Использование магнитных частиц для быстрого определения иммунореактивной фракции VHH-антител против PD-L1, меченных ⁶⁸Ga

К.О. Авров, С.В. Шатик, В.В. Зайцев, Р.И. Аль-Шехадат, О.A. Шашкова, Л.А. Терехина, И.С. Малахов, М.П. Самойлович

Ключевые слова: магнитные частицы; иммунореактивная фракция; радиоиммуноконъюгат; VHH-антитела.

Количественное определение иммунореактивной фракции (ИРФ) меченных радиоактивными изотопами антител или их фрагментов необходимо для оценки специфической активности радиофармпрепаратов. Для этого традиционно используют клетки, экспрессирующие на своей поверхности молекулы-мишени, однако такой анализ занимает много времени и имеет проблемы со стандартизацией.

Цель исследования — разработать быстрый и надежный метод количественного определения ИРФ меченных ⁶⁸Ga VHH-антител к PD-L1, основанный на использовании магнитных частиц, покрытых молекулами антигена.

Материалы и методы. Мы использовали магнитные частицы, покрытые протеином А. На частицах иммобилизовывали антиген, конъюгированный с Fc-фрагментом (PD-L1-Fc). Определение значения ИРФ меченных радионуклидом ⁶⁸Ga наноантител (VHH) против PD-L1 (⁶⁸Ga-VHH-PD-L1) проводили как при помощи магнитных частиц, покрытых молекулами антигена, так и с использованием клеток, экспрессирующих антиген на своей поверхности. При конъюгации VHH-антител с радионуклидом ⁶⁸Ga молекулы белков модифицировали бифункциональными хелатирующими агентами: тетраазациклододекантетрауксусной кислотой (DOTA) или дефероксамином (DFO). Величину ИРФ определяли как отношение радиоактивности, специфически связавшейся с частицами или клетками, к общей радиоактивности, добавленной в пробу.

Результаты. Доказана специфичность связывания радиоиммуноконъюгата ⁶⁸Ga-VHH-PD-L1 с магнитными частицами, покрытыми антигеном. Установлены особенности метода, которые необходимо учитывать при его использовании. Проведенное исследование не выявило существенных различий при оценке ИРФ с помощью клеток, экспрессирующих антиген, и с помощью магнитных частиц. При этом использование магнитных частиц с иммобилизованными молекулами антигена позволяет провести определение ИРФ радиоиммуноконъюгата за 15 мин, что имеет принципиальное значение для рутинной оценки специфичности радиофармпрепаратов, содержащих короткоживущие изотопы.

Введение

Радиоиммуноконъюгаты, созданные на основе антител или их фрагментов, используют для диагностики и терапии опухолевых заболеваний с целью адресной доставки радионуклидов к клеткам, имеющим на своей поверхности соответствующие антигены. Однако мечение радионуклидами может снижать антигенсвязывающую способность макромолекул [1]. Следовательно, при изготовлении таких радиофармпрепаратов необходима оценка специфической активности. Для этого определяют значение иммунореактивной фракции (ИРФ) — отношение радиоактивности меченых молекул, способных к специфическому связыванию с антигеном, к общей радиоактивности меченых молекул радиоиммуноконъюгата. Традиционно проводят инкубацию радиоиммуноконъюгатов с опухолевыми клетками, экспрессирующими на своей поверхности молекулы-мишени [1–6]. Такой подход связан c рядом ограничений и недостатков. Так, уровень экспрессии антигена клетками может быть недостаточен для определения значения ИРФ радиоиммуноконъюгата [7–10]. Кроме того, исследование при помощи клеток занимает много времени, что критично при использовании препарата, содержащего радионуклид с коротким периодом полураспада. Есть проблемы, затрудняющие стандартизацию применения клеток для определения ИРФ: клетки могут экспрессировать разные изоформы молекул-мишеней; уровень экспрессии антигена в этих клетках меняется с течением времени при их пассировании [10–12].

К настоящему времени опубликованы немногочисленные работы, в которых специфическую активность радиоиммуноконъюгатов моноклональных антител изучали при помощи магнитных частиц, покрытых иммобилизованными молекулами антигена [10, 13–15]. Мы впервые определили условия использования этого метода для оценки специфической активности меченных радионуклидом VHH-антител (наноантител). В представленной работе магнитные частицы применяли для определения ИРФ меченных изотопом ⁶⁸Ga препаратов наноантител против белка PD-L1, разработанных совместно Российским научным центром радиологии и хирургических технологий им. академика А.М. Гранова Министерства здравоохранения РФ и ООО «Иннова плюс».

