Ауторегуляция и аутоингибирование основных изоформ NO-синтаз (краткий обзор)

Введение

Оксид азота (II) NO является важнейшим межклеточным медиатором широкого спектра физиологических и патофизиологических процессов. Так, он регулирует тонус, проницаемость и структуру сосудов, тонус гладких мышц внутренних органов, процессы воспаления и иммунного ответа, свободнорадикальные процессы, вовлечен в патогенез большинства воспалительных заболеваний, может служить биологическим маркером воспаления и пр. [1–3].

NO-синтазы (NOS), образующие NO и представляющие собой ферментативную часть более общего цикла NO, являются цитохром-Р450-подобными гемопротеинами. Они окисляют L-аргинин (Arg) в двухстадийном процессе, включающем в качестве промежуточного продукта L-гидроксиаргинин (NOHA). В цикле катализа участвуют ряд кофакторов: никотинамидадениндинуклеотидфосфат (NADPH), фла­вин­адениндинуклеотид (FAD), флавинмононуклеотид (FMN), тетрагидроптерин, кальмодулин (CaM) и т.д. [4–6].

Три основные изоформы NOS (nNOS, eNOS, iNOS) имеют ряд существенных различий: кодируются разными генами, отличаются субклеточной локализацией, продуцируемыми концентрациями NO, степенью зависимости от концентрации Ca²⁺. Несмотря на это, основные структурные элементы NOSs идентичны для всех изоформ [7–9] (рис. 1).

---

Рис. 1. Структурная модель NOS [5, 7]

---

Как видно из рис. 1, димер оксигеназного домена в центре NOS содержит связывающие центры для тетрагидробиоптерина (BH4), гема и L-аргинина. К оксигеназному домену присоединен редуктазный, состоящий из NADPH, FAD и FMN. CaM при его связывании ферментом находится между FMN и оксигеназным доменом [5, 7, 9].

В предложенной нами ранее [10] структурной схеме трехтактной модели катализа NOS учитывается значительная разница в скорости восстановления комплекса гем–Fe(II)–O₂ электроном из редуктазного домена и коферментом BH4. Кинетическая предпочтительность второго пути позволила сделать предположение о работе BH4 по бинарной логике: восстановление комплекса гем–Fe(II)–O₂, окисление комплексов гем–Fe(II) и гем–Fe(II)–NO. Получаемый в таком случае замкнутый цикл последовательного окисления и восстановления BH4 дает непротиворечивую картину его роли в катализе.

На рис. 2 представлен алгоритм трехтактного каталитического цикла NOS при физиологических условиях, разработанный с целью последующего имитационного моделирования. Зеленым цветом выделена нормальная последовательность этапов катализа, в результате которой фермент синтезирует NO, серым цветом показаны патологические цепочки. Коричневым цветом выделена замкнутая цепь последовательных окислений и восстановлений кофермента BH4.

---

Рис. 2. Трехтактный цикл катализа NOS [10]

---

Каталитический цикл начинается с переноса первого электрона по электрон-транспортной цепи редуктазного домена, затем — на гем трехвалентного железа (гем–Fe(III)). Согласно современным представлениям [4, 5], NADPH связывает молекулу, содержащую флавины FAD и FMN, восстанавливает FAD, затем электроны диспропорционируют между FAD и FMN. CaM связывает два иона Ca²⁺, после чего становится способным присоединиться к соответствующему связывающему центру NOS, но этого недостаточно для инициации конформационных изменений фермента, позволяющих передать электрон от FMN на оксигеназный домен к гему трехвалентного железа (гем–Fe(III)). Для указанной передачи необходимо, чтобы два оставшихся центра связывания CаM также заполнились ионами Ca²⁺.

Каждый такт трехтактного цикла катализа NOS запускается описанным процессом переноса электрона по электрон-транспортной цепи редуктазного домена и восстановлением гем–Fe(III) до гем–Fe(II). Такты нормального продуктивного цикла NOS указаны на рис. 2 зеленым цветом и соответствующими цифрами.

В первом такте гем–Fe(III) восстанавливается первым электроном до гем–Fe(II), который при достаточности кислорода окисляется до комплекса гем–Fe(II)–О₂. Для того чтобы этот комплекс был способен прореагировать с субстратом, он активируется восстановленным после предыдущего каталитического цикла коферментом BH4 до гем–Fe(II)–О₂^–. BH4 превращается при этом в радикал BH4⁺, а комплекс гем–Fe(II)–О₂^– уже способен прореагировать с аргинином, превращая его в NOHA с выделением одной молекулы H₂O и окислением гема до его первоначального состояния (гем–Fe(III)). На этом первый такт цикла заканчивается.

