NGS-технология в мониторинге генетического разнообразия штаммов цитомегаловируса

Введение

В настоящее время молекулярно-генетические методы исследования занимают одно из важнейших мест в диагностике инфекционных заболеваний и эпидемиологическом надзоре за ними. Оснащение современных лабораторий автоматическими капиллярными секвенаторами, использующими метод Сэнгера, а также платформами для массового параллельного секвенирования (NGS) позволяет проводить генотипирование различных возбудителей с целью их эпидемиологического маркирования и совершенствования молекулярно-эпидемиологического надзора за актуальными инфекциями, включая цитомегаловирусную инфекцию.

Цитомегаловирус (ЦМВ) является одной из основных причин врожденной патологии у детей раннего возраста (частота инфицирования плода колеблется в пределах от 6 до 53%, среди недоношенных детей — 70%), а также основной причиной развития осложнений после трансплантации гемопоэтических клеток, солидных органов и возникновения тяжелых пневмоний у ВИЧ-инфицированных больных [1, 2].

Цитомегаловирус — ДНК-содержащий вирус, от­­но­сящийся к отряду Herpesvirales, семейству Herpesviridae, подсемейству Betaherpesvirinae, роду Cytomegalovirus, виду Human herpesvirus 5. Генотип ЦМВ определяется комплексом генов. Известны 12 генов, для которых характерны полиморфизмы: RL5A, RL6, RL12, RL13, UL1, UL9, UL11, UL73, UL74, UL120, UL146 и UL139 [3–6].

В настоящее время используются разные системы генотипирования, основанные на анализе гипервариабельных генов [3]. Наиболее изученными и «аккредитованными» в качестве потенциальных эпидемиологических маркеров являются гены UL55(gB), UL73(gN), UL74(gO), UL144-TNRF [3–5].

Генетическая изменчивость ЦМВ позволяет вирусу реализовать способы иммунного уклонения (например, изменение антигенных эпитопов), увеличить тропизм к клеткам организма-хозяина, повысить эффективность репликации вируса, изменить чувствительность к фармацевтическим препаратам.

Для идентификации вариантов ЦМВ, содержащегося в биоматериалах инфицированных лиц, используют различные методы: анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов ДНК, фрагментное секвенирование по Сэнгеру, генотип-специфическую ПЦР в реальном масштабе времени, массовое параллельное секвенирование. Предпочтительными являются методы анализа ДНК, основанные на секвенировании. С их помощью продемонстрировано, что в мире существует большое количество генетически разнообразных штаммов ЦМВ [7–9].

Полиморфные гены используются как эпидемиологический маркер при изучении циркуляции вируса в человеческой популяции. Геномные варианты ЦМВ-штаммов из различных географических регионов могут быть идентичными, существенно отличаются лишь показатели частоты их встречаемости. При этом имеется вероятность обнаружения редких или новых вариантов ЦМВ в регионах, изолированных от остального мира [3, 7].

Учитывая вариабельность последовательности гена UL55, кодирующего гликопротеин gB, выделяют 7 основных генотипов ЦМВ: gB1, gB2, gB3, gB4, gB5, gB6, gB7 [4, 10]. Показано [4, 5], что замены неконсервативных аминокислот происходят в тех участках, которые имеют функциональную или иммунологическую активность. Ген UL73, кодирующий поверхностный гликопротеин gN, также является полиморфным и позволяет выделить 7 gN-генотипов ЦМВ (gN1, gN2, gN3a, gN3b, gN4a, gN4b, gN4c) [3, 11]. Гликопротеин gN — самый полиморфный среди белков ЦМВ человека [11].

Технология NGS дает возможность секвенировать одновременно тысячи молекул ДНК, тем самым повышая скорость исследования и увеличивая объем получаемых данных. Применение платформ NGS для генотипирования позволяет получать достоверные результаты при существенном сокращении времени, затрачиваемого на их получение и анализ. Кроме того, с использованием NGS-технологии можно в одной реакции определить наличие нескольких штаммов вируса, в том числе и тех, которые присутствуют в минорных количествах [12]. Известно, что у иммунокомпетентных пациентов (ВИЧ-инфицированных или перенесших пересадку органа), а также у новорожденных с врожденной ЦМВ-инфекцией часто наблюдается инфицирование более чем одним штаммом ЦМВ. У пациентов после трансплантации органов на фоне иммуносупрессивной терапии могут реактивироваться штаммы ЦМВ, персистирующие как в организме реципиента до операции, так и в организме донора, при этом штаммы могут принадлежать как одному, так и разным генотипам [8, 13].