PD-L1, лиганд рецептора программируемой клеточной гибели PD-1, является одним из белков иммунных контрольных точек. Этот трансмембранный белок играет важную роль в ингибировании опосредованного Т-клетками иммунного ответа [16, 17]. PD-L1 экспрессируется на антигенпрезентирующих и опухолевых клетках [16, 18], что связано с плохим прогнозом и повышенной смертностью от различных раковых заболеваний [19, 20]. PD-L1 используется как биомаркер при лечении опухолей, включая меланому, рак легких, рак молочной железы, рак почки и другие [18, 21]. В последнее время опубликовано много работ, в которых исследуется применение радиоиммуноконъюгатов с антителами против PD-L1 для терапии и диагностики рака, в том числе работы с VHH-антителами, меченными ⁶⁸Ga [22–25]. Оценку ИРФ этих препаратов, используемых в позитронно-эмиссионной томографии, авторы проводили по методу T. Lindmo [1]. Для этого применяли опухолевые генно-модифицированные клетки человека A375-hPD-L1 с повышенным уровнем экспрессии рекомбинантного белка PD-L1 [22]. Однако радионуклид ⁶⁸Ga имеет период полураспада 68 мин, что слишком мало для определения ИРФ таких препаратов при помощи клеток. Для клинического применения радиоиммуноконъюгатов, содержащих ⁶⁸Ga, необходим более быстрый метод оценки их специфической активности.

Материалы и методы

Мечение VHH-антител радионуклидом ⁶⁸Ga. При конъюгации VHH-антител (ООО «Иннова плюс», Россия) с радионуклидом ⁶⁸Ga молекулы белков модифицировали, используя бифункциональные хелатирующие агенты (БХА): тетраазациклододекантетрауксусную кислоту (DOTA, изотиоцианатное производное) или дефероксамин (DFO, этилскваратное производное). Эти хелаторы присоединяли к белковым молекулам по первичным аминогруппам путем инкубации 1–2 мг белка в 50 мМ боратном или натрий-карбонатном буфере (рН=8,5–8,8) с 10-кратным молярным избытком БХА в течение 17 ч при комнатной температуре. Модифицированные белки отделяли гель-фильтрационной хроматографией в 50 мМ аммоний-ацетатном буферном растворе (рН=7,5), целевую фракцию концентрировали ультрафильтрацией. Для мечения белков ⁶⁸Ga в микропробирку помещали 100 мкг модифицированного белка, добавляли 50 мкл раствора [⁶⁸Ga]GaCl₃ в 0,1 М HCl, полученного при элюировании генератора галлия-68 (ЗАО «Циклотрон», Россия), и 150 мкл 50 мМ аммоний-ацетатного буферного раствора (рН=7,5). При мечении VHH-антител, модифицированных DFO, реакционную смесь инкубировали при 37°С в течение 15 мин в присутствии воздуха и перемешивали в термошейкере (1000 об./мин). При мечении VHH-антител, модифицированных DOTA, реакционную смесь инкубировали при тех же условиях, за исключением температуры, которую повышали до 60–70ºС. Включение радионуклидов в белковые молекулы превышало 95%.

Определение ИРФ радиоиммуноконъюгата ⁶⁸Ga-VHH-PD-L1 с использованием магнитных частиц. Для оценки ИРФ радиоиммуноконъюгата ⁶⁸Ga-VHH-PD-L1 применяли коммерчески доступные магнитные частицы диаметром 2,4–3,4 мкм, покрытые протеином А (Bio-Rad, США), кат. №161-4013. Для работы с частицами использовали магнитный штатив (ООО «НПФ Хеликон», Россия). Центрифужную пробирку с частицами вынимали из магнитного штатива перед добавлением новой порции раствора и устанавливали обратно перед его удалением.

Для иммобилизации на магнитных частицах антигена, конъюгированного с Fc-фрагментом (PD-L1-Fc), 200 мкл суспензии магнитных частиц помещали в закрепленную в магнитном штативе центрифужную пробирку объемом 1,5 мл, раствор удаляли. Затем частицы промывали в 1 мл раствора, содержащего 50 мM NaCl, 50 мM трис-HCl, 0,05% твин-20 (pH=7,6) — ТБСТ. Частицы инкубировали в течение 15 мин с 1 мл раствора PD-L1-Fc в ТБСТ (10 мкг/мл). Инкубацию проводили на роторной мешалке при 15 об./мин. Для определения неспецифического связывания готовили частицы, не покрытые антигеном. При этом вместо раствора PD-L1-Fc к частицам добавляли ТБСТ. Далее частицы промывали в 1 мл раствора ТБСТ, содержащего 1% бычий сывороточный альбумин (БСА), затем инкубировали в этом растворе в течение 5 мин, после чего раствор удаляли и добавляли 200 мкл ТБСТ–БСА.