Второй такт является промежуточным и служит для восстановления кофермента BH4, окисленного в предыдущем такте. При этом второй электрон от редуктазного домена сначала восстанавливает гем–Fe(III) до гем–Fe(II) по аналогии с первым тактом, а затем радикал BH4⁺ окисляет гем–Fe(II) до гем–Fe(III), таким образом восстанавливаясь для третьего такта цикла катализа.

В третьем такте по аналогии с первым тактом гем–Fe(III) восстанавливается до гем–Fe(II) третьим электроном от редуктазного домена, затем окисляется до комплекса гем–Fe(II)–О₂, активируется тетрагидробио­птерином, восстановленным во втором такте, до гем–Fe(II)–О₂^– и реагирует с NOHA, образуя цитруллин, молекулу H₂O и комплекс гем–Fe(II)–NO, высвобождение NO из которого происходит крайне медленно. Радикал BH4⁺, образовавшийся после восстановления гем–Fe(II)–О₂, немедленно окисляет гем–Fe(II)–NO до гем–Fe(III)–NO, который способен высвобождать NO значительно быстрее своей восстановленной формы. При этом восстановленный BH4 становится готовым для следующего цикла катализа.

Если оксид азота, высвободившийся из комплекса гем–Fe(III)–NO, успевает выйти из кармана фермента до момента прихода нового электрона, то каталитический цикл завершается продуктивно и фермент становится готовым к новому циклу. В противном случае новый электрон восстанавливает гем–Fe(III)–NO до гем–Fe(II)–NO, который при достаточности кислорода реагирует с ним, образуя NO₃^–, а при недостаточности кислорода фактически блокирует фермент из-за медленного высвобождения NO.

Необходимо отметить, что катализ NO лимитируется наиболее медленной стадией, а именно переносом электрона внутри редуктазного домена, а также с FMN на гем. Этот перенос необходим для восстановления гем–Fe(III) в начале каждого такта цикла. Соответственно регуляция скорости этого переноса отвечает за «производительность» NOS в нормальном каталитическом цикле, а регуляторные механизмы являются исключительно важными для понимания функционирования фермента. Мало того, в случае NOS именно ауторегуляторные механизмы переноса электрона в редуктазном домене определяют и объясняют разницу различных изоформ по продуктивности синтеза NO и по зависимости от концентрации ионов Ca²⁺.

Целью настоящего обзора является анализ результатов исследований основных ауторегуляторных механизмов редуктазного домена NOS, к которым относят кальмодулин (CaM), аутоингибиторную вставку (AI) и С-концевой хвост (C-tail). На сегодняшний день механизмы их функционирования недостаточно изучены, но имеющиеся данные позволяют сделать вывод о сложном, разнонаправленном алгоритме взаимодействия, который обеспечивает широкий диапазон характеристик наблюдаемых изоформ.

Материалы и методы

В качестве основного источника научных данных были выбраны поисковики https://scholar.google.ru/ и база PubMed (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/). Глубина поиска составила 33 года (с 1990 по 2023 г.), метод анализа данных — голографический. В качестве ключевых использовались следующие слова: “NOS”, “NO synthase”, “nitric-oxide synthase”, “electron flow”, “electron transfer”, “regulation”, “autoinhibition”, “modulation by”, “conformational control”, “conformational dynamics”, “C-tail”, “C-terminus”, “cytochrome С-reduction”, “ferricyanide reduction”, “autoinhibitory insert”. Общее количество источников при сочетании ключевых слов [(“NOS” OR “NO synthase” OR “nitric-oxide synthase”) AND (“electron flow” OR “electron transfer”) AND (“regulation” OR “autoinhibition” OR “conformational control” OR “modulation by” OR “conformational dynamics”) AND (“C-tail” OR “C-terminus”)] составило 3100 в https://scholar.google.ru/ при очень низкой релевантности (только 6 работ затрагивают исследуемую проблематику) и всего 11 в PubMed, из которых только 4 работы достаточно релевантны. При сочетании [(“NOS” OR “NO synthase” OR “nitric-oxide synthase”) AND (“regulation” OR “autoinhibition” OR “modulation by”) AND (“C-tail” OR “C-terminus”) AND (“cytochrome C-reduction” OR “ferricyanide reduction”)] найдено 247 источников в https://scholar.google.ru/ с низкой релевантностью, а работ в базе PubMed не обнаружено. При этом в большинстве работ анализируется регуляторная роль кальмодулина, тогда как другие ауторегуляторные элементы только упоминаются. Так, выявлено 3 работы, где количественно оценивалась регуляторная роль аутоингибиторной вставки и C-tail с использованием мутантных форм ферментов. Следует отметить, что это работы 1999–2001 гг., и они по ряду данных недостаточно согласуются друг с другом, а их дизайн в большей степени соответствует пилотным исследованиям.