Кроме того, рядом исследователей показано [8, 14], что у пациентов с ЦМВ-инфекцией, обусловленной ассоциацией разных генотипов вируса, наблюдается более высокая вирусная нагрузка, и для элиминации ЦМВ требуется более продолжительный временной период.

Цель исследования — оценить возможности применения технологии NGS для генотипирования клинических изолятов цитомегаловируса.

Материалы и методы

Материалом для исследования служили образцы биологических субстратов (лейкоцитарная масса, слюна, моча), взятые у пациентов отделения трансплантологии Приволжского окружного медицинского центра ФМБА России (Н. Новгород), перенесших трансплантацию печени и почек. Отбор и транспортировку клинического материала проводили в соответствии с СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике ин­фек­ционных болезней».

Детекцию ДНК ЦМВ осуществляли методом ПЦР в режиме реального времени с применением диагностических тест-систем «АмплиСенс CMV-FL» (ЦНИИЭ, Москва, Россия). ДНК выделяли с использованием наборов «ДНК-сорб-АМ» и «ДНК-сорб-В» (ЦНИИЭ) в соответствии с инструкцией по применению. Чувствительность тест-систем согласно паспортным данным составляет 1000 вирионов в 1 мл образца.

Для генотипирования отобраны 16 образцов ДНК ЦМВ. Определение генотипов ЦМВ проводили по двум вариабельным генам UL55(gB), UL73(gN) с использованием технологии NGS на платформе MiSeq (Illumina, США). На основе результатов поисковых исследований и анализа источников литературы апробированы 19 пар праймеров (табл. 1).

---

Таблица 1. Характеристика праймеров, использованных для генотипирования цитомегаловируса

---

Дизайн исследования представлен в табл. 2.

---

Таблица 2. Дизайн исследования фрагментов ДНК генома цитомегаловируса с использованием технологии NGS

---

Секвенирование проводили с использованием набора MiSeq Reagent Kit v3 (Illumina, США) на 150 циклов. На первом этапе осуществляли подготовку библиотеки ДНК, которая включала фрагментирование ДНК с последующим присоединением к полученным фрагментам ДНК универсальных олигонуклеотидных адаптеров известной последовательности и индексов с помощью ПЦР. На втором этапе выполняли амплификацию каждого фрагмента ДНК методом ПЦР. Фрагмент ДНК с помощью последовательности адаптера гибридизовали с одним или двумя праймерами, иммобилизованными на твердой поверхности и участвующими в ПЦР. Реакционную смесь, содержащую набор ферментов и пул образцов ДНК, вносили в проточную ячейку прибора MiSeq для секвенирования. Выравнивание и объединение полученного массива данных осуществляли с использованием референсного генома и de novo. Выравнивание и сборку полученных коротких чтений относительно референс-генома проводили с помощью встроенного в секвенатор программного обеспечения.

В качестве референсных были выбраны последовательности генов UL55(gB), UL73(gN) штаммов ЦМВ с известными генотипами, взятые из базы данных GenBank:

полноразмерные геномы GQ466044, HCU66425, FJ527563, BK000394, GQ121041, GQ221975, X17403, AY446894, GQ466044;

последовательности гена UL55(gB): HS5GLYBM, HS5GLYBL, HS5GLYBK, X04606, HS5GLYBI, M60929;

последовательности гена UL73(gN): EU686456, EU686440, AF309995, AF224677, AF390785, AF309993, AF309987, EU686430, AF390802, AF309986, AF309975, AF309974, AF310006, AF309988, AF309980, AF309975, AF309969, GU647095, GU441773, GU376726, GU376725, GU376724, GU376723, GU376721, GU376720.

Результаты

На основании анализа данных литературы были отобраны праймеры, используемые разными исследователями для определения генотипа ЦМВ по генам UL55(gB) и UL73(gN).

