Практические аспекты использования мультифрактального формализма для оценки морфологии биологических тканей

Введение

В классическом представлении гистологический анализ не предполагает получения исчисляемых показателей, однако в последнее время в дополнение к нему для получения количественных характеристик все чаще используют анализ изображений [1–3]. Количественные характеристики позволяют сопоставлять результаты большого числа экспериментов и применять их для моделирования [4–5]. При количественной оценке морфологии биологических тканей возникает проблема определения оценочных критериев. В настоящее время в научной и клинической практике для анализа гистологических изображений используют различные параметры, в частности степень дифференциации тканей на основании оценочной шкалы D. Gleason [6]. Данный подход и прочие близкие к нему применимы только для оценки специфических патологий, например новообразований, и не позволяют диагностировать и классифицировать другие изменения. В ряде работ [7–9] при исследовании неопухолевых патологий обсуждаются критерии для изучения изображений биологических тканей средствами анализа изображений. Отмечается, что для оценки организации нейронов применима фрактальная размерность, а для описания альвеолярного рисунка — показатели дендритной геометрии.

Зачастую структура гистологических изображений не может быть описана одним фрактальным множеством. Она представляет собой комплекс нескольких фракталов, накладываемых друг на друга, каждый из которых имеет свою собственную размерность [10]. Подобная многофрактальная природа гистологических изображений обусловлена тем, что биологические процессы развиваются по степенны́м законам и, следовательно, их фазовые портреты характеризуются неоднородным распределением некоторой меры, которое может быть описано с использованием не одной, а нескольких шкал (масштабов) [7]. Именно поэтому перспективным методом получения характеристик изображения является мультифрактальный формализм [11–13].

В качестве универсального оценочного подхода предлагается использовать характеристики мультифрактального спектра изображений биологических тканей [8].

Прямое вычисление мультифрактального спектра гистологических изображений, как правило, малоэффективно из-за наличия артефактов, которые могут привести к недостоверному результату, поэтому применение мультифрактального формализма требует специализированной подготовки изображений. Актуален поиск методических подходов по использованию мультифрактального анализа изображений применительно к оценке морфологии биологических тканей и объектов.

Цель исследования — выявление практических аспектов использования мультифрактального формализма для оценки морфологии биологических тканей.

Материалы и методы

В качестве объектов исследования использовали гистологические изображения тканей легких крыс линии Wistar без патологии и с выявленными патологическими изменениями (рис. 1), полученные при увеличениях 50, 100, 200.

---

Рис. 1. Ткань легких крыс линии Wistar: а — без патологии; ×200; б — с гиперплазией лимфоидной ткани, ассоциированной со стенкой бронхов, и распространенным васкулитом; ×200; в — с альвеолярным отеком легких; г — с интерстициальной пневмонией; ×200

---

Гистологический материал был получен от экспериментов, условия которых соответствовали требованиям Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (ETS №123), и этического комитета Федерального научного центра медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения.

В исследовании рассматривали изображения тканей легких с установленной гиперплазией лимфоидной ткани, ассоциированной со стенкой бронхов с примесью эозинофилов и распространенным васкулитом, интерстициальной пневмонией и альвеолярным отеком легкого.

Изображения получены с помощью микроскопии препаратов тканей легких. Для их приготовления органы фиксировали в 10% водном нейтральном растворе формалина и после обезвоживали в спиртах восходящей концентрации, затем пропитывали хлороформом и парафином и заливали гомогенизированной парафиновой средой Гистомикс (BioVitrum, Россия). Гистосрезы толщиной 4 мкм получали на санном микротоме модели JUNG SM2000R (Leica Microsystems, Германия), окрашивали гематоксилином и эозином. Осмотр и получение изображений морфологического строения тканей проводили на светооптическом микроскопе Axiostar (Carl Zeiss, Германия).

В работе [14] отмечается, что одним из возможных средств минимизации влияния артефактов при анализе изображений являются бинаризация, выделение контура и его скелетонизация. Обработку изображений выполняли с применением универсального программного обеспечения ImageJ/Fiji (программное обеспечение с открытым кодом, разработчик — Wayne Rasband, National Institutes of Health (США)).

Перед мультифрактальным анализом изображения переводили в полутоновые черно-белые, а затем — в двухцветные методом бинаризации с пороговым значением, равным 220 (рис. 2, а).

Для бинарных изображений оценивали величину лакунарности. Данный показатель является мерой неоднородности заполнения пространства паттерном (узором), который в данном случае представляет собой альвеолярный узор. Возрастание показателя величины лакунарности указывает на увеличение числа хаотичных провалов в паттерне.

В данном исследовании мерой лакунарности (L) является изменение плотности изображения при сканировании сеткой с ячейками различных размеров (использовали квадратные ячейки размером от 1 до 60 пикселей). Для расчета лакунарности применяется следующая формула:

L=(σ/μ)²,

где σ — стандартное отклонение количества пикселей (для бинарного изображения) фрактального агрегата в ячейках сетки заданного размера; µ — среднее значение массы агрегата или среднее число пикселей в ячейках заданного размера.

Лакунарность определяли по наклону регрессионной линии в координатах ε/L (ε — размер ячейки сетки в долях от размера растра) и по диапазону значений L для ε=0,01÷0,6. При построении графиков лакунарность рассчитывали по формуле

L=(σ/μ)2+1,

где 1 используется для равномерного отображения графика при нулевом стандартном отклонении (σ=0).

