКН 26 и на белок S100, было различным. Поэтому авторы предположили, что трансплантированные некультурированные СКЖТ не дифференцируются в шванновские, но встраиваются в регенерировавший нерв и участвуют в экспрессии нейрулина-1 и сосудистого эндотелиального фактора роста А, которые способствуют пролиферации или миграции шванновских клеток.

Из анализа литературных данных можно сделать вывод, что жировые полустволовые клетки встраиваются в новообразованный нерв в области травмы, но фенотип этих клеток не установлен.

В нашем эксперименте в области эпиневрия также наблюдались клетки с красным свечением, содержащие РКН 26 и имеющие отростчатую форму. Возможно, часть СКЖТ трансформировались в фибробласты. Подобное явление показано и авторами [22] в культуре клеток СКЖТ.

Анализ полученных нами данных дает основания полагать, что стволовые клетки из АЖТ измельченного сальника мигрируют в определенные зоны формирующегося нерва, встраиваются в него и способствуют его реконструкции.

Заключение

Аутологичная жировая ткань измельченного сальника, трансплантированная внутрь силиконового кондуита в область диастаза перерезанного седалищного нерва, динамично изменяется в объеме и структуре, подвергаясь постоянной и значительной резорбции и утилизации, в результате чего наблюдается тенденция к полному исчезновению на отдаленных сроках и замещению ее регенерировавшими нервными волокнами. В процессе структурных изменений жировая ткань, с одной стороны, является на ранних этапах механическим препятствием для растущих нервных волокон, а с другой — оказывает стимулирующее влияние на регенерацию седалищного нерва и восстановление функций поврежденной конечности.

Результаты настоящего исследования дают основание для дальнейшего изучения механизмов влияния аутологичной жировой ткани сальника на посттравматическую регенерацию периферического нерва.

Финансирование исследования и конфликт интересов. Исследование не финансировалось какими-либо источниками, и конфликты интересов, связанные с данным исследованием, отсутствуют.