Критериями отбора праймеров служили их соответствие анализируемой области гена, чистота нарабатываемого ПЦР фрагмента, оптимальная температура отжига, размер получаемого фрагмента. Для генотипирования по гену UL55(gB) рассматривались праймеры, предложенные шестью авторами [4, 15–19]. Все авторы в качестве целевого фрагмента для разделения генотипов предложили вариабельную область, расположенную на N-конце белка gB. Из исследования были исключены праймеры, предложенные J.J. de Vries с соавт. в 2012 г. [19], которые рекомендовали использовать для каждого gB-генотипа отдельные пары праймеров, фланкирующие фрагменты размером 92 п.н. Для изучения каждого образца они использовали четыре пары праймеров, что увеличивало продолжительность исследования. Такой подход оправдан при определении генотипа методом ПЦР с электрофоретической детекцией амплифицированных фрагментов в агарозном геле, но недопустим при определении генотипа методом секвенирования, запланированным в нашем исследовании. Праймеры, предложенные D.M. de Albuquerque и S.C. Costa в 2003 г. [15], фланкируют вариабельную область, расположенную ближе к С-концу белка gB, размером 305 п.н. Оставшиеся варианты праймеров захватывали примерно одну и ту же область, расположенную на N-конце белка gB, размер которой варьировал от 256 до 522 п.н. Следует отметить, что пары праймеров для nested-ПЦР, предложенные M. Barbi с соавт. в 2006 г. [16], захватывают область, предшествующую области гена UL55, и фланкируют самый большой фрагмент гена длиной 522 п.н. Нами откорректирована нуклеотидная последовательность 5’-праймера для генотипирования по гену UL55(gB), предложенного S.W. Chou, K.M. Dennison в 1991 г. [4].

Вариабельные нуклеотиды были заменены на вырожденные. Все пары праймеров сначала апробировали на контрольном штамме ЦМВ AD169, а затем на клинических образцах. Наилучшие результаты получены при использовании праймеров, предложенных также S.W. Chou, K.M. Dennison в 1991 г. [4].

С целью выбора оптимальных праймеров для генотипирования ЦМВ по гену UL73(gN) анализировали праймеры, предложенные тремя авторами [11, 18, 20]. Праймеры, предложенные L.F. Lisboa с соавт. в 2012 г. [20], были разработаны для проведения nested-ПЦР и при проверке оказались комплементарными области гена UL72, а не UL73, поэтому были исключены из анализа. Праймеры, предложенные J. Grosjean с соавт. в 2009 г. [18], в целом перекрывают ту же вариабельную область гена UL73, что и праймеры, предложенные S. Pignatelli с соавт. в 2003 г. [11], однако наблюдается сдвиг в области посадки праймера и при этом длина нарабатываемого фрагмента увеличивается на 20 п.н. Сравнительный анализ эффективности работы праймеров на клинических образцах показал, что частота выявления специфического фрагмента с использованием пары праймеров, предложенных S. Pignatelli с соавт. [11], существенно выше.

Таким образом, для генотипирования ЦМВ по генам UL55 и UL73 отобраны праймеры, предложенные S.W. Chou, K.M. Dennison в 1991 г. и S. Pignatelli с соавт. в 2003 г. соответственно [4, 11].

В ходе работы определен оптимальный объем образца для проведения реакции — 10 мкл. Подобраны оптимальные условия проведения ПЦР: температура и время отжига праймеров, количество циклов в реакции. В результате установлены следующие условия: 98°С — 2 мин; 98°С — 10 с; 55°С — 15 с; 72°С — 1 мин; 40 циклов (рис. 1 и 2).

---

Рис. 1. Электрофореграмма продуктов амплификации. Анализ работы праймеров для гена UL55(gB) на клинических образцах Размер фрагмента гена UL55(gB) составил 356 п.н. Треки 1–6 — клинические образцы; трек 7 — контрольный образец; трек 8 — отрицательный контроль; трек 9 — ДНК-маркер

---

Рис. 2. Электрофореграмма продуктов амплификации. Анализ работы праймеров для гена UL73(gN) на клинических образцах Размер фрагмента гена UL73(gN) — 406 п.н. Треки 1–6 — клинические образцы; k — ДНК-маркер

---

Анализ результатов секвенирования генов UL55 и UL73 позволил определить пейзаж генотипов ЦМВ, циркулирующего среди населения одного региона России. В частности, у пациентов, перенесших пересадку солидных органов, идентифицировано 4 gB-генотипа ЦМВ: gB2, gB1, gB3, gB4 (показано по частоте встречаемости). У одного пациента установлено одновременное присутствие ЦМВ двух генотипов — gB3 и gB4.