У полученных бинарных изображений выделен контур с помощью функции outline (рис. 2, б), а затем проведена его скелетонизация (рис. 2, в). В результате обработки изображения тканей легких представляли собой изображения двойного линейного контура альвеолярного узора, которые использовались для получения мультифрактального спектра. Для вычисления мультифрактального спектра изображений, обработанных с получением линейного контура, использовали модуль для ImageJ — FracLac. С помощью данного модуля устанавливали скейлинговую экспоненту (функцию показателя Реньи, (q)) и непосредственно спектр сингулярности. Для спектра сингулярности определяли следующие параметры: ширину и высоту спектра; ширину и высоту правой и левой ветвей [15].

---

Рис. 2. Изображения тканей легких крыс линии Wistar, подготовленные для анализа: а — результат бинаризации, б — результат выделения контура, в — результат скелетонизации контура

---

Результаты и обсуждение

Результаты оценки лакунарности альвеолярного узора представлены на рис. 3 и в табл. 1. На рис. 4 показаны спектры сингулярности, характерные для обработанных изображений гистологических тканей легких; характеристики спектров приведены в табл. 2.

---

Рис. 3. Функции лакунарности изображений

---

Таблица 1. Характеристика лакунарности паттерна альвеолярного узора

---

Рис. 4. Спектры сингулярности изображений D0 — монофрактальная размерность, Dq — информационная размерность

---

Таблица 2. Характеристика мультифрактальных спектров гистологических изображений

---

Для тканей с патологией показатель лакунарности паттерна альвеолярного узора был ниже, чем для тканей без патологий. Локальное возрастание показателя лакунарности в диапазоне значений ε=0,4÷0,5 связано, по всей видимости, с физиологической особенностью тканей, а именно с появлением в альвеолярном рисунке кровеносных сосудов. В наибольшей степени по показателю лакунарности идентифицируется альвеолярный отек. Для изображений тканей с патологией при увеличении 50 и 100 показатель лакунарности близок к нулю, что в совокупности с линейным характером зависимости скейлинговых экспонент для данных изображений (рис. 5) является признаком монофрактальности. При увеличении 200 спектр сингулярности для тканей с патологией, напротив, обладает выраженными признаками мультифрактальности, однако характеристика спектра отличается от аналогичных показателей, свойственных тканям без морфологических патологий. Так, в присутствии патологии высота спектра была ниже на 0,2; ширина спектра — больше на 0,3; при этом соотношение между показателями ширины правой и левой ветвей оставалось аналогичным тому, что наблюдалось для тканей без патологий.

---

Рис. 5. Скейлинговые экспоненты изображений

---

Для тканей, в которых не обнаружены патологии, спектры сингулярности обладают признаками мультифрактальности независимо от того, при каких увеличениях были получены изображения. Однако по мере возрастания степени увеличения гистологических изображений параметры спектров изменяются, а именно равномерно увеличивается ширина спектра и снижается его высота; при этом соотношения показателей правой и левой ветвей сохраняются. При увеличении 200 высота правой и левой ветвей незначительно сокращается относительно аналогичных показателей, наблюдаемых при увеличении 100. Эти изменения спектров при возрастании увеличения соответствуют уменьшению количества альвео­л в поле зрения и более отчетливому контуру альвеолярного рисунка.

В целом спектр изображения ткани с патологией смещен влево относительно спектра, характерного для ткани без патологии. Последнее в совокупности с гистологическим анализом указывает на растущее доминирование лимфоидной ткани, свойственное ее патологической гиперплазии.

Уменьшение ширины спектра сингулярности, характерное для изображений с патологией, указывает на более равномерное распределение структурных составляющих такой ткани, чем ткани без патологии, т.е. периодичность (ритм) паттерна альвеолярного узора нарушается; применительно к легочной ткани это указывает на сокращение альвеолярных просветов. Снижение высоты спектра при наличии патологии указывает на «упрощение» альвеолярного рисунка, которое предположительно связано с наличием распространенного васкулита, так как из-за него на изображении появляются участки кровоизлияний. Это приводит к выравниванию контура альвеолярного рисунка, площадь поверхности альвеол сокращается и возникают участки, заполненные эритроцитами.

Наиболее примечательно, что на меньших увеличениях изображения с патологией утрачивают признаки мультифрактальности. Предположительно отсутствие признаков мультифрактальности также связано с тем, что из-за общей отечности и очагового распределения эритроцитов контуры узора сглаживаются. В связи с этим характерные детали проявляются только при большем увеличении.

Спектры сингулярности изображений отдельных патологических проявлений, а именно альвеолярного отека и интерстициальной пневмонии, при увеличении 200 близки к спектру, характерному для патологических изменений в целом. Они имеют такую же высоту и практически равную ширину, которая, однако, больше, чем для патологических изменений в целом, что связано с нарушением чередования альвеолярных пространств в паттерне узора, характерного для тканей легких. Спектр, наблюдаемый при альвеолярном отеке, в наибольшей степени смещен влево, что подтверждает предположение о доминировании патологического компонента в структуре ткани.

Заключение

Предложены методические подходы к использованию мультифрактального формализма для оценки морфологии биологических тканей. Установлено, что корректных результатов оценки мультифрактальных спектров гистологических изображений можно достичь при степени увеличения 200 и предварительной обработке с получением линейных контуров. Оценочными критериями при количественной характеристике биологических тканей методом мультифрактального анализа служат статистические характеристики спектра сингулярности. Значительные отличия между морфологическим строением тканей легких с патологией и без нее фиксируются при сопоставлении высоты, ширины и положения спектра относительно начала координат. Лакунарность не является универсальным оценочным критерием.

Финансирование. Работа выполнена без отдельного финансирования.

Конфликт интересов отсутствует.