Крайне малое количество высокорелевантных работ по указанной тематике свидетельствует о том, что механизмы ауторегуляции NO-синтаз на сегодняшний день являются малоизученной областью, объем существующих экспериментальных количественных оценок недостаточен для адекватного понимания работы аутоингибирующих и регуляторных элементов, а также для их моделирования.

Регуляторные функции кальмодулина и Ca²⁺

Ключевую роль в регуляции трансфера электронов в NOS играет белок кальмодулин. Когда два из четырех центров связывания CaM, обладающих более высокой аффинностью, заполняются Ca²⁺, CaM связывается с NOS, располагаясь, как принято считать, между FMN и гемом. Это инициирует конформационные изменения, ускоряющие электронный трансфер внутри редуктазного домена: от NADPH в FAD, от FAD в FMN. После заполнения Ca²⁺ двух оставшихся свободных центров связывания CaM становится способным ускорять перенос электрона от FMN к гему [4].

Согласно имеющимся данным [4], механизмы снятия репрессии на ключевых этапах переноса электрона не связаны с изменением термодинамики реакций. Поскольку редуктазный домен может существовать в любых состояниях — от одно- до четырехэлектронного восстановленного, как динамическая система открытых и закрытых конформаций, — основными механизмами регулирующего влияния СаМ предполагаются следующие:

сдвиг конформационного равновесия в сторону более открытых конформаций;

сокращение времен жизни конформаций и ускорение переходов между ними;

сужение стереометрических распределений конформаций;

ограничение степеней свободы внутри фермента, что направляет перемещения домена FMN в пространстве.

Вышеописанные механизмы, по всей вероятности, обусловлены способностью CaM формировать ионные связи и гидрофобные взаимодействия с оксидазным доменом NOS, что помогает направлять стыковку домена FMN и формирует оптимальную «электронную тропу». CаM, предположительно, также устраняет ингибирующее влияние AI на участок стыковки FMN с гемом [4, 11, 12].

В отсутствие СаМ nNOS практически не синтезирует NO (концентрации не определяются), а eNOS продуцирует NO на уровне 2,5% от уровня синтеза в присутствии СаМ. Заполнение ионами Са²⁺ центров связывания СаМ является фактически триггером переноса электронов на гем, по всей вероятности, за счет смещения ингибирующих регуляторных элементов: AI и C-tail. При этом iNOS в отличие от двух других изоформ не имеет AI и сразу экспрессируется с СаМ, что делает ее практически независимой от концентрации ионов Са²⁺ [11].

Регуляторные функции аутоингибиторной вставки

Основное отличие в строении трех главных изоформ NOS млекопитающих — наличие последовательности из 52–55 аминокислот в редуктазном домене nNOS и eNOS. Ключевые функции этой вставки, определенные с помощью химер NOS, полученных ее удалением, позволяют утверждать, что это аутоингибиторный элемент. Кроме того, именно AI во многом определяет зависимость активности NOS от концентрации Са²⁺. Например, химерам eNOS с удаленной AI требуется в 7 раз меньшая концентрация Са²⁺ для активации (20 вместо 150 нМ) [13].

Ингибирующее влияние AI носит довольно сложный характер, который иллюстрируется несколькими параметрами [12, 13]:

1) общей восстановительной активностью редуктазного домена NOS, которую можно оценить по интенсивности восстановления цитохрома С (как искусственного акцептора электронов), присоединенного к FMN;

2) эффективностью переноса электрона от NADPH на FAD, оцениваемой по восстановлению феррицианида, присоединенного к FAD;

3) продуктивностью синтеза NO.

Для eNOS и nNOS связывание СаМ ускоряет восстановление цитохрома С (общую восстановительную активность редуктазного домена) примерно в 10 раз. Изначально такую же активность (и она сравнима с цитохромом Р450) имеет iNOS, так как экспрессируется с уже связанным СаМ. В случае мутантых nNOS, eNOS (с удаленной AI) редуктазная активность без СаМ усиливается радикально, в 10–30 раз. В присутствии СаМ и при физиологических концентрациях солей калия, натрия и кальция редуктазная активность мутантных форм выше, чем у исходных, всего в 3 раза [13].