Анализ результатов секвенирования фрагментов гена UL73 клинических изолятов ЦМВ, выделенных у реципиентов солидных органов, позволил обнаружить 5 gN-вариантов: gN4c, gN4a, gN4b, gN1, gN3b.

У некоторых пациентов установлено одновременное присутствие ЦМВ нескольких gN-генотипов: у реципиентов печени выявлена ассоциация двух и трех генотипов: gN4c, gN4b и gN3b, gN4a, gN1, у двух реципиентов почек — gN4с, gN1 и gN4c, gN4a.

Полученные данные показывают, что технология NGS позволяет проводить детальный и глубокий анализ генетической вариабельности вирусных возбудителей инфекционных заболеваний, необходимый для решения как фундаментальных, так и практических задач эпидемиологии, а также определять наличие ассоциаций различных генотипов ЦМВ в образце клинического материала, что существенно влияет на выбор этиотропной терапии пациента.

Обсуждение

Современные молекулярные технологии NGS являются наиболее перспективными и высокоточными методами для оценки генетического разнообразия возбудителей инфекционных болезней, включая ЦМВ-инфекции.

В результате поисковых работ были выбраны пары праймеров, условия проведения реакции и дизайн анализа полученных результатов.

В настоящее время для дифференциации клинических изолятов ЦМВ зарубежные исследователи в качестве потенциальных эпидемиологических маркеров используют наиболее изученные гены: UL55(gB), UL73(gN), UL74(gO), UL144-TNRF. Частота встречаемости генотипов ЦМВ в разных географических регионах мира различна и определяется контингентом обследованных. Так, установлено, что в группе ВИЧ-инфицированных в основном доминирует генотип gB2, в группе пациентов, перенесших пересадку органов, чаще встречаются генотипы gB1 и gN3a, среди детей с врожденной ЦМВ-инфекцией превалируют генотипы gB1, gB2 и gN4c, gN4a [14, 21–24].

Подобранные нами параметры генотипирования с использованием технологии NGS позволили определить, что в клинических образцах, полученных от реципиентов солидных органов, доминируют генотипы gB2 и gN4c ЦМВ. В некоторых случаях ЦМВ-инфекция у пациентов обусловлена ассоциацией двух и трех генотипов ЦМВ, что дала возможность установить NGS-технология.

Полученные нами данные показывают, что NGS-технология позволяет проводить одновременный поиск всего спектра генотипов ЦМВ, присутствующих в одном образце, и определять не только генотип, но и региональную типовую структуру популяции ЦМВ. Такие исследования необходимы при обследовании лиц из групп риска по ЦМВ, включая детей первых лет жизни и пациентов, перенесших пересадку органов. Кроме того, как уже было сказано, ЦМВ-инфекция, обусловленная ассоциацией нескольких генотипов ЦМВ, может протекать более тяжело и для элиминации вируса требуется больше времени.

Исследования, направленные на изучение генетического разнообразия ЦМВ, необходимы для получения новых знаний о распространенности его различных геновариантов среди населения, повышения качества диагностики ЦМВ-инфекции, эффективного контроля групп риска.

Заключение

Использование технологии NGS для изучения генетического разнообразия цитомегаловируса дает возможность оптимизировать молекулярный мониторинг возбудителя цитомегаловирусной инфекции, проводить динамический контроль групп риска (беременных, новорожденных, детей первого года жизни и пациентов, перенесших трансплантацию солидных органов), прогнозировать эпидемиологическую ситуацию по цитомегаловирусной инфекции и совершенствовать систему эпидемиологического надзора за инфекциями в целом. Сведения о генотипах циркулирующего цитомегаловируса позволяют получать объективную информацию о региональных особенностях генотиповой структуры популяции ЦМВ, что открывает новые перспективы в области разработки вакцин и иммунобиологических препаратов.

Источник финансирования. Исследование проведено в рамках отраслевых научно-исследовательских программ на 2016–2020 гг. «Проблемно-ориентированные научные исследования в области эпидемиологического надзора за инфекционными и паразитарными болезнями» — НИР №AAAA-A16-116040810130-9 и на 2021–2025 гг. «Научное обеспечение эпидемиологического надзора и санитарной охраны территории Российской Федерации. Создание новых технологий, средств и методов контроля и профилактики инфекционных и паразитарных болезней» — НИР №121092300068-2.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.