В процессе определения ИРФ к 10 мкл суспензии частиц добавляли по 50 мкл раствора радиоиммуноконъюгата ⁶⁸Ga-VHH-PD-L1 из серии разведений в ТБСТ с различной концентрацией и объемной активностью радиоиммуноконъюгата. Последний добавляли как к частицам, покрытым антигеном, так и к частицам без антигена (для определения неспецифического связывания). После инкубации в течение 15 мин пробы промывали три раза TБСT, затем измеряли величину радиоактивности проб, используя радиометр активности радионуклидов Triathler (Hidex Oy, Финляндия). Величину радиоактивности молекул ⁶⁸Ga-VHH-PD-L1, специфически связавшихся с магнитными частицами (В), покрытыми молекулами антигена, определяли по формуле:

B=A–N,

где A — величина радиоактивности, связавшейся с покрытыми PD-L1 частицами; N — величина радиоактивности, связавшейся с магнитными частицами, не покрытыми молекулами антигена. Значения ИРФ рассчитывали по формуле:

ИРФ=В/Т·100%,

где Т — величина общей радиоактивности, добавленной в пробу.

Для определения ИРФ строили график зависимости величины отношения B/T от концентрации радиоиммуноконъюгата в пробе. ИРФ устанавливали по пробе, имеющей максимальное значение величины B/T.

Неспецифическое связывание также определяли добавлением в пробу с частицами, покрытыми антигеном, немеченых молекул VHH-PD-L1 (метод блокирования). Немеченые VHH-антитела добавляли в пробу за 1 мин перед добавлением радиоиммуноконъюгата в концентрации, не менее чем в 200 раз превышавшей концентрацию последнего. После инкубации пробы отмывали от несвязавшейся радиоактивности, как описано выше.

Все измеренные значения радиоактивности пересчитывали для времени измерения первого образца (нулевой временнóй точки) по формуле:

A₀=A_t·e^λ^t,

где A₀ — радиоактивность образца в нулевой точке, А_t — радиоактивность образца, измеренная через t минут после начала измерения (измерения первого образца), λ — постоянная распада изотопа ⁶⁸Ga (0,010237).

Определение ИРФ радиоиммуноконъюгата ⁶⁸Ga-VHH-PD-L1 с помощью клеток СT26-PD-L1 in vitro. Численные значения ИРФ радиоиммуноконъюгатов определяли по методу, основанному на использовании постоянного количества меченных радионуклидом антител и переменного количества антигена (клеток) [1]. Клетки CT26-PD-L1 были получены в нашей лаборатории методами генной инженерии из клеток мышиной аденокарциномы линии СT26 и экспрессировали на своей поверхности в среднем по 1,5 млн молекул PD-L1 человека. Использовали клетки, которые снимали с поверхности флаконов, или клетки, которые ex tempore размораживали после криоконсервации. В обоих вариантах клетки суспендировали в фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБР), содержащем 1% БСА и 0,05% азида натрия. Количество клеток определяли с помощью кондуктометрического счетчика Z1 (Beckman Coulter, США) и оценивали жизнеспособность, используя раствор трипанового синего («БиолоТ», Россия). Все процедуры проводили при 4^oC. Клеточные суспензии с прогрессивно убывающей концентрацией клеток распределяли по пробиркам Эппендорфа, затем во все пробирки вносили одинаковое количество меченых VHH-антител. Пробирки с максимальным количеством клеток содержали 4,0 млн, а с минимальным — 0,0625 млн клеток. Образцы клеток инкубировали в течение 1 ч в растворах меченых антител, периодически суспендируя с помощью мешалки Vortex (VELP Scientifica, Италия), чтобы предотвратить оседание клеток. Затем трижды отмывали от несвязавшихся антител в ФСБР путем центрифугирования. Радиоактивность проб выявляли с помощью радиометра активности радионуклидов Triathler (Hidex Oy, Финляндия). Для определения неспецифического связывания пробы предварительно инкубировали с немечеными одноименными антителами, взятыми в 100-кратном избытке по сравнению с концентрацией меченных радионуклидом антител. Численное значение ИРФ в процентах устанавливали по пробе, в которой достигнуто максимальное значение специфического связывания всех меченых VHH-антител с молекулами-мишениями, экспрессированными на поверхности клеток. Дальнейшее увеличение содержания клеток в пробе при той же концентрации радиоиммуноконъюгата не приводило к увеличению специфического связывания; это свидетельствовало о том, что все интактные меченые VHH специфически связались с клетками.