На восстановлении феррицианида, т.е. на переносе электронов с NADPH на FAD, влияние AI сказывается значительно слабее: в присутствии СаМ и при физиологических концентрациях солей эффективность мутантных форм всего в 2 раза превышает эффективность нормальных, а в отсутствие СаМ удаление AI дает рост эффективности в 3–6 раз. Удаление AI приводит также к заметному увеличению максимального синтеза NO, особенно при физиологических концентрациях солей калия и натрия. Исходя из результатов экспериментов с мутантными формами конститутивных NOS с удаленной AI можно сделать ряд предварительных выводов о принципах ее функционирования [13]:

1. AI примерно в 7 раз повышает уровень Са²⁺, необходимый для связывания СаМ конститутивными NOS, что является одной из причин их значительно большей зависимости от Са²⁺.

2. AI также увеличивает зависимость конститутивных NOS от Са²⁺ за счет того, что радикально (в 10–30 раз) снижает редуктазную активность NOS без связанного СаМ. В случае связанного СаМ AI снижает эту активность значительно слабее (в 3 раза).

3. Кроме AI, по всей вероятности, существуют другие факторы, определяющие зависимость конститутивных NOS от Са²⁺, поскольку, несмотря на повышенную редуктазную активность ферментов без AI, для синтеза NO им все равно требуется связывание СаМ. Кроме того, мутантные формы iNOS с добавленной AI синтезируют NO даже при концентрациях Са²⁺ значительно ниже пороговых.

4. Разные изоформы NOS при удалении AI начинают показывать схожую редуктазную активность, причем у связанных с СаМ мутантных форм эта активность выше, чем у связанных с СаМ исходных форм.

5. Суммарное аутоингибирование NOS ослабляется при связывании СаМ и для мутантных форм с удаленной AI, и для нормальных исходных ферментов, причем связывание СаМ в большей степени усиливает редуктазную активность мутантных NOS с удаленной AI, чем исходных.

6. Предположительно самая низкая продуктивность eNOS по сравнению с другими изоформами объясняется ее наиболее эффективной AI, которая продолжает частично ингибировать активность фермента даже при связанном СаМ и достаточности Са²⁺. В случае nNOS ингибирующий эффект AI на редуктазную активность полностью компенсируется связыванием СаМ и достаточностью Са²⁺. Это подтверждается тем, что при удалении AI редуктазная активность мутантной eNOS сравнивается с таковой для мутантной nNOS.

Имеющиеся данные пока не позволяют делать выводы о механизмах влияния AI на редуктазную активность NOS. AI может стереометрически мешать цитохрому С и феррицианиду контактировать с редуктазным доменом, а также может индуцировать конформационное изменение, которое препятствует переносу электронов внутри редуктазного домена по аналогии с шарнирным доменом в цитохроме Р450, который улучшает перенос электронов между флавинами [12, 14].

Регуляторные функции С-концевого хвоста

В отличие от цитохром-Р450-редуктазы все изоформы NOS на С-конце имеют удлинение из 20–40 аминокислот, причем базовая последовательность из восьми аминокислот С-конца (основание хвоста) оказалась абсолютно идентичной для мышиной iNOS, крысиной nNOS, коровьей eNOS, а также NOS фруктовой мушки и бабочки бражника, а удлинения (непосредственно хвост — C-tail) имеют разную длину и последовательность аминокислот [15] (рис. 3).

---

Рис. 3. Базовая аминокислотная последовательность (основание хвоста, выделено прямоугольником) и С-концевые аминокислотные последовательности (отсутствуют в цитохром-Р450-редуктазе) для мышиной iNOS, крысиной nNOS, коровьей eNOS, а также NOS фруктовой мушки и бабочки бражника [15]

---

Эксперименты с мутантными формами NOS (с удаленным в разной степени C-tail) показали, что C-tail оказывает ингибирующее влияние. В противоположность этому основание хвоста служит для эффективного синтеза NO. При удалении в iNOS одновременно удлинения (C-tail) и базовой последовательности синтез NO падает на 70%. При удалении только удлинения синтез NO растет на 15%, а редуктазная активность увеличивается в 10 раз. Эти данные получены в присутствии СаМ, так как iNOS не удавалось экспрессировать без него [12, 15].