Статистическая обработка данных. Все результаты получены не менее чем в трех повторах. Статистическую обработку экспериментальных данных осуществляли с использованием пакета программ Statistica 10.0. Данные представлены как M±SD, где M — среднее, а SD — стандартное отклонение. Наличие статистических различий оценивали попарным сравнением независимых выборок с использованием критерия Манна–Уитни; статистически значимыми считали различия с уровнем значимости p<0,05.

Результаты и обсуждение

Перед исследованием стояли следующие задачи: оценить возможность применения магнитных частиц для определения ИРФ радиоиммуноконъюгата ⁶⁸Ga-VHH-PD-L1, установить оптимальные условия анализа при использовании этого метода, а также сравнить его с традиционной инкубацией при помощи клеток.

Для проверки специфичности связывания радиоиммуноконъюгата с магнитными частицами использовали два подхода: блокирование связывания радиоиммуноконъюгата с покрытыми антигеном частицами избытком немеченых VHH и связывание радиоиммуноконъюгата с частицами, не покрытыми молекулами антигена (рис. 1).

Рис. 1. Определение специфического и неспецифического связывания радиоиммуноконъюгата ⁶⁸Ga-VHH-PD-L1 с магнитными частицами:

I — связывание радиоиммуноконъюгата с магнитными частицами, покрытыми молекулами антигена; II — связывание радиоиммуноконъюгата с магнитными частицами, покрытыми молекулами антигена, в присутствии высокой концентрации немеченых VHH; III — связывание радиоиммуноконъюгата с магнитными частицами, не покрытыми молекулами антигена. Цифры на графике показывают значение радиоактивности проб. В легенде указана концентрация радиоиммуноконъюгата

Данные рис. 1 демонстрируют, что связывание радиоиммуноконъюгата⁶⁸Ga-VHH-PD-L1 с магнитными частицами в пробе эффективно блокировалось присутствием высокой концентрации немеченых VHH против PD-L1. Столь же низким было неспецифическое связывание и при отсутствии молекул антигена на поверхности частиц. Это доказывает специфичность связывания радиоиммуноконъюгата с частицами, несущими антиген, а также правомерность использования частиц без антигена для измерения неспецифического связывания. Необходимо отметить, что во всех представленных в данной работе опытах уровень неспецифического связывания не превышал 1% от общего.

Результаты определения зависимости измеренной величины ИРФ радиоиммуноконъюгата ⁶⁸Ga-VHH-PD-L1 от времени его инкубации с магнитными частицами приведены на рис. 2.

Рис. 2. Влияние времени инкубации на специфическое связывание радиоиммуноконъюгата ⁶⁸Ga-VHH-PD-L1 с магнитными частицами, покрытыми антигеном (а), и на величину отношения B/T (б)

Здесь и далее: В — величина радиоактивности молекул ⁶⁸Ga-VHH-PD-L1, специфически связавшихся с магнитными частицами, покрытыми молекулами антигена; T — величина общей радиоактивности, добавленной в пробу. В легенде указано время инкубации радиоиммуноконъюгата с магнитными частицами

Время инкубации радиоиммуноконъюгата ⁶⁸Ga-VHH-PD-L1 с магнитными частицами, покрытыми антигеном, не имело существенного влияния на величину специфического связывания (рис. 2, а). Величина отношения В/T также практически не зависела от времени инкубации (рис. 2, б). Таким образом, для тестирования радиофармпрепарата достаточно трехминутной инкубации, что является принципиально важным при использовании короткоживущих изотопов. При инкубации частиц с радиоиммуноконъюгатом в течение 3 мин весь анализ, включая измерение радиоактивности в пробах, занимает не более 15 мин. Это позволяет проводить быструю оценку специфической активности радиоиммуноконъюгатов, содержащих короткоживущие изотопы, такие как ⁶⁸Ga с периодом полураспада 68 мин. Необходимо отметить, что определение ИРФ радиоиммуноконъюгатов при помощи традиционно используемых для этой цели клеток занимает более двух часов. Это делает невозможным дальнейшее использование радиоиммуноконъюгатов, содержащих короткоживущие изотопы, в качестве радиофармпрепаратов.

При высоких (3,33 мкг/мл) значениях концентрации радиоиммуноконъюгата ⁶⁸Ga-VHH-PD-L1 в пробе происходило снижение величины B/T по сравнению с его максимальным значением, достигнутым при концентрации 0,83 мкг/мл. Это объясняется избытком меченых VHH-антител по отношению к иммобилизованному на частицах антигену. При этом важно отметить, что инкубация покрытых антигеном частиц с радиоиммуноконъюгатом в концентрации ниже 0,83 мкг/мл также приводила к уменьшению значения B/T. Полученные результаты демонстрируют, что для измерения максимальной величины B/T необходимо экспериментально подбирать отношение концентрации радиоиммуноконъюгата к концентрации магнитных частиц в пробе. Это позволит количественно оценить ИРФ радиоиммуноконъюгата.

Для того чтобы проверить последнее утверждение, мы провели эксперимент, в котором инкубировали радиоиммуноконъюгат с разным количеством магнитных частиц в пробах (рис. 3). В пробы добавляли суспензии частиц с иммобилизованным антигеном в объеме 2,5, 5, 10 и 20 мкл. Аналогично для определения неспецифического связывания готовили ряд проб с такими же количествами частиц без антигена. К пробам добавляли TBS-T c 1% БСА, чтобы суммарный объем раствора в пробе был 20 мкл. После этого во все пробы добавляли по 50 мкл раствора, содержащего ⁶⁸Ga-VHH-PD-L1 в концентрации 1,43 или 0,143 мкг/мл. Далее эксперимент проводили так, как описано в «Материалах и методах».

Рис. 3. Зависимость величины B/T от количества магнитных частиц в пробе

В легенде указана концентрация радиоиммуноконъюгата ⁶⁸Ga-VHH-PD-L1

При связывании радиоиммуноконъюгата, взятого в концентрации 1,43 мкг/мл, с разным количеством магнитных частиц, покрытых молекулами антигена, график насыщения достигает плато при достижении избытка молекул антигена в пробе относительно меченых молекул VHH (см. рис. 3). Однако, если концентрация радиоиммуноконъюгата в 10 раз меньше (0,143 мкг/мл), величина отношения B/T уменьшается при увеличении содержания частиц в пробе. Это происходит несмотря на заведомо избыточное количество молекул иммобилизованного на частицах антигена по отношению к меченым молекулам VHH. Полученные результаты подтверждают сделанное ранее заключение, что для измерения ИРФ необходимо определенное соотношение концентраций радиоиммуноконъюгата и магнитных частиц, несущих антиген. Следовательно, оценка ИРФ радиоиммуноконъюгата требует приготовления достаточного числа проб с разными концентрациями меченых антител для выявления максимальной величины отношения B/T. S.K. Sharma и соавт. [10] с целью определения ИРФ радиоиммуноконъюгатов проводили одноточечный анализ для одной концентрации меченых антител с большим избытком молекул антигена, иммобилизованных на магнитных частицах. Приведенные в нашей работе данные указывают, что подобный подход не гарантирует получения адекватных результатов анализа. В других работах [13–15] для определения ИРФ инкубировали меченые антитела одной концентрации с разным количеством покрытых антигеном магнитных частиц. Однако, как видно на рис. 3, такой подход также может приводить к ошибочной оценке ИРФ, поскольку из-за условий эксперимента сложно использовать достаточно широкий диапазон концентраций таких частиц.

Для определения ИРФ радиоиммуноконъюгата ⁶⁸Ga-VHH-PD-L1 применяли магнитные частицы, предварительно покрытые молекулами антигена. Была проведена оценка срока годности частиц с иммобилизованным антигеном при хранении от 4–8°С (рис. 4).

Рис. 4. Отношение B/T, измеренное через 0, 1, 3, 9 и 43 сут после иммобилизации молекул антигена на магнитных частицах

В легенде указана концентрация радиоиммуноконъюгата ⁶⁸Ga-VHH-PD-L1; * p<0,05; ** p<0,01

Представленные на рис. 4 данные показывают, что хранение частиц с иммобилизованными молекулами антигена в течение 3 сут не приводит к снижению измеренной величины ИРФ радиоиммуноконъюгата ⁶⁸Ga-VHH-PD-L1. Однако в дальнейшем происходит падение значения данного показателя с 78,5 до 61,1% после хранения частиц в течение 9 сут и до 37,6% — после хранения в течение 43 сут. Таким образом, после иммобилизации молекул антигена магнитные частицы остаются пригодными для измерения ИРФ по крайней мере в течение 3 сут.

В настоящей работе выполнено сравнение величин ИРФ одного образца радиоиммуноконъюгата ⁶⁸Ga-VHH-PD-L1, измеренных с использованием магнитных частиц и при помощи клеток, экспрессирующих тот же антиген на своей поверхности (рис. 5). Проведение такого исследования является особенно важным, поскольку иммобилизация белкового антигена на частицах может приводить к изменению его конформации и влиять на связывание с антителами [26].