Поскольку nNOS и eNOS легко экспрессировать как со связанным СаМ, так и без него (меняя уровень концентрации Са²⁺), то можно зафиксировать влияние C-tail в обоих случаях. Для исходных нормальных ферментов связывание СаМ усиливает редуктазную активность в 10 раз для nNOS и в 3 раза для eNOS. Для мутантных форм (с удаленным C-tail) связывание СаМ, наоборот, замедляет редуктазную активность примерно на 36% для nNOS и на 46% — для eNOS. При этом в отсутствии СаМ редуктазная активность мутантных eNOS примерно в 7 раз, а nNOS — в 21 раз больше, чем редуктазная активность исходных нормальных конститутивных NOS, т.е. СаМ работает как частичный неконкурентный ингибитор редуктазной активности мутантных форм. В то же время для нормальных конститутивных форм NOS с сохраненными C-tail СаМ выступает как катализатор редуктазной активности [15, 16].

Как и в случае AI, регуляторное влияние C-tail на эффективность разных этапов синтеза NO конститутивными формами NOS имеет сложный характер [15, 16]:

в присутствии СаМ редуктазная активность (именно восстановление цитохрома С, соединенного с FMN, а не перенос электрона на гем) для мутантных и нормальных форм nNOS и eNOS примерно одинакова, удаление хвоста не имеет радикального влияния;

в отсутствие СаМ редуктазная активность обеих изоформ при удалении C-tail возрастает в 7–21 раз, но при этом скорость синтеза NO для мутантной nNOS оказывается самой низкой (возможно, из-за образования супероксида путем диссоциации комплекса гем–Fe(II)–O₂ в оксидазном домене);

C-tail вносит вклад в зависимость конститутивных форм NOS от Са²⁺, так как при наличии C-tail связывание СаМ увеличивает редуктазную активность, а при его отсутствии, наоборот, уменьшает.

Предполагается [15], что C-tail не взаимодействует непосредственно с гемовым доменом, AI и СаМ, так как эти домены находятся далеко от него. Наиболее вероятным считается, что СаМ находится на одной стороне флавиновой стенки, а C-tail покрывает другую ее сторону. При этом СаМ и C-tail модулируют поток электронов между флавинами, координируя расстояние и относительную ориентацию изоаллоксановых колец, а также регулируют поток электронов от FMN к терминальному акцептору (цитохрому С, феррицианиду или гемовому домену). Эксперименты с заменой серина на аспартат в C-tail показали, что связывание СаМ вызывает перемещение C-tail для меньшего ингибирования потока электронов, вероятнее всего, за счет сил электростатического отталкивания отрицательно заряженных остатков фосфата или аспартата.

Заключение

CaM, AI и C-tail являются основными элементами ауторегуляции NOS, модулирующими перенос электронов от флавина к гему. Связывание СаМ вызывает изменение междоменных расстояний, сдвиг и, как следствие, уменьшение ингибирующего влияния AI и C-tail [12, 15, 16]. Эффекты СаМ, по всей видимости, реализуются через формирование временных ионных и гидрофобных взаимодействий с поверхностью оксидазного домена NOS, помогающих его взаимодействию с FMN. Также СаМ сдвигает конформационное равновесие редуктазного домена в сторону более открытых конформаций, сокращает время жизни и стереометрическое распределение конформаций, ускоряя переходы между ними и поток электронов через редуктазный домен. AI, вероятно, индуцирует конформационное изменение, которое препятствует переносу электронов внутри редуктазного домена по аналогии с шарнирным доменом в цитохроме Р450 [12, 14].

C-tail совместно с СаМ модулируют поток электронов между флавинами, изменяя расстояние и относительную ориентацию изоаллоксановых колец, а также регулируют поток электронов от FMN к терминальному акцептору. Предполагаемый механизм — сдвиг C-tail и, как следствие, снижение его ингибирующего влияния на перенос электронов при связывании СаМ за счет сил электростатического отталкивания отрицательно заряженных остатков фосфата и аспартата.

Функционирование регуляторных элементов NOS требует дальнейшего изучения, которое позволит детализировать их сложный, разнонаправленный алгоритм взаимодействия. Более полное понимание механизмов ауторегуляции NO-синтаз в норме, а также при патологических состояниях необходимо для современных технологий моделирования NOS, что будет способствовать выявлению особенностей патогенеза различных социально-значимых заболеваний, повышению эффективности их диагностики и таргетной терапии.

Вклад авторов: Н.А. Попова — концепция статьи; Н.А. Попова, С.К. Соодаева, И.А. Климанов — подготовка первоначального варианта текста; В.М. Ми­шарин, А.А. Темнов — обзор и редактирование статьи.

Финансирование исследования и конфликт интересов. Исследование не финансировалось какими-либо источниками, и конфликты интересов, связанные с данным исследованием, отсутствуют.