Рис. 5. Определение величины иммунореактивной фракции радиоиммуноконъюгата ⁶⁸Ga-VHH-PD-L1 двумя методами:

а — путем инкубации радиоиммуноконъюгата с магнитными частицами; б — путем инкубации радиоиммуноконъюгата с клетками CT26-PD-L1

Среднее значение величин ИРФ, определенных путем связывания радиоиммуноконъюгата с магнитными частицами и с клетками СТ26-PD-L, составило 81,2 и 87,5% соответственно (см. рис. 5). Эти значения сопоставимы, что свидетельствует об адекватности использования представленного в данной работе метода для оценки специфической активности радиоиммуноконъюгатов. Радиоиммуноконъюгат сохраняет сродство к иммобилизованным на частицах молекулам PD-L1, несмотря на то, что их конформация может отличаться от нативной конформации молекул PD-L1, экспрессированных на поверхности клеток. Также сохраняется стерическая доступность для сайтов связывания иммобилизованного антигена и радиоиммуноконъюгата.

Мы использовали магнитные частицы для сравнительных исследований радиоиммуноконъюгатов, приготовленных с помощью разных методик. В качестве хелатирующих предшественников для мечения радионуклидом ⁶⁸Ga применяли DOTA-VHH-PD-L1 и DFO-Sq-VHH-PD-L1 (рис. 6). По данным эксперимента, значение ИРФ радиоиммуноконъюгата ⁶⁸Ga-VHH-PD-L1, содержащего хелатор DFO-Sq, составляет 75,1%, в то время как аналогичный радиоиммуноконъюгат, который получен мечением VHH, модифицированного хелатором DOTA, имеет значение ИРФ, равное 59,7%. Это значит, что использование DFO-Sq вместо DOTA позволяет увеличить долю неповрежденных меченых VHH.

Рис. 6. Сравнение величин отношения B/T, измеренных для радиоиммуноконъюгатов ⁶⁸Ga-VHH-PD-L1, меченных с использованием хелатирующих предшественников DOTA-VHH-PD-L1 и DFO-Sq-VHH-PD-L1

* p<0,05

По результатам данного эксперимента была поставлена задача найти условия мечения VHH-антител радионуклидом ⁶⁸Ga при использовании хелатора DOTA, позволяющие увеличить ИРФ радиофармпрепарата. При мечении VHH-антител радионуклидом ⁶⁸Ga реакционную смесь нагревали до 60, 65 или 70°С. Затем при помощи магнитных частиц определяли ИРФ полученного радиоиммуноконъюгата ⁶⁸Ga-VHH-PD-L1 (рис. 7).

Рис. 7. Влияние температуры реакционной смеси на величину иммунореактивной фракции радиоиммуноконъюгата ⁶⁸Ga-VHH-PD-L1, содержащего хелатор DOTA:

а — зависимость величины B/T от концентрации радиоиммуноконъюгата; б — величина измеренной иммунореактивной фракции радиоиммуноконъюгата, полученного при разных температурах реакционной смеси; * p<0,05

Данные рис. 7 показывают, что повышение температуры нагревания при получении радиоиммуноконъюгата способствовало увеличению значения ИРФ. Так, при нагревании до 60°С среднее значение ИРФ было равно 47,0%, при нагревании до 65°С — 59,7%, а при нагревании до 70°С — 65,0%. Очевидно, что нагревание реакционной смеси до 70°С приводит к получению радиоиммуноконъюгата с более высоким значением ИРФ, чем нагревание до более низких температур. Причины подобного эффекта пока неясны.

Приведенные выше результаты показывают, что применение магнитных частиц с иммобилизованными на их поверхности молекулами антигена позволяет определить оптимальные условия мечения VHH против PD-L1 радионуклидом ⁶⁸Ga.

В настоящей работе продемонстрировано, что при оценке специфической активности радиоиммуноконъюгата ⁶⁸Ga-VHH-PD-L1 магнитные частицы, покрытые антигеном PD-L1, способны заменить клетки, экспрессирующие PD-L1 на своей поверхности. В дальнейшем необходимо изучить возможность применения представленного в данной работе метода для определения ИРФ других радиоиммуноконъюгатов, изготовленных как на основе VHH-антител, так и с использованием других антигенсвязывающих молекул. Очевидны два направления работы для усовершенствования метода: желательно добиться увеличения срока годности покрытых антигеном магнитных частиц с трех до как минимум семи дней, а также расширить диапазон концентраций радиоиммуноконъюгата в пробе, приемлемых для проведения измерения.

Заключение

Использование магнитных частиц, покрытых иммобилизованными молекулами антигена, позволяет провести определение иммунореактивной фракции VHH-антител против PD-L1, меченных ⁶⁸Ga, в течение 15 мин. Полученные результаты показывают, что этот метод имеет реальную практическую ценность для измерения специфической активности радиоиммуноконъюгатов in vitro, поскольку проведение анализа становится более доступным и надежным, чем при использовании клеток. Особенно важно, что применение магнитных частиц открывает возможность быстрой рутинной оценки радиофармпрепаратов, содержащих короткоживущие изотопы.

Финансирование исследования. Работа выполнена в рамках госзадания Министерства здравоохранения РФ.

Конфликт интересов отсутствует.

Литература

Lindmo T., Boven E., Cuttitta F., Fedorko J., Bunn P.A. Jr. Determination of the immunoreactive fraction of radiolabeled monoclonal antibodies by linear extrapolation to binding at infinite antigen excess. J Immunol Methods 1984; 72(1): 77–89, https://doi.org/10.1016/0022-1759(84)90435-6.
Bian H.J., Chen Z.N., Deng J.L. Direct technetium-99m labeling of anti-hepatoma monoclonal antibody fragment: a radioimmunoconjugate for hepatocellular carcinoma imaging. World J Gastroenterol 2000; 6(3): 348–352, https://doi.org/10.3748/wjg.v6.i3.348.
Burvenich I.J., Parakh S., Gan H.K., Lee F.T., Guo N., Rigopoulos A., Lee S.T., Gong S., O’Keefe G.J., Tochon-Danguy H., Kotsuma M., Hasegawa J., Senaldi G., Scott A.M. Molecular imaging and quantitation of EphA2 expression in xenograft models with 89Zr-DS-8895a. J Nucl Med 2016; 57(6): 974–980, https://doi.org/10.2967/jnumed.115.169839.
Kristensen L.K., Fröhlich C., Christensen C., Melander M.C., Poulsen T.T., Galler G.R., Lantto J., Horak I.D., Kragh M., Nielsen C.H., Kjaer A. CD4+ and CD8a+ PET imaging predicts response to novel PD-1 checkpoint inhibitor: studies of Sym021 in syngeneic mouse cancer models. Theranostics 2019; 9(26): 8221–8238, https://doi.org/10.7150/thno.37513.
Pruszynski M., D’Huyvetter M., Bruchertseifer F., Morgenstern A., Lahoutte T. Evaluation of an anti-HER2 nanobody labeled with 225Ac for targeted α-particle therapy of cancer. Mol Pharm 2018; 15(4): 1457–1466, https://doi.org/10.1021/acs.molpharmaceut.7b00985.
Bellaye P.S., Moreau M., Raguin O., Oudot A., Bernhard C., Vrigneaud J.M., Dumont L., Vandroux D., Denat F., Cochet A., Brunotte F., Collin B. Radiolabeled F(ab’)2-cetuximab for theranostic purposes in colorectal and skin tumor-bearing mice models. Clin Transl Oncol 2018; 20(12): 1557–1570, https://doi.org/10.1007/s12094-018-1886-4.
Mattes M.J. Limitations of the Lindmo method in determining antibody immunoreactivity. Int J Cancer 1995; 61(2): 286–288, https://doi.org/10.1002/ijc.2910610224.
Dux R., Kindler-Röhrborn A., Lennartz K., Rajewsky M.F. Determination of immunoreactive fraction and kinetic parameters of a radiolabeled monoclonal antibody in the absence of antigen excess. J Immunol Methods 1991; 144(2): 175–183, https://doi.org/10.1016/0022-1759(91)90084-s.
Konishi S., Hamacher K., Vallabhajosula S., Kothari P., Bastidas D., Bander N., Goldsmith S. Determination of immunoreactive fraction of radiolabeled monoclonal antibodies: what is an appropriate method? Cancer Biother Radiopharm 2004; 19(6): 706–715, https://doi.org/10.1089/cbr.2004.19.706.
Sharma S.K., Lyashchenko S.K., Park H.A., Pillarsetty N., Roux Y., Wu J., Poty S., Tully K.M., Poirier J.T., Lewis J.S. A rapid bead-based radioligand binding assay for the determination of target-binding fraction and quality control of radiopharmaceuticals. Nucl Med Biol 2019; 71: 32–38, https://doi.org/10.1016/j.nucmedbio.2019.04.005.
Vu T.N., Wills Q.F., Kalari K.R., Niu N., Wang L., Pawitan Y., Rantalainen M. Isoform-level gene expression patterns in single-cell RNA-sequencing data. Bioinformatics 2018; 34(14): 2392–2400, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bty100.
Mouriaux F., Zaniolo K., Bergeron M.A., Weidmann C., De La Fouchardière A., Fournier F., Droit A., Morcos M.W., Landreville S., Guérin S.L. Effects of long-term serial passaging on the characteristics and properties of cell lines derived from uveal melanoma primary tumors. Invest Ophthalmol Vis Sci 2016; 57(13): 5288–5301, https://doi.org/10.1167/iovs.16-19317.
Zalutsky M.R., Zhao X.G., Alston K.L., Bigner D. High-level production of alpha-particle-emitting (211)At and preparation of (211)At-labeled antibodies for clinical use. J Nucl Med 2001; 42(10): 1508–1515.
Andersen L. Development of an analytical method for the determination of the antigen binding capacity of radiolabeled antibodies. MSc Thesis. Trondheim: Norwegian University of Science and Technology; 2012.
Pirovano G., Ordonez A.A., Jain S.K., Reiner T., Carroll L.S., Pillarsetty N.V.K. Rapid detection of SARS-CoV-2 using a radiolabeled antibody. Nucl Med Biol 2021; 98–99: 69–75, https://doi.org/10.1016/j.nucmedbio.2021.05.002.
Wang X., Teng F., Kong L., Yu J. PD-L1 expression in human cancers and its association with clinical outcomes. Onco Targets Ther 2016; 9: 5023–5039, https://doi.org/10.2147/ott.s105862.
Sun C., Mezzadra R., Schumacher T.N. Regulation and function of the PD-L1 checkpoint. Immunity 2018; 48(3): 434–452, https://doi.org/10.1016/j.immuni.2018.03.014.
Doroshow D.B., Bhalla S., Beasley M.B., Sholl L.M., Kerr K.M., Gnjatic S., Wistuba I.I., Rimm D.L., Tsao M.S., Hirsch F.R. PD-L1 as a biomarker of response to immune-checkpoint inhibitors. Nat Rev Clin Oncol 2021; 18(6): 345–362, https://doi.org/10.1038/s41571-021-00473-5.
Jung H.I., Jeong D., Ji S., Ahn T.S., Bae S.H., Chin S., Chung J.C., Kim H.C., Lee M.S., Baek M.J. Overexpression of PD-L1 and PD-L2 is associated with poor prognosis in patients with hepatocellular carcinoma. Cancer Res Treat 2017; 49(1): 246–254, https://doi.org/10.4143/crt.2016.066.
Rezaeeyan H., Hassani S.N., Barati M., Shahjahani M., Saki N. PD-1/PD-L1 as a prognostic factor in leukemia. J Hematopathol 2017; 10(1): 17–24, https://doi.org/10.1007/s12308-017-0293-z.
Núñez Abad M., Calabuig-Fariñas S., Lobo de Mena M., Torres-Martínez S., García González C., García García J.Á., Iranzo González-Cruz V., Camps Herrero C. Programmed death-ligand 1 (PD-L1) as immunotherapy biomarker in breast cancer. Cancers (Basel) 2022; 14(2): 307, https://doi.org/10.3390/cancers14020307.
Lv G., Sun X., Qiu L., Sun Y., Li K., Liu Q., Zhao Q., Qin S., Lin J. PET imaging of tumor PD-L1 expression with a highly specific nonblocking single-domain antibody. J Nucl Med 2020; 61(1): 117–122, https://doi.org/10.2967/jnumed.119.226712.
Liu Q., Jiang L., Li K., Li H., Lv G., Lin J., Qiu L. Immuno-PET imaging of 68Ga-labeled nanobody Nb109 for dynamic monitoring the PD-L1 expression in cancers. Cancer Immunol Immunother 2021; 70(6): 1721–1733, https://doi.org/10.1007/s00262-020-02818-y.
Qin S., Yu Y., Guan H., Yang Y., Sun F., Sun Y., Zhu J., Xing L., Yu J., Sun X. A preclinical study: correlation between PD-L1 PET imaging and the prediction of therapy efficacy of MC38 tumor with 68Ga-labeled PD-L1 targeted nanobody. Aging (Albany NY) 2021; 13(9): 13006–13022, https://doi.org/10.18632/aging.202981.
Yu S., Xiong G., Zhao S., Tang Y., Tang H., Wang K., Liu H., Lan K., Bi X., Duan S. Nanobodies targeting immune checkpoint molecules for tumor immunotherapy and immunoimaging (review). Int J Mol Med 2021; 47(2): 444–454, https://doi.org/10.3892/ijmm.2020.4817.
Kumar M., Khan I., Sinha S. Nature of immobilization surface affects antibody specificity to placental alkaline phosphatase. J Immunoassay Immunochem 2015; 36(4): 405–413, https://doi.org/10.1080/15321819.2014.973117.

Использование магнитных частиц для быстрого определения иммунореактивной фракции VHH-антител против PD-L1, меченных 68Ga

Введение

Материалы и методы

Результаты и обсуждение

Заключение

Использование магнитных частиц для быстрого определения иммунореактивной фракции VHH-антител против PD-L1, меченных ⁶⁸Ga